Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Het algemene doel van deze procedure is om de mate van myofibrillaire organisatie in transparante zebravislarven te evalueren en om hun zwemafstand als reactie op tactiele stimulatie voor beide methoden te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de zebravis te laten paren en vervolgens levensvatbare eieren te verzamelen in de tweede stap van de assay voor het evalueren van de spierstructuur. Een gecoate, geanestheseerde zebravisembryo wordt direct tussen twee gepolariseerde lenzen op de tafel van een stereomicroscoop geplaatst, zodat de vis langs de laterale as van het lichaam is georiënteerd en in een zo vlak mogelijke positie ligt.

De dubbelbreking wordt vervolgens gevisualiseerd en de integriteit van de spieren wordt gekwantificeerd. In de tweede stap van de assay voor ontsnappingsreactie na aanraking wordt een enkele gecoate larve in een diepe Petrischaal geplaatst en vervolgens gecentreerd in het gezichtsveld van de stereomicroscoop. Er wordt een sensorische stimulus aan de larve toegediend door de staart met een insectenspeld aan te raken, waarna de reactie van het dier wordt gefilmd totdat het embryo stopt met zwemmen of uit het gezichtsveld zwemt.

Uiteindelijk kunnen verschillen in spierorganisatie en locomotie-responsen worden gekwantificeerd. De belangrijkste voordelen van deze niet-invasieve technieken zijn dat een groot aantal vissen snel geanalyseerd kan worden en dat defecten in de skeletspieren in dezelfde vis in vivo over meerdere dagen gevolgd kunnen worden. Visuele demonstraties van het instellen van de polarisatielensen en het positioneren van de larven in de juiste oriëntatie zijn essentieel om succes te garanderen.

Verwijder bij deze assays de niet levensvatbare eitjes uit alle verzamelde clutches van gepaarde volwassen vissen. Deze zien er met het blote oog over het algemeen wit en ondoorzichtig uit, of verschijnen onder de microscoop als een cluster van donkere, ongeorganiseerde cellen. Plaats de embryo's drie tot zeven dagen na bevruchting terug in de incubator voor verdere groei. Indien het betreffende embryo in zijn chorion blijft, gebruik dan een scherp pincet om voorzichtig een scheurtje in het chorion van het embryo te maken en draai het vervolgens om zodat het embryo eruit valt.

Anestheseer de gecoate embryo's met trica om hun correcte positionering te vergemakkelijken en rust vervolgens een dissectiemicroscoop uit met een polarisatielens die kan worden gedraaid om de hoek van het gepolariseerde licht aan te passen. Zodra de embryo's zich hebben gestrekt, wordt een tweede polarisatielens op de objecttafel van de microscoop geplaatst, direct onder de bovenste lens, waarna de embryo's direct op de tweede lens worden geplaatst. Elk embryo van belang moet vervolgens zodanig worden gepositioneerd dat de laterale as van het lichaam is uitgelijnd.

Draai de bovenste lens terwijl het embryo van belang in beeld is, totdat de polarisatieassen van de twee lenzen 90 graden ten opzichte van elkaar staan en de achtergrond volledig donker is. Verplaats de vis om er zeker van te zijn dat deze zo plat mogelijk ligt. Als een vis gekromd is, zullen alleen de segmenten met een vlakke oriëntatie het gepolariseerde licht doorlaten en bijfrt vertonen.

Observe nu het bi frt-fenotype van de wildtype vis. Hooggeorganiseerde skeletspieren vertonen een heldere by frt, aangezien de brekingsindex voor het licht parallel aan de myofilamenten hoger is dan voor het gepolariseerde licht loodrecht op deze structuren. Vissen met gedesorganiseerde skeletspieren, wat wijst op een neurodegeneratieve myopathie of een ontwikkelingsdefect, vertonen doorgaans een algemene afname in dubreking bij vissen met gedesorganiseerde skeletspieren.

Kenmerkend voor spierdystrofie. Meestal is er een vlekkerig patroon van dubbele breking zichtbaar, waarbij donkere gebieden spierdegeneratie vertegenwoordigen te midden van heldere gebieden met een normale spierarchitectuur. Leg beelden van de vis vast onder gepolariseerd licht voor kwantificering van de dubbele breking.

Sla de afbeeldingen op als tiff-bestanden. Open de birefringentie-afbeeldingen in een softwareprogramma voor beeldbewerking. Als u ImageJ gebruikt zoals hier getoond, gebruik dan voor elke afbeelding eerst de tool voor polygoonselecties om een lijn rond het lichaam van de vis te trekken om het gebied van de zebravismuskel voor meting vast te stellen.

Kies vervolgens in het vervolgkeuzemenu 'analyze' de optie 'set measurements' om de vereiste statistieken voor de afbeelding te selecteren. Vink de vakjes aan voor 'area mean gray value' en 'min and max gray value' om de assay voor aanrakingsgeïnduceerd ontsnappingsgedrag twee tot zeven dagen na bevruchting in te stellen. Plaats de gecoate vissen van interesse individueel in diepe Petrischalen, waarbij u slechts met één embryo tegelijk werkt.

Centreer de vis in het gezichtsveld van een stereomicroscoop die is uitgerust met een digitaal camerasysteem en begin met sequentiële beeldvorming met een framerate van 30 hertz of hoger. Raak vervolgens met een insectennaald de staart van het embryo aan om de meno-sensorische stimulus toe te dienen, en stop de beeldvorming wanneer het embryo is gestopt met zwemmen of uit het gezichtsveld is gezwommen. Zet tot slot de sequentiële beelden om in een videobestand of analyseer de individuele frames van de time-lapse-beelden.

Offline dubbelbreking kan worden gebruikt als een efficiënte, niet-invasieve analyse om inzicht te krijgen in de staat van de myofibrillaire organisatie in levende zebravissenembryo's; wild-type zebravissen vijf dagen na bevruchting vertonen onder gepolariseerd licht sterk dubbelbrekende skeletspieren vanwege hun geordende array van myofilamenten. In tegenstelling hiermee vertonen embryo's van dezelfde leeftijd die homozygoot zijn voor een pathogene mutatie in het dystroglycaan- of DAG1-gen vlekkerige dubbelbreking, wat wijst op gebieden met spierdegeneratie. Dit vlekkerige patroon en de snelle progressie van spierdegeneratie gedurende de vroege ontwikkeling zijn consistent met andere dystrofe vismodellen.

Kwantificering van de dubbelbreking van dystrofische DAG1-mutanten vijf dagen na bevruchting identificeert een significante afname in helderheid tot 27,9 ± 5,3% van de maximale dubbelbreking waargenomen bij hun wildtype-broeders. Deze afname is ernstiger dan de afname tot 52,4 ± 5,5% die werd waargenomen bij myopathische mtm1-morfenen drie dagen na bevruchting. Myopathische vismodellen vertonen in plaats daarvan over het algemeen een afname in dubbelbreking vergeleken met het wildtype, aangezien er vaak myofibrillaire desorganisatie is in de belangrijkste axiale skeletspieren, maar geen bewijs voor degeneratieve veranderingen. Focusgedrag bij aanraking kan worden gebruikt om aan te tonen dat zebravismodellen voor skeletspierziekten locomotiedefecten en zwemproblemen vertonen.

Deze eerste video toont een assay voor door aanraking opgewekt ontsnappingsgedrag bij wild-type zebravissen. Let op hoe de normale larven vijf dagen na bevruchting zeer snel wegzwemmen. In de tweede video is het door aanraking opgewekte ontsnappingsgedrag vastgelegd bij larven op dag één.

Let op hoe mutante embryo's vijf dagen na fertilisatie een verminderde reactie op aanraking vertonen en het gezichtsveld niet verlaten na stimulatie. De video's werden vervolgens frame voor frame geanalyseerd om te bevestigen dat DAG one-mutanten een verminderde beweging vertonen in vergelijking met wildtype-controles als reactie op tactiele stimuli. De afstanden die beide typen embryo's konden afleggen binnen een vast tijdsinterval werden gemiddeld en wijzen op een verminderde motorische functie bij DAG one-mutanten.

Zodra deze technieken onder de knie zijn, kunnen ze in korte tijd op grote hoeveelheden vissen worden uitgevoerd, wat cruciaal is bij het uitvoeren van high-throughput chemische screenings of mutagenese-screens. Na deze procedure kunnen invasievere benaderingen, zoals immunohistochemie of elektronenmicroscopie, worden toegepast om defecten in de skeletspieren op moleculair en structureel niveau te onderzoeken.