Name: Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer birefringentie- en touch-evoked escape response-assays om skeletspierdefecten te analyseren bij Danio rerio-larven. Deze niet-invasieve methoden kwantificeren myofibrillaire organisatie en locomotiegedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Behzad Moghadaszadeh voor zijn geweldige hulp bij de kwantificering van birefringentie-afbeeldingen. Dit werk werd gefinancierd door de Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) en het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), evenals genereuze steun van A Foundation Building Strength, Cure CMD en de AUism Charitable Foundation. VAG wordt ondersteund door K01 AR062601 van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, en LLS wordt ondersteund door F31 NS081928 van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

1. In vivo Analyse van de skeletspierstructuur door Birefringence
<ol>
	<li>Bereid kweekkooien voor door de mannetjes(s) van de vrouwtjes van de gewenste zebravislijn(en) te scheiden laat in de namiddag na het voeren.
	<ol>
		<li>Onderscheid vrouwtjes door hun grotere buik en lichte blauwe/witte kleuren, en mannetjes door hun slanke lichaamsvorm en roze/gele tinten.</li>
		<li>Succes met paarsgewijze kruisingen (één mannetje en één vrouwtje) kan slechts ongeveer 50% zijn. Voor een hoger succespercentage, kruist u één mannetje met 2-3 vrouwtjes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwijder de kooiverdelers de volgende ochtend kort na het begin van het licht en laat de vissen ongestoord paaien.</li>
	<li>Verzamel de eieren met een zeef wanneer voldoende bevruchte eieren op de bodem van de tank zijn gelegd.</li>
	<li>Breng de embryo's over in een diepe petrischaal door de zeef te spoelen met viswater en plaats de oudervissen terug in hun tanks. Plaats schalen met embryo's in een 28,5 °C incubator.</li>
	<li>Verwijder de onlevensvatbare eieren en puin later die dag of de volgende ochtend, en plaats de embryo's terug in de incubator voor verdere groei.</li>
	<li>Embryo's/larven bereiken de juiste leeftijd om birefringence waar te nemen op 3-7 dagen na bevruchting (dpf), omdat resultaten vóór 3 dpf mogelijk lijden aan beperkte contrast. Wilde-type embryo's komen tussen 48-60 uur na bevruchting (hpf) uit hun chorion, gevolgd door een rechttrekken van de lichaamsas. Laat uitkomende wilde-type of mutante embryo's kunnen manuele dechorionatie vereisen.
	<ol>
		<li>Maak voorzichtig een scheur in het chorion met scherpe pincetten en draai het ondersteboven zodat het embryo eruit valt.</li>
		<li>Laat dechorioneerde embryo's rechttrekken voordat u met de test begint.</li>
		<li>Verdoof embryo's met tricaine (0,04% in viswater) om te helpen bij hun juiste positionering.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plaats een dissectiemicroscoop met een gepolariseerd lens dat geroteerd kan worden om de hoek van gepolariseerd licht aan te passen (Figuur 1A).</li>
	<li>Plaats dechorioneerde, verdoofde embryo's direct bovenop een tweede gepolariseerde lens langs de laterale as van het lichaam. De tweede lens moet onder de bovenste lens worden geplaatst, op het microscoopplatform (Figuur 1B). Gebruik op geen enkele manier plastic petrischalen tijdens de birefringence test, omdat plastic niet geschikt is voor de transmissie van gebroken licht.</li>
	<li>Draai de bovenste lens met het embryo van belang in zicht totdat de polarisatieassen van de twee lenzen op 90° van elkaar zijn gepositioneerd en de achtergrond volledig donker is.</li>
	<li>De optimale output van de test is afhankelijk van de oriëntatie van de vissen tussen twee gepolariseerde lenzen. Beweeg de vissen rond om ervoor te zorgen dat ze zo plat mogelijk liggen.
	<ol>
		<li>Als de vis gebogen is, zullen alleen de segmenten met deze platte oriëntatie het gepolariseerde licht passeren en birefringence vertonen. Meet in dergelijke gevallen de birefringence in de platte gebieden en noteer de birefringence van het overeenkomstige gebied in de wilde-type vis (bijv. somieten 1-10 in zowel wilde-type als mutante vissen).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observeer het birefringente fenotype van de vis.
	<ol>
		<li>Wilde-type vissen met hoog georganiseerde skeletspieren tonen heldere birefringence, omdat de brekingsindex voor het licht parallel aan de myofilamenten hoger is dan het gepolariseerde licht loodrecht op deze structuren.</li>
		<li>Vissen met disgeorganiseerde skeletspieren die suggereren op een niet-degeneratieve myopathie of een ontwikkelingsdefect, tonen doorgaans een algemene vermindering in birefringence.</li>
		<li>Vissen met disgeorganiseerde skeletspieren kenmerkend voor een spierdystrofie vertonen vaak een vlek-achtig patroon van birefringence, met donkere gebieden die spierdegeneratie vertegenwoordigen tussen heldere gebieden van normale spierarchitectuur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantificeer birefringence door afbeeldingen van wilde-type en mutante vissen te maken onder gepolariseerd licht met dezelfde belichtingsinstellingen en vergroting. Sla afbeeldingen op als.tiff-bestanden.
	<ol>
		<li>Open birefringence afbeeldingen in ImageJ software (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Selecteer voor elke afbeelding het gebied van de zebravisspier door een lijn rond het lichaam te tekenen met de optie “Polygon Selecties” uit de werkbalk.</li>
		<li>Gebruik “Set Measurements” onder het “Analyze” drop-down menu om de vereiste statistieken voor de afbeelding te selecteren.
		<ol>
			<li>Minimale selectie vereist dat de vakken voor “Area,” “Mean gray value,” en “Min & max gray value” zijn aangevinkt.</li>
			<li>Een maximale grijze waarde van >255 geeft pixelsaturatie aan. Gebruik daarom afbeeldingen met maximale grijze waarden minder dan 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normaliseer de gemiddelde intensiteit met het geselecteerde gebied en herhaal deze kwantificeringsprocedure voor elke birefringence afbeelding.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Touch-evoked Escape Gedrag Assay
<ol>
	<li>Stel kweekparen van de geschikte zebravislijn(en) op en verzamel embryo's zoals beschreven in stappen 1.1-1.5 hierboven.</li>
	<li>Plaats dechorioneerde embryo's/larven op 2-7 dagen na bevruchting afzonderlijk in een diepe petrischaal of

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Primaire neuromusculaire aandoeningen worden traditioneel geclassificeerd als dystrofische of non-dystrofische processen. Spierdystrofieën worden gekenmerkt door myofiber-degeneratie gevolgd door herhaalde rondes van regeneratie, wat uiteindelijk leidt tot een eindfaseproces gekenmerkt door fibrose en vervanging door vetweefsel14. Non-dystrofisch myopathieën daarentegen worden niet geassocieerd met necrose of regeneratieve veranderingen, maar resulteren wel in ongeorganiseerde myofibers en algehele skeletspier...

<table><tbody><tr><td>Tricaine </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Insectenpin</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Gepolariseerde lenzen</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>Isotemp Incubator Model 630D</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Advanced</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebravissen (Danio rerio) zijn een bijzonder effectief instrument geworden voor het modelleren van menselijke ziekten die spierweefsel aantasten, waaronder spierdystrofieën1-3, aangeboren myopathieën4,5 en verstoringen in sarcomeersamenstelling6,7, vanwege de hoge genomische en structurele overeenkomsten met zoogdieren8. Spierdisorganisatie en voortbewegingsproblemen kunnen in de zebravis snel worden beoordeeld in de eerste paar dagen na de bevruchting. Twee tests om skeletspierdefecten bij zebravissen te karakteriseren zijn birefringentie (structureel) en de tastreactie op ontsnapping (gedrag). 
Birefringentie is een fysische eigenschap waarbij licht wordt geroteerd wanneer het door geordende materie passeert, zoals de pseudo-kristallijne opstelling van spiersarcomeren9. Het is een eenvoudige, niet-invasieve benadering om de integriteit van spieren bij doorzichtige zebravislarven vroeg in de ontwikkeling te beoordelen. Wilde zebravissen met hoog georganiseerd skeletspierweefsel lijken zeer helder op een donkere achtergrond wanneer ze tussen twee gepolariseerde lichtfilters worden bekeken, terwijl spiermutanten birefringentiepatronen hebben die specifiek zijn voor de primaire spierziekte die ze modelleren. Zebravissen die spierdystrofieën modelleren, ziekten die worden gekenmerkt door degeneratie van myofibers gevolgd door herhaalde rondes regeneratie, vertonen degeneratieve donkere vlekken in het skeletspierweefsel onder gepolariseerd licht. Niet-dystrofische myopathieën worden niet geassocieerd met necrose of regeneratieve veranderingen, maar resulteren in gedesorganiseerde myofibers en zwakte van het skeletspierweefsel. Myopathische zebravissen vertonen doorgaans een algemene vermindering van birefringentie, wat de desorganisatie van sarcomeren weerspiegelt.
De tastreactie op ontsnapping test omvat het observeren van het zwemgedrag van een embryo als reactie op taststimulatie10-12. In vergelijking met wildtype-larven vertonen mutante larven vaak een zwakke ontsnappingscontractie, gevolgd door langzaam zwemmen of een andere vorm van verminderde beweging die de larve niet meer dan een korte afstand voortstuwt12. Het voordeel van deze tests is dat de ziekteprogressie bij hetzelfde vistype gedurende meerdere dagen in vivo kan worden gemonitord en dat grote aantallen vissen in een korte tijd kunnen worden geanalyseerd in vergelijking met hogere gewervelden.

Birefringentie kan worden gebruikt als een efficiënte, niet-invasieve assay om inzicht te krijgen in de staat van de myofibrillaire organisatie in levende zebravisembryo's. Er worden voorbeelden gepresenteerd van wild-type zebravisen, evenals zebravisen met een verminderde expressie van genen die kritiek zijn voor de ontwikkeling en functie van de skeletspieren. Wild-type zebravisen op 5 dpf vertonen onder gepolariseerd licht sterk birefringente skeletspieren als gevolg van de geordende opstelling van myofilamenten (<str...

De zebravis is nu een gevestigde en krachtige tool voor het modelleren van musculaire dystrofieën, aangeboren myopathieën en gerelateerde neuromusculaire ziekten. Tweekleurigheid en door aanraking veroorzaakt ontsnappingsgedrag zijn twee veelvoorkomende niet-invasieve tests die worden gebruikt om de mate van musculaire desorganisatie en bewegingsbeperking van zebravisembryo's tijdens de vroege ontwikkeling te bepalen.

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mate van myofibrillaire organisatie in transparante zebravislarven te evalueren en om hun zwemafstand als reactie op tactiele stimulatie voor beide methoden te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de zebravis te laten paren en vervolgens levensvatbare eieren te verzamelen in de tweede stap van de assay voor het evalueren van de spierstructuur. Een gecoate, geanestheseerde zebravisembryo wordt direct tussen twee gepolariseerde lenzen op de tafel van een stereomicroscoop geplaatst, zodat de vis langs de laterale as van het lichaam is georiënteerd en in een zo vlak mogelijke positie ligt.De dubbelbreking wordt vervolgens gevisualiseerd en de integriteit van de spieren wordt gekwantificeerd. In de tweede stap van de assay voor ontsnappingsreactie na aanraking wordt een enkele gecoate larve in een diepe Petrischaal geplaatst en vervolgens gecentreerd in het gezichtsveld van de stereomicroscoop. Er wordt een sensorische stimulus aan de larve toegediend door de staart met een insectenspeld aan te raken, waarna de reactie van het dier wordt gefilmd totdat het embryo stopt met zwemmen of uit het gezichtsveld zwemt.Uiteindelijk kunnen verschillen in spierorganisatie en locomotie-responsen worden gekwantificeerd. De belangrijkste voordelen van deze niet-invasieve technieken zijn dat een groot aantal vissen snel geanalyseerd kan worden en dat defecten in de skeletspieren in dezelfde vis in vivo over meerdere dagen gevolgd kunnen worden. Visuele demonstraties van het instellen van de polarisatielensen en het positioneren van de larven in de juiste oriëntatie zijn essentieel om succes te garanderen.Verwijder bij deze assays de niet levensvatbare eitjes uit alle verzamelde clutches van gepaarde volwassen vissen. Deze zien er met het blote oog over het algemeen wit en ondoorzichtig uit, of verschijnen onder de microscoop als een cluster van donkere, ongeorganiseerde cellen. Plaats de embryo's drie tot zeven dagen na bevruchting terug in de incubator voor verdere groei. Indien het betreffende embryo in zijn chorion blijft, gebruik dan een scherp pincet om voorzichtig een scheurtje in het chorion van het embryo te maken en draai het vervolgens om zodat het embryo eruit valt.Anestheseer de gecoate embryo's met trica om hun correcte positionering te vergemakkelijken en rust vervolgens een dissectiemicroscoop uit met een polarisatielens die kan worden gedraaid om de hoek van het gepolariseerde licht aan te passen. Zodra de embryo's zich hebben gestrekt, wordt een tweede polarisatielens op de objecttafel van de microscoop geplaatst, direct onder de bovenste lens, waarna de embryo's direct op de tweede lens worden geplaatst. Elk embryo van belang moet vervolgens zodanig worden gepositioneerd dat de laterale as van het lichaam is uitgelijnd.Draai de bovenste lens terwijl het embryo van belang in beeld is, totdat de polarisatieassen van de twee lenzen 90 graden ten opzichte van elkaar staan en de achtergrond volledig donker is. Verplaats de vis om er zeker van te zijn dat deze zo plat mogelijk ligt. Als een vis gekromd is, zullen alleen de segmenten met een vlakke oriëntatie het gepolariseerde licht doorlaten en bijfrt vertonen.Observe nu het bi frt-fenotype van de wildtype vis. Hooggeorganiseerde skeletspieren vertonen een heldere by frt, aangezien de brekingsindex voor het licht parallel aan de myofilamenten hoger is dan voor het gepolariseerde licht loodrecht op deze structuren. Vissen met gedesorganiseerde skeletspieren, wat wijst op een neurodegeneratieve myopathie of een ontwikkelingsdefect, vertonen doorgaans een algemene afname in dubreking bij vissen met gedesorganiseerde skeletspieren.Kenmerkend voor spierdystrofie. Meestal is er een vlekkerig patroon van dubbele breking zichtbaar, waarbij donkere gebieden spierdegeneratie vertegenwoordigen te midden van heldere gebieden met een normale spierarchitectuur. Leg beelden van de vis vast onder gepolariseerd licht voor kwantificering van de dubbele breking.Sla de afbeeldingen op als tiff-bestanden. Open de birefringentie-afbeeldingen in een softwareprogramma voor beeldbewerking. Als u ImageJ gebruikt zoals hier getoond, gebruik dan voor elke afbeelding eerst de tool voor polygoonselecties om een lijn rond het lichaam van de vis te trekken om het gebied van de zebravismuskel voor meting vast te stellen.Kies vervolgens in het vervolgkeuzemenu 'analyze' de optie 'set measurements' om de vereiste statistieken voor de afbeelding te selecteren. Vink de vakjes aan voor 'area mean gray value' en 'min and max gray value' om de assay voor aanrakingsgeïnduceerd ontsnappingsgedrag twee tot zeven dagen na bevruchting in te stellen. Plaats de gecoate vissen van interesse individueel in diepe Petrischalen, waarbij u slechts met één embryo tegelijk werkt.Centreer de vis in het gezichtsveld van een stereomicroscoop die is uitgerust met een digitaal camerasysteem en begin met sequentiële beeldvorming met een framerate van 30 hertz of hoger. Raak vervolgens met een insectennaald de staart van het embryo aan om de meno-sensorische stimulus toe te dienen, en stop de beeldvorming wanneer het embryo is gestopt met zwemmen of uit het gezichtsveld is gezwommen. Zet tot slot de sequentiële beelden om in een videobestand of analyseer de individuele frames van de time-lapse-beelden.Offline dubbelbreking kan worden gebruikt als een efficiënte, niet-invasieve analyse om inzicht te krijgen in de staat van de myofibrillaire organisatie in levende zebravissenembryo's; wild-type zebravissen vijf dagen na bevruchting vertonen onder gepolariseerd licht sterk dubbelbrekende skeletspieren vanwege hun geordende array van myofilamenten. In tegenstelling hiermee vertonen embryo's van dezelfde leeftijd die homozygoot zijn voor een pathogene mutatie in het dystroglycaan- of DAG1-gen vlekkerige dubbelbreking, wat wijst op gebieden met spierdegeneratie. Dit vlekkerige patroon en de snelle progressie van spierdegeneratie gedurende de vroege ontwikkeling zijn consistent met andere dystrofe vismodellen.Kwantificering van de dubbelbreking van dystrofische DAG1-mutanten vijf dagen na bevruchting identificeert een significante afname in helderheid tot 27,9 ± 5,3% van de maximale dubbelbreking waargenomen bij hun wildtype-broeders. Deze afname is ernstiger dan de afname tot 52,4 ± 5,5% die werd waargenomen bij myopathische mtm1-morfenen drie dagen na bevruchting. Myopathische vismodellen vertonen in plaats daarvan over het algemeen een afname in dubbelbreking vergeleken met het wildtype, aangezien er vaak myofibrillaire desorganisatie is in de belangrijkste axiale skeletspieren, maar geen bewijs voor degeneratieve veranderingen. Focusgedrag bij aanraking kan worden gebruikt om aan te tonen dat zebravismodellen voor skeletspierziekten locomotiedefecten en zwemproblemen vertonen.Deze eerste video toont een assay voor door aanraking opgewekt ontsnappingsgedrag bij wild-type zebravissen. Let op hoe de normale larven vijf dagen na bevruchting zeer snel wegzwemmen. In de tweede video is het door aanraking opgewekte ontsnappingsgedrag vastgelegd bij larven op dag één.Let op hoe mutante embryo's vijf dagen na fertilisatie een verminderde reactie op aanraking vertonen en het gezichtsveld niet verlaten na stimulatie. De video's werden vervolgens frame voor frame geanalyseerd om te bevestigen dat DAG one-mutanten een verminderde beweging vertonen in vergelijking met wildtype-controles als reactie op tactiele stimuli. De afstanden die beide typen embryo's konden afleggen binnen een vast tijdsinterval werden gemiddeld en wijzen op een verminderde motorische functie bij DAG one-mutanten.Zodra deze technieken onder de knie zijn, kunnen ze in korte tijd op grote hoeveelheden vissen worden uitgevoerd, wat cruciaal is bij het uitvoeren van high-throughput chemische screenings of mutagenese-screens. Na deze procedure kunnen invasievere benaderingen, zoals immunohistochemie of elektronenmicroscopie, worden toegepast om defecten in de skeletspieren op moleculair en structureel niveau te onderzoeken.

analysis-skeletal-muscle-defects-larval-zebrafish-birefringence-touch

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birefferingen en touch-evoke escape response-tests

Deze video beschrijft de touch-evoke responstest, die de reactie van de zebravislarve op aanraakprikkels meet.

Escape Response Assay: een methode om de reactie van zebravislarven te bestuderen om stimuli aan te raken

De video beschrijft de vermijding en thigmotaxis-test van zebravislarven. De video onderzoekt het gedrag van zebravislarven als reactie op visuele aversieve stimulus.

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

Krachtmetingen kunnen worden om veranderingen in spierfunctie gevolg van ontwikkeling, verwonding, ziekte, behandeling of chemische toxiciteit tonen. In deze video, tonen we een methode om kracht te meten tijdens een maximale contractie van de zebravis larven romp spieren.

Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

We presenteren een methode voor de elektroretinografische (ERG) analyse van zebravislarven met behulp van micromanipulatie en elektroretinografietechnieken. Dit is een eenvoudige en duidelijke methode voor het testen van de visuele functie van zebravislarven in vivo.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Zebravissen zijn een uitstekend model om spierfunctie en ziekte te bestuderen. Tijdens de vroege embryogenese beginnen zebravissen met regelmatige spiercontracties die een ritmisch zwemgedrag produceren, dat verandert wanneer de spier wordt verstoord. Hier beschrijven we een door aanraking veroorzaakte reactie en een locatiemeting om zwemprestaties te onderzoeken als maatstaf voor spierfunctie.

Met behulp van Touch-opgeroepen Response en Locomotion Testen om Muscle Prestaties en functie in zebravis Assess

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Leer birefringentie- en touch-evoked escape response-assays om skeletspierdefecten te analyseren bij Danio rerio-larven. Deze niet-invasieve methoden kwantificeren myofibrillaire organisatie en locomotiegedrag.

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Meer video's verkennen