Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van rekletsel als model voor traumatisch hersenletsel te demonstreen. Dit wordt bereikt door eerst microvasculaire endotheelcellen te kweken in putjes met flexibele bodems. De tweede stap is om de cellen te differentiëren door de hoeveelheid kalfsserum in het kweekmedium te reduceren.

Vervolgens worden de cellen beschadigd met behulp van het cell stretcher-apparaat. De laatste stap is het beoordelen van de mate van beschadiging in de cellen. Uiteindelijk wordt door rek veroorzaakte beschadiging in cerebrale endotheelcellen gebruikt om beschadiging van de bloed-hersenbarrière in vitro aan te tonen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie voor traumatisch hersenletsel, omdat het de werkelijke impact die tijdens TBI optreedt in de bloed-hersenbarrière modelleert met behulp van rekschade aan cerebrale endotheelcellen van zeedieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Elaine Salvador, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door de cerebrale microvasculaire endotheelcellen van zeedieren te kweken in een T 75 kweekfles.

Vervang het medium twee keer per week tot de confluentie is bereikt. Was vervolgens de cellen met PBS. Verwijder daarna het PBS en de trypsine.

Analyseer de cellen met twee milliliters warme trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende vijf minuten of totdat de cellaag is gedispergeerd. Voeg daarna acht milliliters kweekmedium toe aan de cellen en tik meerdere keren tegen de fles om de cellen los te maken.

Bekijk de cellen onder de microscoop om volledige loskoppeling van de kolf te bevestigen. Pipetteer vervolgens het medium met de losgekoppelde cellen meerdere keren op en neer. Draai daarna met de kolf om de celsuspensie te mengen.

Voeg 20 µL van de cel-suspensie toe aan een hemocytometer en tel het aantal cellen. Bepaal de celdichtheid en zorg voor 20 000 cellen per vierkante centimeter in de well. Breng vervolgens de cel-suspensie over naar collageen.

Vul zes voorgecodeerde kweekplaten met flexibele bodems met een totaalvolume van 3 mL per well. Vervang het kweekmedium twee keer per week en kweek de cellen gedurende één week bij 37 °C tot ze confluent zijn.

Voor celdifferentiatie wordt het kweekmedium van de cellen vervangen door differentiatiemedium en worden de cellen gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 °C. Schakel bij deze procedure het apparaat voor celbeschadigingscontrole in en stel de vertraging in op 50 ms. Stel vervolgens de regulatordruk in op 15 PSI en bedien de trigger enkele keren totdat de geregistreerde piekdruk stabiel is.

Stel vervolgens de druk van de regulator in op de gewenste waarde. Plaats daarna de cultuurplaat met flexibele bodems van zes putjes in de houder van het plateau. Controleer of de putselector is ingesteld op de juiste putgrootte.

Plaats vervolgens de adapterplug stevig over de, nou, houd de plug met één hand stevig op zijn plaats terwijl u met de andere hand de trekker indrukt en registreer daarna de gegenereerde piekdruk. Plaats de plaat onmiddellijk terug in de incubator van 37 °C voor de gewenste tijd, of gebruik deze direct voor daaropvolgende experimenten of evaluatie om de rekletsel te beoordelen via een DI-opname-assay. Voeg onmiddellijk nadat de cellen zijn gerekt 30 µL van 1 mg/mL van de levensvatbaarheidsstof, die dient als cytotoxiciteitsmarker, toe aan het celkweekmedium.

Om de rekletsel te beoordelen aan de hand van de afgifte van lactaatdehydrogenase. Verwijder na het rekken onmiddellijk 200 µL celkweekmedium uit de well; doe hetzelfde voor elk tijdstip na het letsel dat u in uw onderzoek naar LDH-afgifte wilt opnemen. Centrifugeer vervolgens het celkweekmedium vijf minuten op de hoogste stand van een microcentrifuge.

Verwijder het supernatant om celdebris te elimineren en gebruik dit voor de volgende stappen. Zodra de benodigde monsters van verschillende tijdstippen zijn afgenomen, lys de cellen met de lysisoplossing die bij de LDH-assaykit is meegeleverd. Voeg daarna 100 microliters van het assaymedium uit de kit toe aan elke put van de meegeleverde 96-wellplaat.

Voeg vervolgens 100 µL van het celvrije celkweekmedium toe aan twee parallelle putjes van de 96-wells plaat, incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en meet de absorbantie bij 492 nm. Hier wordt het lichtmicroscopisch onderzoek van normale versus beschadigde cellen getoond.

De normale, niet-uitgerekte confluente cellaag is dicht op elkaar gepakt en langwerpig; wanneer cellen worden uitgerekt door een maximale drukpuls van 1,8 tot 2,0 PSI toe te passen, lijken ze minder compact. Wanneer de cellen matig beschadigd worden met een maximale drukpuls van 2,5 tot 3,0, lijken sommige van hen gezwollen en gedeformeerd. De cellen trekken samen bij een ernstige uitrekking van 3,5 tot 4,5 PSI.

Hier is het fluorescentiemicroscopisch onderzoek van normale cellen tegenover beschadigde cellen. De cellen werden twee uur na de beschadiging behandeld met een kleuring voor levensvatbaarheid. Dit zijn de ongestrekte controlecellen, de matig gestrekte cellen en de zwaar gestrekte cellen.

Deze figuur toont de LDH-enzymvrijgave in het medium na rekletsel; de LDH-vrijgave in het kweekmedium werd gemeten op verschillende tijdsintervallen na rek-geïnduceerd letsel en werd uitgedrukt als een percentage van de totale vrijmaakbare LDH die werd vrijgegeven uit cellen die waren blootgesteld aan lage en matige rek. Deze verschilden niet significant van die van de niet-gerekte controles en van elkaar.

Cellen die sterk waren uitgerekt, lieten een significant grotere hoeveelheid LDH vrij in vergelijking met alle andere monsters, behalve het matig uitgerekte monster één uur na de ontwikkeling ervan. Deze techniek maakte het mogelijk voor onderzoekers in het veld van de neurobiologie om traumatisch hersenletsel in mariene cerebrale endotheelcellen in vitro te bestuderen.