Name: Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een In Vitro Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Ontdek hoe je traumatisch hersenletsel in vitro modelleert met rekverwonding op hersenmicrovasculaire endotheelcellen. Deze techniek simuleert TBI-effecten op de bloed-hersenbarrière voor therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, de Duitse Research Foundation) onder licentienummer FO 315/4- en de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. HEALTH-F2-2009-241778 om CF.

1. Zaaien van endotheelcellen in Well Plates <ol><li> Cultiveren murine brein microvasculaire endotheelcellen (CEND) in T75 kolf, waarbij het medium (DMEM met 10% FCS, 50 U / ml penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine) tweemaal per week, tot confluentie bereikt. (Voor de opwekking en immortalisatie van de hersenen microvasculaire endotheelcellen, zie Burek et al., 2012;. Förster et al., 2005 21,19.). </li><li> Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en trypsinize de cellen met 2 ml warm trypsine-EDTA-oplossing. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat de cellaag wordt gedispergeerd. </li><li> Voeg 8 ml kweekmedium in de cellen. Tik op de kolf meerdere keren om de cellen los. </li><li> Bekijk cellen onder de microscoop om volledige onthechting zorgen uit fles. </li><li> Pipet medium met vrijstaande cellen op en neer. Swirl de kolf aan de cel suspensi mengenop. </li><li> Neem 20 pi van de celsuspensie, zet in een hemocytometer en tel het aantal cellen. </li><li> Bepaal de celdichtheid zaad 20.000 cellen / cm 2 in de put. </li><li> Breng de celsuspensie in collagen1 geprecoat 6 putjes flexibele bodem kweekplaten (57,75 cm2) in een totaal volume van 3 ml / putje. Elke well heeft een oppervlakte van 9,62 cm 2. </li><li> Groeien de cellen bij 37 ° C gedurende een week tot confluent. Wijzig het kweekmedium twee keer per week. </li></ol> 2. Celdifferentiatie Voorafgaand aan Stretch-veroorzaakte letsel <ol><li> Verander het kweekmedium van de cellen met differentiatie medium (DMEM dat 1% serum-gestript foetaal kalfsserum (ssFCS), 50 U / ml penicilline / streptomycine). </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li></ol> 3. Stretch-veroorzaakte letsel van endotheelcellen <ol><li> Schakel de celschade controller apparaat. </li><li> Stel de vertraging tot 50 msec. </li><li> Stel de regelaar druk tot 15 psi en druk op de trekker een paar keer totdat het geregistreerde piekdruk wordt stabiel. </li><li> Stel de drukregelaar op de gewenste waarde. Gebruik tabel 1 als leidraad voor het genereren van verschillende gradaties van stretch letsel. </li><li> Plaats de 6-well flexibele bodem kweekplaat (57,75 cm 2) in de houder lade. Zorg ervoor dat het goed staat ingesteld op de juiste goed formaat (dwz grote goed). </li><li> Plaats de stekker van de adapter stevig over de put. Houd de stekker stevig vast met een hand terwijl de andere hand duwt de trekker. </li><li> Noteer de piekdruk gegenereerd. </li><li> Onmiddellijk zette de plaat terug in de 37 ° C incubator voor de gewenste lengte van de tijd of onmiddellijk te gebruiken voor het slagen experimenten of evaluatie. </li></ol> 4. Beoordeling van Stretch Letsel door Dye Opname Assay <ol><li> Onmiddellijk nadat de cellen waren strgeëtst (stap 3.7), voeg 30 ul van een 1 mg / ml oplossing van de levensvatbaarheid vlek, dat fungeert als een marker cytotoxiciteit (gelieve zie aanvullende tabel van materialen en apparatuur) om de celkweek medium (Let op: 10 ul van de kleurstof oplossing wordt gebruikt voor elk ml celkweekmedium). </li><li> Na toevoeging van de kleurstof aan de cellen onmiddellijk bekijken onder een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 5. Beoordeling van Stretch Letsel door lactaatdehydrogenase (LDH) Releasedatum <ol><li> Onmiddellijk na het strekken van de cellen (stap 3.7), verwijder 200 pi celkweekmedium uit de put. Doe hetzelfde voor elk tijdstip na het letsel dat u wilt opnemen in uw onderzoek van LDH-afgifte (dwz bv 30 min, 1 uur, 2 uur, enz.) </li><li> Centrifugeer het celkweekmedium in de hoogste stand van een microcentrifuge gedurende 5 minuten om alle celresten te verwijderen. Verwijder de bovenstaande vloeistof en gebruik dit voor de volgende stappen. </li><li> Zodra je have afgewerkt stap 5.1 en de nodige monsters u zou willen hebben uit de diverse tijdstippen dat u wilt onderzoeken, lyseren van de cellen met behulp van de lysisoplossing opgenomen in het LDH assay kit (zie aanvullende tabel van materialen en apparatuur) hebben genomen. </li><li> Plaats 100 pl van het testmedium in de assay kitto elk putje van een 96-wells plaat die in de kit. </li><li> Plaats 100 pi van het celvrije celkweekmedium in twee parallelle putjes van een 96-wells plaat in de testkit. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Lees de absorptie bij 492 nm. </li></ol>

<ol><li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+traumatic+brain+injuries%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li>
<li>Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li>
<li>Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li>
<li>Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li>
<li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alterations+in+%5BCa2%2B%5Di+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia%3A+an+in+vitro+model+for+neural+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li>
<li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li>
<li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture%3A+characterization+of+the+model+using+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal%2C+glial+and+endothelia+cells+%28Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li>
<li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li>
<li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+voltage-dependent+Mg2%2B+blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li>
<li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li>
<li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li>
<li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells%3A+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li>
<li>Förster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li>
<li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li>
<li>Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li>
<li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li>
<li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li>
<li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat%3A+Part+2%3A+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De effecten van mechanische schade in vitro bestudeerd en methoden zijn vastgesteld voor astrocyten, neuronen, gliacellen en endotheelcellen 8, 9, 22. Er is echter tot op heden in vitro model van stretch schade in gekweekte endotheelcellen hersenen nog niet bekend. Cellulaire modellen trauma waardevolle voordelen boven dierlijke modellen omdat de mechanische omgeving van de cellen nauwkeurig kan worden geregeld 6. Daarom moet een in vitro model voor trauma door stretch letsel met gekweekte endotheliale hersencellen die als model van de bloed-hersen barrière (BBB) ​​zoals wat ons protocol stelt kan nuttig blijken. Dit protocol maakt gebruik van CEND cellen, een gevestigde BBB model in ons laboratorium. Daar-hersenbarrière wordt vaak gedocumenteerd in patiënten TBI en TBI wordt vaak gekoppeld aan de verstoring van de BBB die kan leiden tot oedeemvorming 23, 24, de methode presHier teerde kunnen specifiek worden gebruikt BBB studies uitvoeren met betrekking tot TBI. In dit model is het belangrijk om te zorgen hoeveel mate van rek wordt schade aan de cellen toegediend. Voorzover de cellen geblesseerd elk geval, en met welke hoeveelheid druk wordt toegepast, de mate van verwonding die invloed kunnen endotheelcellen veel verschillen sterk van andere celtypen. Endotheelcellen zijn beter bestand tegen schade dan rekken astrocyten of gemengde gliacellen 9. Bovendien zijn ze sneller herstellen na beschadiging in vergelijking met de andere celtypen. Daarom is voor de hersenen endotheelcellen, vooral CEND cellen grotere hoeveelheid rek schade nodig is om een ​​hoge mate van letsel veroorzaken. Men kan de gewenste mate van letsel bereikt door toepassing van de overeenkomstige druk in tabel 1. Voor CEND cellen echter ernstig letsel heeft de voorkeur vanwege hun weerstand te belasten. De LDH assays uitgevoerd toondedat de mate van rek toeneemt, meer LDH wordt uitgescheiden in het supernatant. In tegenstelling tot de cellen die waren een lage hoeveelheid rek schade geproduceerde LDH in een hoeveelheid gelijk aan cellen te controleren. Zoals in het protocol, moet men ervoor zorgen dat de juiste hoeveelheid van het medium wordt gebruikt aangezien een toename of afname van de hoeveelheid medium kan leiden tot verschillen in de piekdruk aangebracht op de putjes. Bijvoorbeeld, een putje met 5 ml vloeistof toont een piekdruk in het gemiddelde van 4,0 psi terwijl een lege put registreert gemiddeld 3,8 psi bij 45 psi druk wordt uitgeoefend. Daarom is het het beste om de trigger meerdere malen duwen een controleputje dat de piekdruk die worden gegenereerd overeenkomt met de gewenste hoeveelheid. In onze experimenten gebruikten we een levensvatbaarheid kleuring om het effect van rek op de permeabiliteit van het celmembraan te bepalen. De optiek van de flexibele bodem cultuur borden we gebruiken kunnen wij view de gekleurde cellen direct onder de microscoop. Echter, wanneer men wil immunolabel studies uit te voeren direct na de stretch-letsel, kunnen problemen ontstaan. Ten eerste kan de grootte en dikte van de plaat een probleem met sommige microscoop uitkijkplatforms vormen. Ten tweede, kan de optiek van het flexibele membraan van de put een belemmering voor bezichtiging duidelijk zijn. Ondanks de bovengenoemde beperkingen, maar de procedure kan worden toegepast als een model van in vitro mechanische beschadigingen van de BBB. Traumatisch hersenletsel (TBI) bestaat uit twee componenten, namelijk, ischemie en trauma. Ischemie kan optreden als een secundaire schade na TBI in gevallen wanneer een ernstig bloedverlies resulteert in lage bloeddruk of als gevolg van zwelling van de hersenen beperkt zuurstoftoevoer naar de hersenen. Het wordt beschouwd als een vertraagde-mechanische schade die opeenvolgende pathologische processen begint op het moment van letsel 25. Het optreden van een hypoxiefter ernstig traumatisch hersenletsel is gebruikelijk 26. Zuurstof glucosedeprivatie (OGD) is de methode die momenteel wordt gebruikt om het model ischemie in vitro. Zo, het onderwerpen van cellen aan OGD als secundaire belediging voor de cellen na rek kan de incidentie van TBI gevolgd door ischemie na te bootsen. Vandaar onze huidige verbetering in vitro model van TBI en patroon zo dicht mogelijk een echte TBI zoals het in vivo, in de toekomst zullen we ook gebruik OGD in combinatie met stretch letsel.

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ongeveer 10 miljoen mensen worden jaarlijks getroffen door TBI waardoor het een belangrijk gezondheidsprobleem en medisch probleem 1. Vanwege dit, verschillende in vivo en in vitro modellen van TBI zijn opgericht en ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen 2,3,4. Een beter begrip van TBI kan helpen bij het ​​verbeteren van de behandeling van patiënten en verminderen de bijbehorende mortaliteit, morbiditeit en kosten. Vele modellen voor hersenletsel die zowel in vivo en in vitro methoden gebruiken bestaan. In vivo modellen kunnen de feitelijke gebeurtenis van hoofdletsel nabootsen. Vanwege de complexiteit van de in vivo situatie, toegankelijkheid van het weefsel van belang wordt beperkt 2. Het begrijpen van de fysiologische respons van individuele cellen als gevolg van de verwonding toegebracht, is het belangrijk dat de cellen worden geïsoleerd uit de systemische effecten diekunnen remmen of te wijzigen hun individuele respons 5. Daarom cellulaire modellen van trauma waardevolle voordelen boven dierlijke modellen omdat de mechanische omgeving van de cellen nauwkeurig kan worden geregeld 6. In vitro systemen die het gebruik van mechanische belasting cellen of weefsels veranderingen geïnduceerd door deze wijze van schade vast te stellen dienst ontwikkeld. Bijvoorbeeld, een methode voor het bestuderen van het effect van mechanische schade aan cellen vastgesteld voor astrocyten, neuronen, gliacellen en endotheelcellen 7,8,9. De in vitro trauma model opgesteld voor de studie van knaagdieren en menselijke astrocyten reactiviteit 10 tewerkgesteld een drukregelinrichting identiek aan wat we gebruiken voor ons model. Dezelfde methode werd toegepast om beschadiging te induceren door rek in muizenhersenen microvaatje endotheelcellen (bEnd3) 11 en corticale neuronen 12,13 en, cerebrale endothEliel cellen van pasgeboren biggen 14. Het apparaat vervormt de bodem van de cultuur en daardoor mechanische stretch verwondingen 10 produceren. Het kwaad doet op gekweekte cellen door de toepassing van luchtdruk boven de cellen. Deze druk kan het membraan waarop de cellen groeien buigen, waardoor het strekken van de cellen. Verschillende graden van rek (dat wil zeggen &quot;laag&quot; matige &quot;of&quot; ernstig &quot;) kan worden bereikt door de luchtdruk pulsduur en de intensiteit daarvan. Deze methode van rek geïnduceerde schade werd gecorreleerd met ernstige verwondingen in vivo 7. Bovendien deze wijze van schade maakt de nauwkeurige regeling van de extracellulaire omgeving en kan gemakkelijk worden gereproduceerd. Hoewel een soortgelijke benadering is gebruikt voor vele andere celtypen waaronder hersenen bEnd3 ons model is een voordeel dat het gebruik maakt van de murine brein microvasculaire endotheelcellen (CEND) gegenereerdin ons laboratorium. Deze cellijn is een zeer geschikt model van de bloed-hersenbarrière (BBB). In vitro celculturen gebruikt als BBB modellen moeten kenmerken die hen in staat stelt om te dienen als permeabiliteit scherm bezitten. Een belangrijk criterium voor een in vitro cel model een voorspeller van BBB permeabiliteit is dat het fysiologisch realistisch cellenarchitectuur moet bezitten 15. Ook al bEnd3 cellen weer onderscheidend spindel-achtige plaveiselcelcarcinoom morfologie in cultuur 16, ze vertonen onregelmatige morfogenetische gedrag in vitro waarbij zij vormen cyste-achtige holtes in plaats van de reguliere buisvormige structuren in fibrine gels 17. Bovendien, wanneer de cellen werden geïnjecteerd in embryonale en pasgeboren muizen, geïnduceerd zij snel groeiende tumoren dodelijk embryonale muizen maar niet bij pasgeboren en jonge muizen. Derhalve wordt gesuggereerd dat een of meer processen die normale endotheliale groei, migratie en differentiatie zijn veranderd of eliminated in deze cellijn 18. Anderzijds, morfologische, immunocytochemische evaluatie van endotheliale en BBB markerexpressie, bioelectric en paracellulaire flux-metingen dat ons model CEND BBB inderdaad een geschikt model van de BBB 19. Brain endotheel in vivo wordt gekenmerkt door een zeer strakke permeabiliteit trans-endotheliale elektrische weerstand (TEER) variërend van 2,000-5,000 Qcm 2. Voor studies van de hersenen microvasculatuur barrière-eigenschappen aan geneesmiddelen, moet paracellulaire restrictiviteit en dichtheid van de cellen worden beschouwd. In de meeste hersenen capillaire endotheelcellen (BCEC), is deze niet behouden als de cellen vertonen TEER variërend 50-100 Qcm 2 20. De geïmmortaliseerde hersenen endotheelcellijn bEnd3 genereert TEER waarden van niet meer dan 60 Qcm 2 15. Daarentegen differentiatie van CEND cellen met medium met verminderde serum schermTEER waarden variërend 300-500 Qcm 2 19,21. Tot op heden, in vitro modellen van stretch letsel in de hersenen gekweekte endotheelcellen schaars. Daarom moet een in vitro model voor trauma door letsel stretch middels hersenen gekweekte endotheelcellen die als model van de BBB kunnen nuttig blijken. In dit protocol, geven we een in vitro model van het feitelijke effect dat hersencellen, in het bijzonder hersenen microvasculaire endotheelcellen van de BBB, ontvangt gedurende TBI kan nabootsen. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat de hoeveelheid schade aan de cellen toegediend en de extracellulaire omgeving kan gemakkelijk worden geregeld zodat een nauwkeurig gemakkelijk reproduceerbaar proefopstelling.

<table><tbody><tr><td>Cell Injury Controller II</td><td>Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td><td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td><td>BF - 3001C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal Kalfs Serum (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>eindconcentratie 10%, hitte-geïnactiveerd (30 min bij 56 &deg;C)</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C</td></tr><tr><td>MEM Vitamine</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C</td></tr><tr><td>Na-pyruvaat</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>Opslag bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetaal Kalfs Serum, houtskool gestrept (ssFCS)</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C, beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>Cytotoxiciteit Detectie Kit PLUS (LDH)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td>Opslag: &le; -15 &deg;C</td></tr></tbody></table>

strekken in brain microvasculaire endotheelcellen (cend) als een<em&gt; in vitro</em&gt; traumatisch hersenletsel model van de blood brain barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Vanwege de hoge mortaliteit incident teweeggebracht door traumatisch hersenletsel (TBI), methoden mogelijk zou men beter begrijpen van de onderliggende mechanismen bij betrokken zijn nuttig voor behandeling. Er zijn zowel in vivo en in vitro methoden daarvoor. In vivo modellen werkelijke hoofdletsel bootsen zoals optreedt tijdens TBI. Echter, in vivo technieken kunnen niet worden benut voor studie aan de cel fysiologie niveau. Dus in vitro werkwijzen zijn voordeliger hiervoor omdat zij gemakkelijker toegang tot de cellen en de extracellulaire omgeving te manipuleren. Het protocol geeft een in vitro model van TBI met stretch letsel hersenen microvasculaire endotheelcellen. Het maakt gebruik van de druk waarbij de cellen gekweekt in flexibele-vormige putjes. De toegepaste druk kan gemakkelijk worden gecontroleerd en kunnen verwondingen die varieert van laag tot ernstig produceren. De murinehersenen microvasculaire endotheelcellen (CEND) gegenereerd in ons laboratorium is een geschikt model voor de bloed-hersen barrière (BBB) ​​waardoor voor een voordeel voor andere systemen die een soortgelijke techniek gebruiken. Bovendien, vanwege de eenvoud van de werkwijze proefopstelling gemakkelijk gedupliceerd. Zo kan dit model worden gebruikt bij het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij TBI op de BBB.

Cellen gekweekt op collageen I geprecoat 6-well flexibele bodem cultuur platen (57,75 cm 2) werden onderworpen aan verschillende mate van stretch letsel met behulp van de cel brancard apparaat. Na het onderwerpen van de cellen aan schade werden ze onder de microscoop onderzocht de effecten van door strekking geïnduceerd letsel aan celmorfologie. Er werd waargenomen dat een grotere mate van rek werd op de cellen een grotere cel verstoring kan ook worden waargenomen (figuur 1). Zoals getoond in figuur 1A, controlecellen die niet werden onderworpen aan schade verschijnen regelmatig gevormde cerebrovasculaire endotheelcellen (CEND) zonder vermelding van cel zwelling of vervalst. Toen stretch schade werd aangebracht (Figuren 1B-D), kan vervorming worden waargenomen onder de lichtmicroscoop. Na het rekken van de cellen ernstig met een piek druk tussen 3,5-4,5 psi, de CEND cellen bleek sterk teruggetrokken, opgezwollen en misvormd met niet<html> staat intercellulaire ruimten. Bovendien opname van levensvatbaarheid kleuring (100 nM eindconcentratie) ook naarmate de mate van rek schade werd verhoogd (Figuur 2). De levensvatbaarheid vlek die een kleurstof impermeant om gezonde cellen die permeant bij de plasmamembraan integriteit van cellen in het gedrang komt. De kleurstof werd uitgesloten van de meeste van de controle cellen, dus slechts een paar van de cellen werden gekleurd (Figuur 2A) in vergelijking met gestrekte cellen (Figuren 2B-D). Meer cellen fluoresceren groen met een verhoogde mate van stretch letsel. Als een biochemische marker van letsel, vrijkomen van lactaat dehydrogenase (LDH) enzym ook werd onderzocht volgens de instructies van de fabrikant. Figuur 3 laat zien dat een toenemende cel stretch letsel veroorzaakt toenemende LDH-afgifte. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figuur 1. Lichtmicroscopie onderzoek van normale versus beschadigde cellen. (A) Normaal ongerekte samenvloeiing celmonolaag istightly verpakt en langwerpig. Wanneer cellen werden uitgerekt door een piekdruk puls 1.8-2.0 psi (bijv. een lage rek) zij lijken minder compact, zijn aangegeven met pijlen (B). Wanneer de cellen matig werden verwond met een 2,5-3,0 piekdruk pols, een aantal van hen verscheen gezwollen en misvormd (C). De cellen worden teruggetrokken met ernstige strook 3.5-4.5 psi, zoals aangegeven door pijl (D). 100X vergroting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figuur 2. FluorEscence microscopisch onderzoek van normale versus beschadigde cellen Cellen behandeld met levensvatbaarheid vlek 2 uur na het letsel A: controle uitgerekte cellen BD: uitgerekte cellen (B - laag, C - matig, D - ernstig).... 100X vergroting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figuur 3. Lactaat dehydrogenase (LDH) vrijgave enzym in de supernatant na rek verwonding. LDH vrij in het cultuurmedium werd gemeten op verschillende tijdsintervallen na rek geïnduceerde verwonding. LDH werd uitgedrukt als percentage van de totale LDH losmaakbare (LDH in media plus cellen). Waarden zijn gemiddelden ± SEM. De n voor elk tijdstip is 5, behalve voor de 0 uur value onder zware traject waar n = 3. LDH afgifte uit cellen die waren blootgesteld aan lage en strekt niet verschilde niet significant van die van controles en gerekte van elkaar. Cellen die ernstig werden uitgerekt bezit een aanzienlijk grotere hoeveelheid LDH in vergelijking met alle andere monsters, behalve voor de matig gestrekt monster bij 1 uur. (P &lt;0,05, Een factor ANOVA, Holm-Sidak methode). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Tabel 1. Leidraad voor het genereren van verschillende gradaties van stretch letsel. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulator Pressure </th><th> Peak Pressure </th><th> Mate van letsel </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1.2-1.5 psi </td><td> &lt;Laag </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Laag </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Matig </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 psi </td><td> Zwaar </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Ernstige </td></tr></tbody></table>

In vitro traumatisch hersenletsel modellen gewerkt te reproduceren in vivo hersenen vervorming. Stretch-geïnduceerde schade is werkzaam voor astrocyten, neuronen, gliacellen, aorta, en de hersenen endotheelcellen. Echter, maakt gebruik van ons systeem een bloed-hersenbarrière (BBB) ​​model dat eigenschappen die een legitiem model van de BBB om een te vestigen in vitro TBI model bezit.

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van rekletsel als model voor traumatisch hersenletsel te demonstreen. Dit wordt bereikt door eerst microvasculaire endotheelcellen te kweken in putjes met flexibele bodems. De tweede stap is om de cellen te differentiëren door de hoeveelheid kalfsserum in het kweekmedium te reduceren.Vervolgens worden de cellen beschadigd met behulp van het cell stretcher-apparaat. De laatste stap is het beoordelen van de mate van beschadiging in de cellen. Uiteindelijk wordt door rek veroorzaakte beschadiging in cerebrale endotheelcellen gebruikt om beschadiging van de bloed-hersenbarrière in vitro aan te tonen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie voor traumatisch hersenletsel, omdat het de werkelijke impact die tijdens TBI optreedt in de bloed-hersenbarrière modelleert met behulp van rekschade aan cerebrale endotheelcellen van zeedieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Elaine Salvador, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door de cerebrale microvasculaire endotheelcellen van zeedieren te kweken in een T 75 kweekfles.Vervang het medium twee keer per week tot de confluentie is bereikt. Was vervolgens de cellen met PBS. Verwijder daarna het PBS en de trypsine.Analyseer de cellen met twee milliliters warme trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende vijf minuten of totdat de cellaag is gedispergeerd. Voeg daarna acht milliliters kweekmedium toe aan de cellen en tik meerdere keren tegen de fles om de cellen los te maken.Bekijk de cellen onder de microscoop om volledige loskoppeling van de kolf te bevestigen. Pipetteer vervolgens het medium met de losgekoppelde cellen meerdere keren op en neer. Draai daarna met de kolf om de celsuspensie te mengen.Voeg 20 µL van de cel-suspensie toe aan een hemocytometer en tel het aantal cellen. Bepaal de celdichtheid en zorg voor 20 000 cellen per vierkante centimeter in de well. Breng vervolgens de cel-suspensie over naar collageen.Vul zes voorgecodeerde kweekplaten met flexibele bodems met een totaalvolume van 3 mL per well. Vervang het kweekmedium twee keer per week en kweek de cellen gedurende één week bij 37 °C tot ze confluent zijn.Voor celdifferentiatie wordt het kweekmedium van de cellen vervangen door differentiatiemedium en worden de cellen gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 °C. Schakel bij deze procedure het apparaat voor celbeschadigingscontrole in en stel de vertraging in op 50 ms. Stel vervolgens de regulatordruk in op 15 PSI en bedien de trigger enkele keren totdat de geregistreerde piekdruk stabiel is.Stel vervolgens de druk van de regulator in op de gewenste waarde. Plaats daarna de cultuurplaat met flexibele bodems van zes putjes in de houder van het plateau. Controleer of de putselector is ingesteld op de juiste putgrootte.Plaats vervolgens de adapterplug stevig over de, nou, houd de plug met één hand stevig op zijn plaats terwijl u met de andere hand de trekker indrukt en registreer daarna de gegenereerde piekdruk. Plaats de plaat onmiddellijk terug in de incubator van 37 °C voor de gewenste tijd, of gebruik deze direct voor daaropvolgende experimenten of evaluatie om de rekletsel te beoordelen via een DI-opname-assay. Voeg onmiddellijk nadat de cellen zijn gerekt 30 µL van 1 mg/mL van de levensvatbaarheidsstof, die dient als cytotoxiciteitsmarker, toe aan het celkweekmedium.Om de rekletsel te beoordelen aan de hand van de afgifte van lactaatdehydrogenase. Verwijder na het rekken onmiddellijk 200 µL celkweekmedium uit de well; doe hetzelfde voor elk tijdstip na het letsel dat u in uw onderzoek naar LDH-afgifte wilt opnemen. Centrifugeer vervolgens het celkweekmedium vijf minuten op de hoogste stand van een microcentrifuge.Verwijder het supernatant om celdebris te elimineren en gebruik dit voor de volgende stappen. Zodra de benodigde monsters van verschillende tijdstippen zijn afgenomen, lys de cellen met de lysisoplossing die bij de LDH-assaykit is meegeleverd. Voeg daarna 100 microliters van het assaymedium uit de kit toe aan elke put van de meegeleverde 96-wellplaat.Voeg vervolgens 100 µL van het celvrije celkweekmedium toe aan twee parallelle putjes van de 96-wells plaat, incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en meet de absorbantie bij 492 nm. Hier wordt het lichtmicroscopisch onderzoek van normale versus beschadigde cellen getoond.De normale, niet-uitgerekte confluente cellaag is dicht op elkaar gepakt en langwerpig; wanneer cellen worden uitgerekt door een maximale drukpuls van 1,8 tot 2,0 PSI toe te passen, lijken ze minder compact. Wanneer de cellen matig beschadigd worden met een maximale drukpuls van 2,5 tot 3,0, lijken sommige van hen gezwollen en gedeformeerd. De cellen trekken samen bij een ernstige uitrekking van 3,5 tot 4,5 PSI.Hier is het fluorescentiemicroscopisch onderzoek van normale cellen tegenover beschadigde cellen. De cellen werden twee uur na de beschadiging behandeld met een kleuring voor levensvatbaarheid. Dit zijn de ongestrekte controlecellen, de matig gestrekte cellen en de zwaar gestrekte cellen.Deze figuur toont de LDH-enzymvrijgave in het medium na rekletsel; de LDH-vrijgave in het kweekmedium werd gemeten op verschillende tijdsintervallen na rek-geïnduceerd letsel en werd uitgedrukt als een percentage van de totale vrijmaakbare LDH die werd vrijgegeven uit cellen die waren blootgesteld aan lage en matige rek. Deze verschilden niet significant van die van de niet-gerekte controles en van elkaar.Cellen die sterk waren uitgerekt, lieten een significant grotere hoeveelheid LDH vrij in vergelijking met alle andere monsters, behalve het matig uitgerekte monster één uur na de ontwikkeling ervan. Deze techniek maakte het mogelijk voor onderzoekers in het veld van de neurobiologie om traumatisch hersenletsel in mariene cerebrale endotheelcellen in vitro te bestuderen.

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.

Predicting In Vivo Payloads levering met behulp van een bloed-hersen Tumor-barrière in een schotel

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.

Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel

Ontdek hoe je traumatisch hersenletsel in vitro modelleert met rekverwonding op hersenmicrovasculaire endotheelcellen. Deze techniek simuleert TBI-effecten op de bloed-hersenbarrière voor therapeutisch onderzoek.

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een In Vitro Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier (Video) | JoVE Journal

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een

Meer video's verkennen