Name: Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO 2 Substrates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer celpatronen aanmaken op SiO₂ met paryleen-C via fotolithografie. Deze methode minimaliseert besmettingsrisico's door biologische agentia buiten de clean room te houden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Trust Clinical PhD Fellowship (ECAT).

1. Fabricage van Parylene Patronen op SiO 2: Process Flow (zie figuur 1) <ol><li> Ontwerp gewenste Parylene-C-configuratie met een lay-out editor software pakket, geschikt voor het lezen / schrijven van CIF (Caltech tussenvorm) of GDS-II (Graphic Database System-II)-bestanden. CIF en GDS-II zijn standaard industrie bestandsformaten voor geïntegreerde schakeling kunstwerk lay-out. </li><li> Commissie foto masker produceren om een ​​geschikte micro-elektronica faciliteit, of maak in-huis als faciliteiten bestaan. </li><li> Oxideren een silicium wafer in een sfeervolle horizontale oven (H 2 1,88 SLM en O 2 1.25 SLM) bij 950 ° C gedurende 40 min tot een 200 nm SiO 2 laag (bevestigen dikte met een kleine plek spectroscopische reflectometer) produceren. </li><li> Prime de geoxideerde wafer met een silaan adhesiepromotor. Nu storten Parylene-C bij 22 ° C met een snelheid van 1,298 nm / mg dimeer met een vacuüm depositie systeem specifiek ontworpen paryleen storten. A 100nm dik Parylene-coating C werd gebruikt voor alle voorbeelden hieronder. </li><li> Volgende storting hexamethyldisilazaan (HMDS) adhesiepromotor op de-paryleencoating wafer met een geschikte foto-resist coating systeem. </li><li> Nu draaien de wafer bij 4.000 rpm gedurende 30 seconden terwijl die positieve fotoresist (resulterend in een theoretische dikte van 1 pm), met hetzelfde fotoresist coating zoals hierboven. </li><li> Zacht bakken de wafel 60 sec bij 90 ° C. </li><li> Plaats zowel de wafer en geprefabriceerde foto masker in een masker aligner. </li><li> Expose de fotoresist gecoate wafer met een UV negatieve voorstelling van de gewenste parylene-C configuratie. </li><li> Bak blootgestelde wafer gedurende 60 seconden bij 110 ° C. </li><li> Verwijder alle blootgestelde fotoresistfilm van de wafer door het ontwikkelen in een geschikte ontwikkelaar oplossing. </li><li> Ets van de onbeschermde paryleen. Gebruik een zuurstof plasma-ets-systeem (bij een 50 mTorr kamerdruk, 49 SCCM O 2, 100 W RF vermogen bij 13,56 MHz, eneen etssnelheid 100 nm / min) om de onderliggende SiO2 onthullen. </li><li> Snijd de wafer met een geschikte blokjes snijden zaag (toerental 30.000 rpm, voedingssnelheid 7 mm / sec). </li><li> Spoel chips in gedeïoniseerd H2O en droog blazen met stikstof. </li><li> Store chips (voor onbepaalde tijd) in stofvrij dozen tot vereist. </li></ol> 2. Chip Reiniging en activering: Protocol <ol><li> Verwijder achtergebleven fotolak van chips door het wassen in aceton gedurende 10 sec. </li><li> Spoelen in gedeïoniseerd gedestilleerd H2O 3x. </li><li> Vul verse piranha zuur (een 05:03 verhouding van 30% waterstofperoxide en 98% zwavelzuur). LET OP: Bereid piranha zuur met grote zorg. Het is een zeer krachtige oxidator, sterk zuur en waterstofperoxide mengen met zwavelzuur is een exotherme reactie. Voer deze fase in een zuur zuurkast. Laat 2 minuten te passeren na het mengen van de piranha zuur maar gebruik binnen 20 minuten. </li><li> Schoon en etsen chips door onderdompeling in piranha zuur gedurende 10 minuten. </li><li> Spoel chips 3x in gedeïoniseerd H2O en overbrengen in een steriele kweekschaal. </li><li> Activeer nu chips voor mobiele patronen. Voeg bijvoorbeeld twee chips per putje van een 6-wells plaat en voeg vervolgens 2 ml foetaal bovine serum om zo optimaal genieten van alle chips. Voer deze en alle volgende celcultuur stadia, onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming weefselkweek kap. </li><li> Incubeer chips in serum gedurende 3-12 uur bij 37 ° C. OPMERKING: Stappen 2,4-2,7 moet sequentieel en zonder vertraging tussen de stappen worden uitgevoerd. Als serum activering wordt vertraagd door ≥ 24 uur na piranha-behandeling, cel patronen is verminderd als gevolg van verminderde cel afstoting van SiO 2 regio&#39;s. Alternatieve activatie oplossingen die specifieke cel adhesie eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats van foetaal runderserum. Dergelijke oplossingen veranderen de cel-adhesie eigenschappen van de twee contrasterende ondergronden (zie representatieve resultaten voor een voorbeeld). </li&gt; </ol> 3. Plating cellijnen On-chip: Protocol <ol><li> Verwijder chips van hun activering oplossing en een keer wassen gedurende 10 seconden in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing. </li><li> Plaats chip in een kweekputje en plaat gekozen celtype als een suspensie in de gebruikelijke kweekmedia. Optimale cel plating dichtheid hangt zowel celtype en geometrische patroon van parylene-C op-chip. Een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml is een verstandig uitgangspunt. </li><li> Imaging is afgestemd op de onderliggende motivatie voor cel patronen maar levende cel gedrag kan eenvoudig worden beoordeeld met behulp van een dissectie microscoop en een digitale camera met een geschikt relais lens. </li></ol>

<ol><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staying+alive%3A+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li>
<li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li>
<li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cell+adhesion%2C+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li>
<li>Bacakova, L., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacakova%2C+L+%22Cell+colonization+control+by+physical+and+chemical+modification+of+materials.+In%3A+Cell+growth+process%3A+new+research%22">Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research</a>. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).</li>
<li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li>
<li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+and+micro-+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+World%22%5BJournal%5D)">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li>
<li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurochip%3A+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li>
<li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li>
<li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li>
<li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+assembly+patterning%3A+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li>
<li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li>
<li>Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+MA+%22J.+Biomed.+Mat.+Res.+Mater.+A%22">J. Biomed. Mat. Res. Mater. A</a>. 101 (2), 349-357 (2013).</li>
<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Onderdompeling van chips in piranha zuur dient niet alleen om eventuele resten van organisch materiaal te verwijderen, maar ook etsen het substraat oppervlakken. Dit is cruciaal voor dat werkelijke activering met foetaal runderserum. Doet u dit niet voorkomt cel-patronen en diepgaand verandert cel gedrag on-chip. Er is geen verplichting om chips te steriliseren na het reinigen met piranha zuur. Inderdaad sterilisatie door UV belichting is aangetoond cel patronen ondermijnen op een dosis-afhankelijke wijze 13. Zorg moet worden genomen om te wassen korting op alle resterende fotolak na de fotolithografische proces. Aanhoudende fotolak kan fungeren als een ongewenste cyto-kleeflaag die patroonvorming gedicteerd door parylene-C/SiO 2 geometrie overschrijft. Aceton is effectief als het gebruik van de fotolithografische bovenstaande proces en met de opgegeven reagentia beschreven. Echter kunnen andere soorten fotoresist een ander oplosmiddel nodig. Om de impact en het succes van de differe beoordelennt fabricagestappen, kan de contacthoek van de twee contrasterende substraten gemeten. Figuur 2 toont de veranderingen die optreden tijdens de chip activeringsproces. Het is echter waarschijnlijk dat specifieke lijm en afstotende eiwitcomponenten in serum uiteindelijk kan de-paryleen gevormde chip om zijn respectieve cyto lijm of cyto-afstotende eigenschappen uitoefenen. Alle representatieve resultaten gebruikt chips met een parylene dikte van 100 nm, al hebben we met succes hebben gevormd met behulp van zowel dikker en dunner parylene lagen. Belangrijk is dat deze fotolithografische ets techniek maakt veel grotere driedimensionale bediening van parylene configuratie dan hier afgebeeld. Bijvoorbeeld, een combinatie van fotomaskers, is het mogelijk parylene gebieden gemengde dikte creëren. Dit opent de weg naar het creëren van celculturen met gedefinieerde driedimensionale topografie, die verder gaat dan gewoon dicteren regio&#39;s van cel adhesie / repulsie, in potentie een middel voor de integratie microfluïdische kanalen in het construct. Zoals getoond, maar dit patroon platform niet universeel doeltreffend in celtypen. Verschillende cellijnen, met hun gevarieerde celadhesiemolecuul profielen, niet verwonderlijk anders gedragen wanneer gekweekt op dit platform. We zijn nog niet geïdentificeerd de belangrijkste componenten in het serum, noch de gratis cel-membraan receptoren, die deze cel-patronen platform ondersteunen. Daarvoor in de toekomst belooft het nut en specificiteit te verbreden. Zo kan een &quot;niet-patronen &#39;cellijn genetisch gemodificeerd worden om de vereiste adhesie molecuul expressie bevorderen en aldus patronen.

Begrip mechanismen die celadhesie en patroonvorming dicteren kunststoffen is belangrijk voor toepassingen zoals tissue engineering, drug discovery, en de fabricage van biosensoren 1-3. Vele technieken zijn beschikbaar en evolueren, elk gebruik te maken van de talloze biologische, chemische en fysische factoren die celadhesie beïnvloeden. Hier beschrijven we een cel-patronen techniek die processen in eerste instantie ontwikkeld voor micro-elektronische fabricage doeleinden gebruikt. Als zodanig is het platform is goed geplaatst om de downstream-integratie van micro-elektronische technologieën, zoals MEA staat, in de patroonvorming platform. De interface tussen een celmembraan en een aangrenzende materiaal is bidirectioneel en complex. In vivo, extracellulaire matrixeiwitten zorgen voor structuur en sterkte en effect op celgedrag via interacties met celadhesie receptoren. Ook cellen in vitro interactie met synthetische substraten via geabsorbeerd lagen van eiwitten 4 terwijl fysisch-chemische invloeden ook hechting moduleren. Bijvoorbeeld, een polymeer oppervlak kan meer &quot;bevochtigbaar&quot; (hydrofiele) van ionen of ultraviolet licht bestraling of etsen gemaakt door behandeling met zuur of hydroxide 5. Gevestigde methoden voor mobiele patroonvorming profiteer van deze en andere cel adhesie mediators. Voorbeelden zijn inkjet printen 6, microcontact stempelen 7, fysieke immobilisatie 8, microfluidics 9, real-time manipulatie 10, en selectieve moleculaire assemblage patroonvorming (SMAP) 11. Elk heeft specifieke voordelen en beperkingen. Een belangrijke drijfveer in ons werk, is echter naar cel patronen te integreren met micro-elektromechanische systemen (MEMS). MEMS verwijzen naar zeer kleine mechanische apparaten aangedreven door elektriciteit. Dit overlapt met de nanoschaal equivalent, nanoelectromechnische systemen. Dit concept werd praktisch alleen als halfgeleider strategieën mogelijk fabricage plaatsvinden op de microschaal. Microfabricage technieken oorspronkelijk ontwikkeld voor de halfgeleider elektronica onbedoeld bruikbaar voor andere toepassingen zoals cellulaire elektrofysiologie bijvoorbeeld gevonden. Een belangrijke downstream doel is om dergelijke micro-elektronische technologieën met een high fidelity cel patronen proces (het vormen van een bioMEMS apparaat) te combineren. Verschillende bestaande en anders betrouwbare en praktische cel-patronen technieken verenigbaar zijn met dit idee. Bijvoorbeeld nauwkeurige uitlijning van elke ingebedde micro of biosensoren is fundamenteel voor hun doeltreffendheid maar is zeer moeilijk te bereiken met behulp van een techniek zoals microcontact stempelen. Om dit probleem te omzeilen, zijn we bezig met een SiO 2-gebaseerde patronen platform dat fotolithografisch gedrukt parylene-C gebruikt. Fotolithografie impliceert overdracht van geometrische kenmerken vaneen masker op een substraat via UV belichting. Een masker is ontworpen met behulp van een geschikte computer-aided design programma. Bij een glasplaat, een dunne laag ondoorzichtige chroom vertegenwoordigt de gewenste geometrisch patroon (een kenmerk resolutie van 1-2 mm mogelijk). Het substraat een patroon wordt bedekt met een dunne laag fotolak (een UV-gevoelige polymeer). De beklede polymeer wordt vervolgens uitgelijnd en gebracht in nauw contact met het masker. Een UV bron zodanig dat onbeschermde gebieden bestraald toegepast en derhalve oplosbaar en verwijderbaar te worden in de volgende ontwikkelingsstap waardoor een parylene-C weergave van het maskerpatroon achteren. Dit proces ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling van halfgeleiderinrichtingen. Als zodanig zijn silicium wafers vaak gebruikt als substraat. Photolithographic afzetting van parylene-C op SiO 2 is dus een eenvoudige en betrouwbare proces dat routinematig plaatsvindt in micro-elektronische cleanroom faciliteiten. Terwijl parylene heeftverschillende wenselijke biotechniek kenmerken (chemisch inert, niet biologisch afbreekbaar), een beperkende factor zijn directe toepassing in cel patronen is haar aangeboren slechte mobiele hechting, toegeschreven aan zijn extreme hydrofobiciteit. Niettemin Parylene-C is eerder indirect worden gebruikt cel patronen, bijvoorbeeld als afpelbare cellulaire template 12,13. Deze benadering wordt beperkt door slechte resolutie en vereist meerdere stappen. De hier beschreven werkwijze maar gebruikt een zure etsstap, gevolgd door incubatie serum, zodat parylene-C-gebieden worden cel-lijm, door een combinatie van vermindering van hydrofobiciteit en serum eiwitbinding. Het eindresultaat is een constructie uit twee verschillende substraten die, na biologische activatie manifesteren respectieve cyto lijm of cyto-afstotende eigenschappen en dus een doeltreffend cel pattering platform. Belangrijk hoeft biologische ag introducerenouders in de cleanroom faciliteit als de substraten kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd vóór gebruik (waarna ze worden geactiveerd met behulp van foetaal serum of andere activering oplossing). Dit parylene-C/SiO 2 patronen platform is daarom een goede kandidaat voor een coalitie met MEMS componenten, zoals de fabricage processen zo nauw spiegel die gebruikt worden voor micro-elektronische fabricage.

<table><tbody><tr><td>Layout editor software package</td><td>CleWin 5.0 van WieWeb</td><td></td><td>In staat om CIF- of GDS-II-bestanden te lezen/schrijven. Gebruikt om paryleenontwerp voor fotomaskerfabricage te maken. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Op maat gemaakte fotomasker</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Schotland</td><td></td><td>Hetzij in eigen beheer of als faciliteiten bestaan of in opdracht. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 inch siliciumwafers</td><td>Siltronix, Archamps, Frankrijk</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Horizontale atmosferische oven</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Voor het oxideren van siliciumwafers. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Spectroscopische reflectometer met kleine vlek</td><td>Nanometrics</td><td></td><td>Om de diepte van de siliciumdioxidelaag te meten. www.nanometrics.com/</td></tr><tr><td>Adhesiebevorderaar voor silaan</td><td>Merck Chemicals</td><td>1076730050</td><td>Vooraf aangebracht op de wafer om paryleenafzettingen te bevorderen. www.merck-chemicals.de/</td></tr><tr><td>Paryleen-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>SCS Labcoter 2-depositieseenheid, Model PDS2010</td><td>SCS Equipment, Surrye, UK</td><td>Model PDS2010</td><td>www.scscoatings.com/</td></tr><tr><td>Adhesiebevorderaar voor hexamethyldisilazaan (HMDS)</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Geautomatiseerd spoorsysteem voor het doseren van fotoresist op wafers; 3 inch foto-resist spoor</td><td>SVG (Silicon Valley Group)</td><td></td><td>Geautomatiseerd spoorsysteem voor het doseren van fotoresist op wafers. Een prime-oven bakt de wafer en doseert de adhesieve promotor, HMDS. Een combinatiespinner doseert fotoresist. Prebake-oven hardt de resist aan.</td></tr><tr><td>Foto-resist</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 positieve foto-resist</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr><tr><td>MA/BA8 foto-masker-uitlijner</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A-ontwikkelaar</td><td>Microchem</td><td></td><td>Verwijdert blootgestelde delen van fotoresist. www.microchem.com</td></tr><tr><td>JLS RIE80 plasma-etssysteem</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>Verwijdert blootgestelde delen van paryleen. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Wafer-snijwiel</td><td>DISCO Corporation, Japan</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Om resterende fotoresist af te wassen.</td></tr><tr><td>30% waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98% zwavelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Standaard chipactivering. www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

cel patterning op fotolithografisch defined parylene-c: sio<sub&gt; 2</sub&gt; substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cel patronen platformen ondersteunen brede onderzoeksdoelen, zoals de bouw van voorgedefinieerde in vitro neuronale netwerken en de exploratie van bepaalde centrale aspecten van de cellulaire fysiologie. Naar cel patronen gemakkelijk te combineren met Multi-elektrode arrays (MEA&#39;s) en op basis van silicium &#39;lab op een chip&#39; technologieën, is een microfabrication-compatibele protocol vereist. We beschrijven een methode die afzetting van het polymeer parylene-C op SiO 2 wafels gebruikt. Fotolithografie maakt een nauwkeurige en betrouwbare patroonvorming van parylene-C op micron-niveau resolutie. Na activering door onderdompeling in foetaal runderserum (of een andere specifieke activatie oplossing) resulteert in een substraat waarin gekweekte cellen hechten aan, of respectievelijk afgestoten door, paryleen of SiO2 gebieden. Deze techniek heeft het mogelijk patroonvorming van een breed scala aan celtypen (inclusief primaire murine hippocampale cellen, HEK 293-cellijn, menselijk neuron-achtige teratocarcinoomcellijn, primaire muizen cerebellaire granule cellen en primaire menselijke-glioma afgeleide stam-achtige cellen). Interessant is echter het platform niet universeel, gezien het belang van celspecifieke adhesiemoleculen. Deze cel patronen proces is effectief, betrouwbaar kost, en belangrijker kan in standaard microfabrication worden opgenomen (chip industrie) protocollen, de weg vrijmaakt voor de integratie van micro-elektronische technologie.

De fotolithografische werkwijze van patroonvorming SiO2 met Parylene-C in figuur 1. Na bereiding activering van chips in foetaal runderserum maakt een breed scala aan celtypen worden gevormd in kweek. Onze groep heeft met succes een patroon primaire muizen hippocampuscellen 14-16, de HEK 293 cellijn 17, het menselijk neuron-achtige teratocarcinoom (hNT) cellijn 18, primaire muizen cerebellaire granule cellen en primaire menselijke-glioma afgeleide stam-achtige cellen. Figuur 3 illustreert robuuste patroonvorming van HEK 293-cellen op een parylene patroon bestaande uit ronde knopen met &#39;cross-hair&#39; extensions. Chip activering in dit voorbeeld was met foetaal runderserum. Daarentegen Figuur 4 illustreert het potentieel om de patroonvorming platform te vergroten door alternatieve activering oplossingen. Met een oplossing van runderserumalbumine (3 mg / ml) en<html> fibronectine (1 ug / ml) in HBSS, heeft de vorige patroon Voorschrift geïnverteerd. Figuur 5 illustreert een ander celtype (een primair van mensen afkomstige stam-achtige cellijn afgeleid van een hoogwaardig glioom). Hier, de geometrie van de onderliggende patroon effecten celgedrag, met de in figuur 4A patroon bevordering celproces groei langs dunne parylene-C circuits zoals weergegeven in figuren 4B en 4C. Sommige celtypen niet patroon bij gebruik van de gevestigde foetaal serum activering protocol. Figuur 6 illustreert 3T3 L1 cellen groeien tot confluentie met geen waarneembare cyto-afstotende of cyto-klevende verschil tussen Parylene-C en SiO 2 regio&#39;s. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Stroomdiagram het proces voor de productie van parylene-C patronen op SiO 2. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figuur 2. Flow diagram dat de veranderingen in contacthoek voor gevormde Parylene-C en SiO2 domeinen gedurende chip activeringsstappen. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figuur 3. Beeldvorming van levende cellen van HEK 293-cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na drie dagen in vitro. Chips gedurende 3 uur in foetaal runderserum waarna cellenuitgeplaat in suspensie in een concentratie van 5 x 10 4 cellen / ml. Parylene-C bevordert cel adhesie terwijl blote SiO 2 afstoot cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figuur 4. Beeldvorming van levende cellen van HEK 293-cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na drie dagen in vitro geactiveerde chips 3 uur in verschillende rationele activatie oplossingen. A: foetaal runderserum, B: vitronectine (1 pg / ml) in HBSS, C: Bovine serum albumine (3 mg / ml) + vitronectine (1 pg / ml) in HBSS, D: Bovine serum albumine (3 mg / ml) + fibronectine (156, g / ml) in HBSS. Cellen werden uitgeplaat in suspensie bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml. Merk op hoe de verschillende behandeling van de chip heeft geleid tot omkering van de vorige patronen dogma, met SiO 2 nu lijm en parylene-C weerzinwekkend. Parylene-C knooppunt diameter van 250 micrometer, aangepast van Hughes et al.. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figuur 5. Immunofluorescentie beelden van primaire humane-glioma afgeleide stam-achtige cellen gekweekt op verschillende patronen van parylene-C op SiO 2 A:. Schema illustreert de reticulaire parylene ontwerp getoond in B en C </strong&gt; B:.. Fluorescentie microfoto van vaste cellen (na 4 dagen in vitro) gekleurd voor gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) C:. Lichtmicroscopische van levende cellen op dezelfde chip D: Fluorescentie afbeelding illustreert GFAP-gekleurde cellen op een andere parylene . ontwerp E:. Reflectie beeld van het knooppunt en sprak parylene ontwerp afgebeeld in D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figuur 6. Live cell imaging van 3T3 L1 cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na vier dagen in vitro. Chips geactiveerd voor 3 uur in foetaal serum na which cellen werden in suspensie (3 x 10 4 cellen / ml). In dit specifieke geval staat het platform niet in staat patronen, met cellen die even samenvloeiing op Parylene-C en SiO 2 regio&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een microfabrication-compatible methode voor cel-patroon op SiO 2. Een vooraf gedefinieerde Parylene-C ontwerp wordt fotolithografische gedrukt op SiO 2 wafels. Na incubatie met serum (of andere activering oplossing) cellen specifiek hechten aan (en te groeien volgens de conformiteit van) onderliggende parylene-C, terwijl wordt afgestoten door SiO 2 regio&#39;s.

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellen op siliciumdioxidesubstraten te patroneren volgens een vooraf gedefinieerd onderliggend ontwerp van paryleen. Dit wordt bereikt door eerst een fotomasker van het gewenste patroon te maken. De tweede stap is het oxideren en vervolgens coaten van een siliciumwafer met paryleen.Vervolgstappen van fotolithografische processen, uitgevoerd in een cleanroomfaciliteit voor micro-elektronica, worden gebruikt om de paraline-coating selectief weg te etsen om het gewenste ontwerp bloot te leggen. De laatste stap is het activeren van de chips, eerst met piranha-oplossing en vervolgens door incubatie in foetaal kalfsserum gedurende drie tot 12 uur, waarna een cel-suspensie kan worden aangebracht voor kweek. Uiteindelijk kan het celpatroon worden beoordeeld via live-cell imaging met een dissectiescoop of na fixatie met confocale fluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van verschillende bestaande platforms voor celpatronering is dat het niet nodig is om biologische agentia in de cleanroom te brengen. Bovendien kunnen patroonchips onbeperkt bewaard worden totdat ze worden geactiveerd met eerst par-zuur en vervolgens serum. Gebruik voor het ontwerpen van de gewenste paraline C-configuratie een lay-outeditor-softwarepakket dat in staat is om CIF- of GDS-bestanden te lezen en schrijven.Besteed de productie van het fotomasker uit aan een geschikte micro-elektronicafaciliteit of vervaardig dit intern. Indien de faciliteiten aanwezig zijn, wordt een siliciumwafer geoxideerd in een atmosferische horizontale oven bij 950 °C gedurende 40 minuten om een siliciumdioxidelaag van 200 nm te produceren. Bevestig daarna de dikte met een kleine spotmeting.Spectroscopische reflectometer. Plaats de wafers in het vacuümdepositiesysteem en breng een adhesiebevorderaar aan op de binnenzijde van het kamerdeksel. Tijdens de pompcyclus bedekt de adhesiebevorderaar de geoxideerde wafer; laad paraline in de oven en deponeer paraline C bij omgevingstemperatuur met een snelheid van 1,3 nanometers per milligram dimeer met behulp van een vacuümdepositiesysteem.Breng daarna HMDS-adhesiepromotor aan op de met paryleen gecoate wafer. Gebruik een geschikt systeem voor het aanbrengen van fotolak en spin de wafer 30 seconden lang bij 4 000 RPM terwijl positieve fotolak wordt aangebracht om een dikte van één micron te verkrijgen, en voer vervolgens een soft bake van de wafer uit gedurende 60 seconden bij 90 °C. Plaats nu zowel de wafer als het vooraf vervaardigde fotomasker in een mask-aligner.Belicht de met fotolak gecoate wafer met UV-licht om het gewenste patroon in de fotolak over te dragen. Bak de belichte wafer vervolgens gedurende 60 seconden bij 110 °C. Verwijder daarna alle belichte fotolak van de wafer door deze te ontwikkelen in een geschikte ontwikkelaar en verwijder de onbeschermde paryleen met behulp van een zuurstofplasma-etssysteem om het onderliggende siliciumdioxide bloot te leggen.Bewaar de chips na het dicing in stofvrije dozen tot ze nodig zijn. Verwijder bij deze procedure de resterende fotolak van de chips door ze 10 seconden in aceton te wassen. Spoel ze vervolgens drie keer met gedeïoniseerd gedestilleerd H2O, maak daarna verse piranha-oplossing in een zuurkast en reinig en ets de chips door ze 10 minuten in piranha-oplossing te dompelen.Spoel de chips vervolgens drie keer met gedeïoniseerd H2O en breng ze over naar een steriele kweekschaal in een laminaire flow tissue culture hood. Activeer de chips voor celpatronering door twee chips per putje in een zes-wells plaat te plaatsen. Voeg vervolgens twee milliliters foetaal runderserum toe zodat alle chips volledig zijn ondergedompeld.Incubeer de chips gedurende drie tot 12 uur in serum bij 37 °C. Verwijder nu de chips uit hun activeringsoplossing. Was deze eenmaal gedurende 10 seconden in Hank's gebalanceerde zoutoplossing.Plaats vervolgens de chips in een kweekputje en zaai het gekozen celtype als suspensie uit in het gebruikelijke groeimedium. De optimale zaaidichtheid van de cellen hangt af van zowel het celtype als het geometrische patroon van paraline C op de chip. Een dichtheid van vijf keer 10⁴ cellen per milliliter is een zinvol startpunt.Beeldvorming wordt afgestemd op de onderliggende motivatie voor celpatroonvorming, maar het gedrag van levende cellen kan eenvoudig worden beoordeeld met een dissectiemicroscoop en een digitale camera met een geschikte relaislens. Hier ziet u de live-cell imaging van HEC 2 93-cellen gekweekt op paraline C siliciumdioxide na drie dagen. In vitro waren de chips drie uur geïncubeerd in foetaal runderserum en werden de cellen in suspensie geplaatst bij een concentratie van 5 × 10⁴ cellen per milliliter.Paraline C bevordert celadhesie, terwijl onbehandeld siliciumdioxide cellen afstoot. Deze figuur toont de immunofluorescentiebeelden van primaire menselijke glioom-afgeleide stamcelachtige cellen die zijn gegroeid op diverse patronen van paraline C op siliciumdioxide. Hier illustreert het schema het reticulaire paraline-ontwerp, toont de fluorescentiemicrografie gefixeerde cellen gekleurd voor gliaal fibrillair zuur eiwit, en de lichtmicrografie levende cellen op dezelfde chip.Hier is een fluorescentiebeeld dat GFAP-gekleurde cellen op een ander paraline-ontwerp illustreert en het reflectiebeeld van de knoop in een spoke-paraline-ontwerp. En deze figuur toont de live-cell imaging van drie T drie L één-cellen gekweekt op paraline C siliciumdioxide. Na vier dagen in vitro waren de chips gedurende drie uur geactiveerd in foetaal runderserum, en de cellen werden in suspensie geplaatst bij een concentratie van vijf keer 10⁴ cellen per milliliter.In dit geval maakt het platform geen patroonvorming mogelijk waarbij cellen evenredig confluent worden op zowel de Lene C- als de siliciumdioxidegebieden. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat de serumactivatie onmiddellijk na de piranhabehandeling moet plaatsvinden. Als dit niet gebeurt, wordt het patroonvormingsproces belemmerd.Vergeet niet dat het werken met piranhavloeistof extreem gevaarlijk kan zijn. Bereid piranhavloeistof voor en gebruik deze in een chemische zuurkast en zorg ervoor dat u passende veiligheidsbrillen, labjassen en handschoenen draagt.

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Niet-fouling PEG silaan monolaag werd gedesorbeerd uit individueel adresseerbare ITO elektroden op glas door toepassing van een reductieve potentieel. Elektrochemische strippen van de PEG-silaan laag van ITO-micro-elektroden toegestaan ​​voor celadhesie te laten plaatsvinden in een ruimtelijk bepaalde manier, met cellulaire patronen overeenkomt nauw aan bij elektrode patronen.

Patroonvorming Cellen op optisch transparant Indium Tin Oxide Elektroden

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de patronen oxide-vrij silicium en germanium met reactieve organische monolagen en demonstreren functionalisering van het patroon substraten met kleine moleculen en eiwitten. De aanpak beschermt volledig oppervlakken tegen chemische oxidatie, biedt nauwkeurige controle over de functie morfologie, en biedt direct toegang tot chemisch gediscrimineerd patronen.

Zacht Lithografische functionalisering en patroonvorming Oxide-vrij silicium en germanium

Een micropunching lithografie wordt aangepakt micro-en submicron-patronen op, zijwand en onderkant van polymeersubstraten genereren. Het overwint de obstakels van patronen geleidende polymeren en het genereren van zijwand patronen. Deze methode maakt een snelle fabricage van meerdere functies en is vrij van agressieve chemie.

Micropunching Lithografie voor het genereren van Micro-en Submicron-patronen op polymeersubstraten

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.

Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Dit protocol presenteert een door licht geïnduceerde methode voor het vervaardigen van gladde driedimensionale structuren via sequentiële digitale patronen en enten op met silaan beklede nanoporeuze oppervlakken. Deze benadering maakt de ruimtelijk gecontroleerde vorming van gladde gebieden mogelijk, waardoor vloeistofafstotende patronen en de kwantitatieve analyse van grensvlakgladheid mogelijk worden, met toepassingen in vloeistofmanipulatie en oppervlaktetechniek.

Door licht geïnduceerde patroonvorming en enten voor gladde oppervlakken op basis van met silaan beklede nanoporeuze structuren

Leer celpatronen aanmaken op SiO₂ met paryleen-C via fotolithografie. Deze methode minimaliseert besmettingsrisico's door biologische agentia buiten de clean room te houden.

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO

Meer video's verkennen