Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO 2 Substrates
7 maart 2014
Dit protocol beschrijft een microfabrication-compatible methode voor cel-patroon op SiO 2. Een vooraf gedefinieerde Parylene-C ontwerp wordt fotolithografische gedrukt op SiO 2 wafels. Na incubatie met serum (of andere activering oplossing) cellen specifiek hechten aan (en te groeien volgens de conformiteit van) onderliggende parylene-C, terwijl wordt afgestoten door SiO 2 regio's.
Het algemene doel van deze procedure is om cellen op siliciumdioxide-services te patroniseren volgens een vooraf gedefinieerd onderliggend paraline-ontwerp. Dit wordt bereikt door eerst een fotomasker van het gewenste patroon te maken. De tweede stap is om een siliciumwafer te oxideren en vervolgens te coaten met paraline.
Vervolgens worden fotolithografische processen die in een schone ruimte voor micro-elektronica worden uitgevoerd, gebruikt om selectief de paraline-coating te etsen om het gewenste ontwerp te onthullen. De laatste stap is het activeren van de chips door eerst piranhazuur te gebruiken en vervolgens drie tot 12 uur in foetaal runder serum te incuberen, waarna een celsuspensie kan worden aangebracht voor cultivatie. Uiteindelijk kan celpatronisering worden beoordeeld door middel van live-celbeeldvorming met behulp van een disserperend microscoop of na fixatie met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven verschillende bestaande celpatroniseringsplatforms is dat er geen biologische agentia in de schone ruimte hoeven te worden gebracht. Ook kunnen patroonchips onbeperkt worden bewaard totdat ze worden geactiveerd met eerst par-zuur en vervolgens serum. Om de gewenste paraline C-configuratie te ontwerpen, gebruik een layout editor softwarepakket dat CIF- of GDS-twee bestanden kan lezen en schrijven.
Bestel de fotomaskerfabrikant uit bij een geschikte micro-elektronica-faciliteit of maak deze in eigen beheer. Als faciliteiten beschikbaar zijn, oxideer dan een siliciumwafer in een atmosferische horizontale oven op 950 graden Celsius gedurende 40 minuten om een siliciumdioxidelaag van 200 nanometer te produceren. Bevestig daarna de dikte met een kleine stip.
Spectroscoop reflectometer. Plaats de wafels in een vacuümdepositiesysteem en breng een sinuskleefpromotor aan aan de binnenkant van het kamerdeksel. Tijdens de pompcyclus coat de sinuskleefpromotor de geoxideerde wafel, laad paraline in de oven en deponeer paraline C bij kamertemperatuur met een snelheid van 1,3 nanometer per milligram dimeer met behulp van een vacuümdepositiesysteem.
Na dat deposit HMDS-kleefpromotor op de met paraline bedekte wafel. Gebruik een geschikt fotoweerstandcoatingsysteem, draai de wafel 30 seconden bij 4.000 RPM terwijl u positieve fotoweerstand aanbrengt om een dikte van één micrometer te verkrijgen met behulp van het fotoweerstandcoatingsysteem, bak de wafel vervolgens 60 seconden op 90 graden Celsius. Plaats nu zowel de wafel als de vooraf vervaardigde fotomasker in een maskeraligner.
Stel de met fotoweerstand bedekte wafel bloot aan UV-licht om het gewenste patroon in de fotoweerstand over te brengen. Bak vervolgens de blootgestelde wafel gedurende 60 seconden bij 110 graden Celsius. Verwijder vervolgens alle blootgestelde fotoweerstand van de wafel door deze te ontwikkelen in een geschikte ontwikkelingsoplossing bij Hoff de onbeschermde paraline door gebruik te maken van een zuurstofplasma-etchsysteem om de onderliggende siliciumdioxide te onthullen.
Bewaar vervolgens de chips na het snijden in stofdichte dozen totdat ze nodig zijn. Verwijder in deze procedure de resterende fotoweerstand van de chips door ze 10 seconden met aceton te wassen. Spoel ze vervolgens drie keer af in gedeïoniseerd gedestilleerd H2O, maak vervolgens verse piranhazuur in een zuurdamphoed en reinig en ets de chips door ze 10 minuten in piana-zuur te laten weken.
Spoel de chips vervolgens drie keer af in gedeïoniseerd H2O en breng ze over naar een steriele kweekschaal in een laminaire stroming weefselkweekkap. Activeer de chips voor celpatronisering door twee chips per putje in een zes-putjesplaat te plaatsen. Voeg vervolgens twee milliliter foetaal runderserum toe om alle chips volledig te laten onderdompelen.
Incubeer de chips gedurende drie tot 12 uur in serum bij 37 graden Celsius. Verwijder nu de chips uit hun activeringsoplossing. Was eenmaal gedurende 10 seconden in Hank's gebalanceerde zoutoplossing.
Plaats vervolgens de chips in een kweekputje en plateer het gekozen celtype als een suspensie in zijn gebruikelijke groeimedium. De optimale celplattingsdichtheid is zowel afhankelijk van het celtype als van het geometrische patroon van paraline C op de chip. Een dichtheid van vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter is een verstandige startpunt.
Beeldvorming is afgestemd op de onderliggende motivatie voor celpatronisering, maar live celgedrag kan eenvoudig worden beoordeeld met behulp van een disserperend microscoop en een digitale camera met een geschikte relaislens. Hier is de live-celbeeldvorming van HEC 2 93-cellen gekweekt op paraline C siliciumdioxide na drie dagen. In vitro waren de schepen gedurende drie uur in foetaal runderserum geïncubeerd en de cellen werden in suspensie geplateerd bij een concentratie van vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter.
Paraline C bevordert celkleuring, terwijl blote siliciumdioxide cellen afstoot. Deze figuur toont de immunofluorescentiebeelden van primaire humane glioom-afgeleide stamcel-achtige cellen die op verschillende patronen van paraline C op siliciumdioxide zijn gekweekt. Hier illustreert het schema het reticulaire paraline-ontwerp, de fluorescentiemicrograaf van gefixeerde cellen gekleurd voor gliale fibrillaire zure eiwit, en de lichtmicrograaf van levende cellen op hetzelfde chip.
Hier is een fluorescentiebeeld dat GFAP-gekleurde cellen illustreert op een ander paraline-ontwerp en het reflectiebeeld van de knoop in gespaalde paraline-ontwerp. En deze figuur toont de live-celbeeldvorming van drie T drie L een cellen gekweekt op paraline C siliciumdioxide. Na vier dagen in vitro waren de chips gedurende drie uur in foetaal runderserum geactiveerd en de cellen werden in suspensie geplateerd bij een concentratie van vijf keer 10 van de vierde cellen per milliliter.
In dit geval stelt het platform geen patronisering in staat met cellen die gelijkmatig confluent worden op Lene C en siliciumdioxidegebieden. Wanneer u dit protocol uitvoert, is het belangrijk om te onthouden dat serumactivatie onmiddellijk na piranha-behandeling moet plaatsvinden. Als u dit niet doet, ondermijnt u het patroniseringsproces.
Vergeet niet dat het werken
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor celpatronering op siliciumdioxide (SiO2) met behulp van paryleen-C. Cellen hechten aan de paryleen-C regio's terwijl ze worden afgestoten door SiO2, waardoor gecontroleerde groeipatronen mogelijk zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celpatronering
- Microfabricage
- Neurowetenschappelijke toepassingen
Achtergrond
- Celpatronering is essentieel voor het bestuderen van cellulair gedrag.
- Paryleen-C dient als substraat voor celadhesie.
- Siliciumdioxide wordt gebruikt vanwege de afstotende eigenschappen voor cellen.
- Deze methode voorkomt contaminatie door biologische agentia in cleanrooms.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor celpatronering op SiO2.
- Het verbeteren van het begrip van celgedrag in gepatroneerde omgevingen.
- Het bieden van een protocol dat contaminatierisico's minimaliseert.
Gebruikte methoden
- Creatie van een fotomasker voor het gewenste paryleen-C-patroon.
- Oxidatie en coating van siliciumwafers met paryleen-C.
- Fotolithografisch etsen om het patroon bloot te leggen.
- Activering van chips met behulp van piranha-oplossing en foetaal kalfsserum.
Belangrijkste resultaten
- De cellen werden succesvol gepatroneerd volgens het parylene-C ontwerp.
- Live-cell imaging toonde het celgedrag op de gepatroneerde oppervlakken aan.
- Immunofluorescentie bevestigde de celadhesie en de groeipatronen.
- De methode maakt een onbeperkte opslag van de patroonschips mogelijk vóór activering.
Conclusies
- Deze techniek biedt een robuuste aanpak voor celpatronering.
- Het vereenvoudigt het proces door de behoefte aan biologische agentia in cleanrooms te elimineren.
- Toekomstige toepassingen kunnen verschillende celtypen en patronen voor onderzoek omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode voor celpatronering, die compatibel is met microfabricage, maakt een nauwkeurige ruimtelijke controle van celadhesie op substraten op siliciumbasis mogelijk, wat de ontwikkeling van reproduceerbare in vitro modellen voor neurowetenschappen en ziekteonderzoek ondersteunt. Door integratie met standaard halfgeleiderprocessen faciliteert het de creatie van schaalbare platforms die compatibel zijn met multi-elektrode-arrays en lab-on-a-chip-systemen. De aanpak vermindert het risico op contaminatie in cleanroom-omgevingen en maakt onbeperkte opslag van gepatroneerde chips vóór activering mogelijk, waardoor de flexibiliteit van de workflow in discovery-settings wordt vergroot.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van precieze ruimtelijke organisatie van neurale of gliale netwerken om padspecifieke interacties te bestuderen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door cellulaire responsen te isoleren in gedefinieerde micro-omgevingen, waardoor verstorende variabelen bij fenotypische screening worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in gegevens over target-engagement door gecontroleerde co-kweek of assays met repulsieve grenzen mogelijk te maken die de weefselarchitectuur nabootsen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde, compatibele substraten voor microfabricage die geschikt zijn voor high-content imaging en elektrofysiologische read-outs in MEA-geïntegreerde workflows.
- Reproduceerbaarheid: Levert getrouwheid van patronen op micronniveau via fotolithografie, wat een consistente positionering van cellen over replicaten waarborgt voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Maakt batchfabricage en onbeperkte opslag van chips mogelijk, waardoor assays op aanvraag kunnen worden ingezet zonder herhaalde cleanroom-verwerking.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-modellering: Ondersteunt het onderzoek naar cellulaire fysiologie in neurologisch relevante systemen, waaronder primaire menselijke glioom-afgeleide stamcelachtige cellen en muis-hippocampale neuronen.
- Translationele continuïteit: Maakt de overgang mogelijk van fenotypische screening in de ontdekkingsfase naar preklinische validatie met behulp van consistente substraatplatformen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de rol van cel-specifieke adhesiemoleculen bij patroonvormingsresultaten, wat de doelwitselectie op basis van biologische relevantie ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, vanaf vroege targetvalidatie via assayontwikkeling tot preklinische modellering, in het bijzonder voor neurotherapeutische en oncologie-gerelateerde targets waarbij de ruimtelijke cellulaire organisatie de functie bepaalt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door gecontroleerde co-cultuur of ontwerpen met afstotende grenzen mogelijk te maken, om cellulaire communicatie en padmodulatie te verduidelijken.
- Screening: Levert assay-klare substraten met kwantitatieve resultaten via live-cell imaging of immunofluorescentie, wat de vergelijking van effecten van verbindingen onder gepatronde condities vergemakkelijkt.
- Analytics: Genereert ruimtelijk opgeloste read-outs (bijv. GFAP-kleuring, confluentiemetrieken) die statistische vergelijking van cellulair gedrag in gedefinieerde micro-omgevingen ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinisch werk door het gebruik van ziekterelevante celtypen (bijv. menselijke glioma-stamcelachtige cellen) en patronen die de weefselarchitectuur nabootsen.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vertegenwoordigt een herbruikbare microfabricatiecapaciteit in plaats van een eenmalig protocol, compatibel met standaard waferverwerking en cleanroom-infrastructuur.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit in cellulaire responsen te verminderen via ruimtelijk gedefinieerde culturesystemen.
- Operationele waarde: Verbetert standaardisatie en reproduceerbaarheid door fotolithografische precisie en serumgebaseerde activatie, onafhankelijk van biologische introductie in een cleanroom.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroegtijdige risicoreductie van targets mogelijk te maken op basis van gedrag in fysiologisch relevante ruimtelijke contexten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door gegevens te leveren uit modellen die de organisatie op weefselniveau en de cellulaire heterogeniteit beter weerspiegelen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microfabricage, fotolithografie en vacuümdepositiesystemen voor paryleen-C coating en patroonvorming.
- Afhankelijk van toegang tot cleanroomfaciliteiten, mask-aligners, zuurstofplasma-etsers en spectroscopische reflectometers voor procesbeheersing.
- Maakt gestandaardiseerde activeringsprotocollen noodzakelijk (piranha-oplossing gevolgd door serumincubatie) om consistente resultaten van de patroonvorming over verschillende batches te garanderen.
- Vereist aanpassing van de celplatingdichtheid en incubatietijden op basis van celtype-specifieke adhesie-eigenschappen en patroongeometrie.
- Beperkte universaliteit over verschillende celtypen vanwege de afhankelijkheid van endogene adhesiemoleculen, waardoor empirische validatie voor nieuwe modellen noodzakelijk is.
