High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van neuronale anti-D2R- of NMDA-R-antilichamen in patiëntmonsters met behulp van een high-throughput flowcytometrie-celgebaseerde assay. Dit wordt bereikt door de volledige cDNA-sequentie van menselijke D2R of NMDA-R in een plasmide te kloneren. Als tweede stap wordt een menselijke cellijn getransfecteerd, wat leidt tot de expressie van neuronale antigenen op het celoppervlak.

Vervolgens worden de getransfecteerde cellen geïncubeerd met patiëntenserum en een passend secundair antilichaam voorafgaand aan de flowcytometrie-acquisitie. Om de binding van antilichamen aan celoppervlak-antigenen te detecteren, worden de resultaten verkregen op basis van flowcytometrie-analyse. Onze high-throughput flowcytometrie-assay op basis van cellen met drie poorten is snel, kwantitatief en efficiënt voor grote cohorten patiëntensamples.

Dit is een aanzienlijk voordeel ten opzichte van het gebruik van een celgebaseerde assay met immunochemie en confocale analyse. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het verlies van cellen tijdens het experiment om het juiste aantal cellen bij de flowcytometer te verkrijgen. Let erop dat u tussen de wasstappen geen cellen aspireert.

Selecteer een expressievector die geschikt is voor de expressie van transmembraaneiwitten en die de cellulaire co-expressie van de antigenen en het groen fluorescent eiwit afzonderlijk mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, deze vector bevat een verbeterde GFP-reporter onder controle van een internal ribosome entry site. Subcloneer het volledige menselijke CD NA in de vector met behulp van de juiste restrictie-enzymen. Nadat de klonen via sequencing zijn geverifieerd, worden plasmidvoorraden gemaakt die geschikt zijn voor gebruik in transfectieculturen. De HEK 2 93-cellen in compleet DMEM met 10% foetaal runderserum.

Oogst de cellen met trypsine, centrifugeer de cellen na één wasbeurt en resuspendeer de celpellet in vers compleet DMEM. Tel de cellen en zaai vervolgens culturen van twee milliliter uit in zes-wells platen bij een confluentie van ongeveer 70%. Wijs de wells met HEK 293-cellen toe voor transfectie met de expressieconstructen alsmede de controlevector. Bewaar enkele niet-getransfecteerde HEK 293-cellen voor latere compensatie.

Bereid de transfectiemengsels voor bestaande uit 200 µL 0,9% natriumchloride, 2,5 µg DNA en vier µg/mL polyethyleen. Vortex direct gedurende 10 seconden en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur voordat het transfectiemengsel aan elke put met twee mL vers compleet dmm wordt toegevoegd. Dek de plaat af, wikkel de zijkanten in Parafilm en centrifugeer 5 minuten bij 280 ×g om de celtransfectie te bevorderen.

Verwijder vervolgens de parafilm en plaats de plaat gedurende 18 uur onder kweekcondities. Vervang het kweekmedium door vers compleet DMEM en houd dit nog eens 72 uur in kweek. Om de cellen los te maken, voegt u 500 µL TrypLE toe aan elke put en incubeert u dit ongeveer vijf minuten bij 37 °C.

Resuspende vervolgens de cellen van elke put in twee milliliter 2% FBS in PBS en breng de cellen na drie wasbeurten over naar een conische buis. Resuspende de celpellets op 1 miljoen cellen per milliliter in de 2% FBS-oplossing. Ontwerp nu het 96-wells sjabloon voor flowcytometrie-acquisitie zodanig dat de verschillende cellijnen worden behandeld met elk patiëntmonster of primaire antilichaam.

Zaai vervolgens 50 000 cellen per putje in een V-bodem 96-well plaat en pelletteer de cellen door te centrifugeren bij 450 Gs gedurende vijf minuten. Kantel de plaat onder een hoek en verwijder voorzichtig het supernatant, waarbij u er op let niet de celpellet weg te aspireren. Voeg daarna een seriële verdunning van het primaire antilichaam toe om de antigene oppervlakteexpressie te beoordelen.

En vervolgens, om antilichamen in patiëntmonsters te detecteren, worden de cellen na drie wasbeurten in 170 µL van een 2% FBS-oplossing één uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd; voeg daarna het juiste AF 6 47-geconjugeerde secundaire antilichaam toe: anti-human IgG voor de patiënt en anti-US. IgG voor de primaire antilichamen. Hybrideer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker na drie wasbeurten.

Resuspendeer de cellen in 35 µL 2% FBS-oplossing voor de flowcytometrie-acquisitie op de flowcytometer. Stel eerst de high-throughput sampler in. Verzamel 10.000 events per well volgens het acquisitiesjabloon voor flowcytometrie.

Exporteer de gegevens en analyseer deze vervolgens met een softwarepakket voor flowcytometrie; selecteer de levende HEK 2 93 cellen op basis van de forward scatter. Selecteer daarnaast op een hoge GFP-positiviteit om uitsluitend de getransfecteerde cellen te analyseren. Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het AF 6 47 kanaal binnen de levende GFP-positieve cellen.

Exporteer vervolgens de gegevens naar Excel of Prism voor analyse. Zet de concentraties van het primaire antilichaam uit tegen de MFI die is verkregen uit de corresponderende monsters voor elke patiënt en controlemonster. Bepaal de delta MFI en bereken de drempelwaarde voor de positiviteit van het antilichaam door drie standaarddeviaties op te tellen bij de gemiddelde delta MFI van de controlegroep.

Zet vervolgens de individuele monsters, gegroepeerd per patiëntengroep, uit in een grafiek. Geef de drempelwaarde hier als een lijn weer. Cellen die ofwel de n-methyl-d-aspartaatreceptor of de dopamine-2-receptor tot expressie brachten, werden verzameld met de flowcytometer met behulp van een high-throughput sampler.

Tijdens de analyse werden de cellen gegated op basis van forward scatter voor de grootte en side scatter voor de granulariteit. GETRANSFECTEerde HK 2 9 3-cellen expresseerden het GFP-reportermolecuul in het cytoplasma en NIET-getransfecteerde cellen werden uitgesloten van de analyse binnen de GFP-positieve gate. De MFI geassocieerd met de binding van AF 6 47-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaam werd gemeten om de achtergrondfluorescentie te elimineren bij het analyseren van menselijke sera.

De delta MFI werd berekend door de achtergrond-MFI van de controlecellen af te trekken. Deze flowcytometrie-assay op basis van cellen is gebaseerd op antilichaamdetectie van het celoppervlakantigeen van belang. Bijvoorbeeld, de GK 2 93-cellen die waren getransfecteerd met het expressieplasmide voor N-M-D-A-R vertoonden een hoge expressie van de oppervlakte- en methyl-de-receptor.

Op dezelfde manier expresseerden de D2R-getransfecteerde cellen de dopamine-2-receptor, terwijl de controlecellen geen van beide antigenen expressieerden. Deze klinische studie evalueerde een patiëntcohort met NMDA-receptor-encefalitis, een patiëntcohort met D2R-antilichaam-geassocieerde encefalitis en een controlegroep met andere niet-inflammatoire neurologische aandoeningen. Merk op dat geen van de positieve patiënten dubbel positief was voor antilichamen.

Targeting van N-M-D-A-R en D2R verliep zoals verwacht. De N-M-D-A-R en D2R-antilichamen werden niet gedetecteerd in een van de geanalyseerde controles. Eenmaal beheerst, kan deze techniek na de ontwikkeling correct worden uitgevoerd in vijf uur, met één uur flow-acquisitie voor ongeveer 80 monsters.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de neuro-immunologie om nieuwe antilichaamdoelen te ontdekken bij immuungemedieerde aandoeningen.