High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Het algemene doel van het volgende experiment is om neuronale anti D twee R of N-M-D-A-R antilichamen in monsters van patiënten te detecteren met behulp van een hoogwaardige flowcytometriecel-gebaseerde test. Dit wordt bereikt door het sub klingen van de volledige CDNA-sequentie van menselijke D twee R of N-M-D-A-R binnen een plasmide. Als tweede stap wordt een menselijke cellijn getransfecteerd, wat leidt tot expressie van neuronale antigenen op het celoppervlak.

Vervolgens worden getransfecteerde cellen geïncubeerd met patiëntenserum en een geschikt secundair antilichaam voorafgaand aan flowcytometrie-acquisitie. Om antilichaambinding aan celoppervlakantigenen te detecteren, worden resultaten verkregen op basis van flowcytometrie-analyse. Onze hoogwaardige flowcytometriecel-gebaseerde test is snel, kwantitatief en efficiënt voor grote groepen patiëntenmonsters.

Dit is een aanzienlijk voordeel ten opzichte van het gebruik van een cel-gebaseerde test met immunochemie en confocale analyse. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen met het verlies van cellen tijdens het experiment om het juiste aantal cellen bij de flowcytometer te verkrijgen. Zorg ervoor dat u geen cellen aanzuigt tussen wasbeurten.

Selecteer een expressievector die geschikt is voor expressie van transmembraaneiwitten en die de cellulaire co-expressie van de antigenen en het groene fluorescerende eiwit afzonderlijk mogelijk maakt. Deze vector heeft bijvoorbeeld een verbeterde GFP-reporter onder de controle van een interne ribosomen-entry-site. Sub cloneer de volledige menselijke CD NA in de vector met behulp van de juiste restrictie-enzymen na verificatie van de klonen door middel van sequentiebepaling, maak plasmidevoorraden die geschikt zijn voor gebruik in transfectiecultuur. De HEK 2 93 cellen in volledige DMEM met 10% foetaal bovien serum.

Verzamel de cellen door trypsine na één wasbeurt, centrifugeer de cellen en suspendeer het cellenpellet opnieuw in vers compleet dmm. Tel de cellen, zaai vervolgens twee milliliter culturen in zes putjesplaten bij ongeveer 70% Co fluence. Wijs de putjes van HEK 2 93 cellen toe voor transfectie met de expressieconstructen evenals de controlevector. Bewaar een aantal getransfecteerde HEK 2 93 cellen voor latere compensatie.

Bereid de transfectiemixen voor bestaande uit 200 microliter 0,9% natriumchloride, 2,5 microgram DNA en vier microgram per milliliter polyethyleen. Direct voor 10 seconden vortexen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen voordat de transfectiemix aan elk putje van twee milliliter verse volledige dmm wordt toegevoegd. Bedek de plaat, wikkel de zijden af met perfil en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 280 GS om celtransfectie te bevorderen.

Verwijder vervolgens de parafilm en plaats de plaat vervolgens onder kweekcondities gedurende 18 uur. Vervang het kweekmedium door vers compleet DM EM en houd het in cultuur voor nog eens 72 uur. Om de cellen los te maken, voegt u 500 microliter variëer toe aan elk putje en incubeer gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Resuspendeer vervolgens de cellen van elk putje in twee milliliter 2%FBS in PBS en breng de cellen over naar een kegelvormige buis na drie wasbeurten. Resuspendeer de cellenpalletten bij 1 miljoen cellen per milliliter in 2%FBS-oplossing. Ontwerp nu de 96-putjes template voor flowcytometrie-acquisitie zodat de verschillende cellijnen worden behandeld met elk monster van de patiënt of primair antilichaam.

Zaai vervolgens 50.000 cellen per putje in een V-bodem 96-putjesplaat, pellet de cellen door centrifugatie bij 450 Gs gedurende vijf minuten. Kantel een plaat schuin en verwijder voorzichtig de supra natin, zorg ervoor dat u het cellenpellet niet aanzuigt. Voeg vervolgens een seriële verdunning van primair antilichaam toe om de antigeenoppervlakte-expressie te beoordelen.

En vervolgens patiëntenmonsters om antilichamen te detecteren, incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker na drie wasbeurten in 170 microliter 2%FBS-oplossing, voeg het geschikte AF 6 47-geconjugeerde secundaire antilichaam anti-humaan IgG toe voor de patiënt en anti-US. IgG voor primaire antilichamen. Hybridiseer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker na drie wasbeurten.

Resuspendeer de cellen in 35 microliter 2%FBS-oplossing voor de flowcytometriecel-acquisitie bij de flowcytomeeter. Stel eerst de hoogwaardige sampler in. Verwerf 10.000 gebeurtenissen per putje volgens de flowcytometrie-acquisitietemplate.

Exporteer en analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een flowcytometriesoftwarepakket. Gate de levende HEK 2 93 cellen op basis van voorwaartse binnenverstrooiing. Gate ook op hoge GFP-positiviteit om alleen de getransfecteerde cellen te analyseren. Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het AF 6 47-kanaal binnen de levende GFP-positieve cellen.

Exporteer vervolgens de gegevens naar Excel of prism voor analyse. Plot de concentraties van primair antilichaam versus de MFI verkregen uit de corresponderende monsters voor elke patiënt en controlemonster. Bepaal de delta MFI, bereken de drempel van de antilichaampositiviteit door drie standaarddeviaties boven de gemiddelde delta MFI van de controlecohort toe te voegen.

Plot vervolgens de individuele monsters, gegroepeerd volgens de patiëntengroep, op een grafiek. Stel de drempel voor als een lijn hier. Cellen die het n methyl de aspartaatreceptor of dopamine twee receptor tot expressie brengen, werden verkregen bij de flowcytomeeter met behulp van een hoogwaardige sampler.

Tijdens de analyse werden cellen gegate op basis van voorwaartse verstrooiing voor grootte en op zijwaartse verstrooiing voor korreligheid. TRANSFECTERED HK 2 9 3 cellen drukten het GFP-reportermolecuul uit in het cytoplasma en UNT getransfecteerde cellen werden uitgesloten van analyse binnen de GFP-positieve gait. De MFI geassocieerd met AF 6 47-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaambinding werd gemeten om de achtergrondfluorescentie te elimineren bij het analyseren van