Name: High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer een high-throughput flowcytometrie-celgebaseerde test voor het detecteren van antilichamen tegen NMDA-R en D2R in patiëntmonsters. Deze methode verbetert de diagnose van immuungemedieerde neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Australische National Health en Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australië), Gilles de la Tourette syndroom Association (USA), De Trish Multiple Sclerose Research Foundation en Multiple Sclerose Research Australië, Petre Foundation (Australië), de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australië). Wij danken alle patiënten en familieleden die monsters voor onze studie verstrekt.

<html> 1. Subkloning strategie om Construct pIRES2-EGFP vector Encoding D2R of NMDAR <ol><li> Verkrijgen volle lengte cDNA kloon van humaan D2R of NMDAR subunit 1 (NR1). </li><li> Kies een expressievector, zoals pIRES2-EGFP, die geschikt is voor expressie van transmembraan eiwitten met een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) reporter onder controle van een interne ribosoom toegangsplaats (IRES), zodat beide antigenen en GFP te coexpressed in cellen afzonderlijk. </li><li> Subkloon humane cDNA in pIRES2-EGFP vector. <ol><li> Om cDNA subkloneren, gebruik dan geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld Nhel en Xhol voor menselijke D2R cDNA). </li><li> Ligeer cut cDNA te voegen binnen de beperkte pIRES2-EGFP vector. </li><li> Sequentie geligeerd pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector te controleren of de vector bevat de juiste volgorde. </li><li> Zuiveren en versterken pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector voor later gebruik in transfectie. </li></ol></li></ol>TITEL &quot;&gt; 2. HEK293 celtransfectie voor Expressie van Neuronale Antigen <ol><li> Cultuur HEK293 cellen in weefselkweek kolven met verse Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) compleet met 4,5 g / L D-glucose, L-glutamine en 110 mg / l natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM GlutaMAX en 50 ug / ml Gentamicine. </li><li> Los HEK293 cellen met behulp van trypsine en overbrengen in een conische buis. <ol><li> Was cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in vers compleet DMEM. </li></ol></li><li> Tel de cellen en zaden 6 putjes op ongeveer 8 x 10 5 cellen / putje en cultuur overnacht in 2 ml DMEM bij 37 ° C en 5% CO2 in een incubator. </li><li> Zodra ze ongeveer 70% confluentie bereikt, transfecteren de HEK293 cellen met pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + cellen), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellen) en pIRES2-EGFP (HEK293 CTL cellen; vectorbesturing) als volgt.Houd enkele ongetransfecteerde HEK293 cellen tot schadevergoeding later. <ol><li> Bereid het vereiste volume transfectiemengsel omvattende 2,5 ug DNA, 200 gl 0,9% natriumchloride en 4 ug / ml polyethyleenimine / putje (elk 2 ml vers compleet DMEM). </li><li> Onmiddellijk geschud mix voor 10 seconden en geïncubeerd bij kamertemperatuur (KT) gedurende 10 minuten, voor het toevoegen volume transfectiemengsel aan de geschikte putjes. </li><li> Bedek de plaat, wikkel de zijkanten met Parafilm, en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten tot celtransfectie helpen. </li><li> Verwijder de Parafilm en plaats in de incubator om de cultuur bij 37 ° C. </li><li> Vervang voedingsbodems 18 uur later met verse volledige DMEM, en in cultuur te behouden voor een ander 72 uur. </li><li> Optioneel: 72 uur na transfectie, kan getransfecteerde cellen door kweek worden geselecteerd compleet DMEM gesupplementeerd met 250 ug / ml Geneticine, teneinde een polyklonaal stabiele transfectant verkrijgen. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor de opsporing van RNA van Surface neuronale antigenen <ol><li> Maak HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + en HEK293 CTL-cellen door incubatie met 500 ul / putje Versene gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 ° C. <ol><li> Resuspendeer in 2ml/well PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) aangevuld met 2% FBS (PBS / FBS) en overbrengen in een 15 ml of 50 ml conische buis. </li><li> Was de cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in 15-50 ml PBS / FBS. Herhaal wassen 2x. </li><li> Tel de cellen en resuspendeer in PBS / FBS 1 x 10 6 cellen / ml. </li></ol></li><li> Ontwerp van de 96-well template voor flowcytometrie verkrijgen, aangezien HEK293 D2R + en HEK293 NMDAR + cellen, evenals CTL HEK293 cellen moeten worden geïncubeerd met elke patiënt monster of primaire antilichaam. </li><li> Zaadcellen in een V-bodem 96-well plaat bij 50.000 cellen / weII volgens de flowcytometrie acquisitie sjabloon. </li><li> Pellet de cellen door centrifugeren van het 96-well plaat bij 450 xg gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant met behulp van elektronische of handmatige multichannel pipet, kantelen van de plaat op een hoek en verzorgen de celpellet niet te zuigen. </li><li> Incubeer HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + en HEK293 CTL cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker met: <ol><li> Seriële verdunningen van het primaire antilichaam om antigeen oppervlakte-expressie beoordelen. </li><li> Patiëntmonsters om antilichamen te detecteren. </li></ol></li><li> Gebruik de juiste flowcytometrie compensatie controles, bijvoorbeeld. ongekleurde getransfecteerde HEK293 cellen, GFP + HEK293 cellen (AF647 -) en getransfecteerde AF647 + HEK293 cellen (GFP). </li><li> Was de cellen door centrifugeren bij 450 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in 170 ul PBS / FBS. Herhaal wasstap twee keer. </li><li> Incubeer cellen gedurende 1 uurr bij kamertemperatuur in het donker met 1:100 verdunning van AF647-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-humaan IgG patiënt serum en anti-muis IgG voor anti-NR1 of anti-D2R primaire antilichamen). </li><li> Was de cellen drie keer, zoals in stap 3.7 en resuspendeer in 35 ul PBS / FBS voor flowcytometrie cel acquisitie. </li><li> Stel de high-throughput sampler (HTS) op de flowcytometer (BDLSRII). </li><li> Verwerven 10.000 evenementen / goed volgens de flowcytometrie overname sjabloon. </li><li> Export en vervolgens analyseren van gegevens voor analyse met behulp van een flowcytometrie softwarepakket, zoals FlowJo v7.5: <ol><li> Ten eerste, de poort van de live-HEK293 cellen op basis van forward (grootte) en zijkant (granulariteit) verstrooit. </li><li> Verder poort levende HEK293 cellen op basis van hoge GFP-positiviteit alleen de getransfecteerde cellen te analyseren. </li><li> Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de AF647 kanaal binnen de live GFP-positieve cellen. </li><li> Gegevens exporteren naar Excel of Prism voor analyse: <ol><li> Perceel concentrations primaire antilichaam (anti-NMDAR of anti-D2R antilichaam) ten opzichte van de MFI verkregen uit de cellen geïncubeerd met deze antilichamen. </li><li> Voor elke patiënt en controle monster bepalen ΔMFI door van de MFI van de CTL HEK293 cellen van de MFI van de HEK293 D2R + en HEK293 NMDAR + cellen. </li><li> Bereken de drempel van antilichaam positiviteit door toevoeging van drie standaardafwijkingen boven de gemiddelde ΔMFI van de controle cohort. </li><li> Plot individuele monsters gegroepeerd volgens hun serum tekst op een grafiek en vertegenwoordigen de drempel als een lijn. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+GABA%28B%29+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures%3A+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
<li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li>
<li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides%3A+clues+for+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li>
<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
<li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li>
<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Belangenconflict: Een octrooi is ingediend door FB en RCD (Universiteit van Sydney) claimen D2R als doelwit voor auto-antilichamen.

Dit document beschrijft een nieuwe toepassing van flowcytometrie levende cellen gebaseerde test om antilichamen gericht op specifieke celoppervlak neuronale eiwitten met behulp van een high-throughput sampler detecteren. Met behulp van deze techniek, we melden dat een subgroep van patiënten die lijden met auto CNS ziekten hebben serum antilichamen tegen NMDAR oppervlak of aan de oppervlakte D2R. Essentiële stappen voor optimale detectie-antilichaam met deze high-throughput doorstroomcytometr...

In de afgelopen jaren hebben auto-vormen van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geïdentificeerd. Aangetoond is dat deze ziekten geassocieerd zijn gedefinieerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze antilichamen binden aan receptoren neuronale en synaptische proteïnen betrokken bij neurotransmissie 1,2. Verschillende antigenen werden gedetecteerd, zoals N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) 3-5, γ-aminoboterzuur B receptor (GABA B) receptor 6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor 7, voltage-gated kalium kanaal (VGKC) geassocieerde eiwitten: leucine-rich-glioom geactiveerd 1 eiwit (LGL-1) en-contactine geassocieerd proteïne 2 (capsr2) 8,9, glutamaat receptor 5,10 en dopamine-2-receptor (D2R) 11. In het verleden zijn deze auto in het centraal zenuwstelsel (vooral genoemd encefalitis) waren vaak niet gediagnosticeerd en onbehandeld. Deze nieuwe afweerstoffen, bijv.NMDAR antilichaam of D2R antilichaam, zijn aanzienlijk verbeterd diagnose en bewustzijn, en hebben behandelingsopties voor patiënten geopend. Inderdaad, is vroege behandeling met immuuntherapie geassocieerd met een verbeterde uitkomst 11,12. Traditionele methoden om antilichamen, zoals enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) en Western blot detectie zijn gebruikt voor de detectie van antilichamen in sera. Echter, ze niet gemakkelijk in staat de erkenning van extracellulaire of oppervlakte-epitopen en, in plaats daarvan kan immunoreactiviteit naar een intracellulaire epitoop onthullen. Bovendien antilichamen die binden aan het extracellulaire domein van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij neurotransmissie waarschijnlijk pathogeen 2,3,7,13,14 zijn. Daarom is de ontwikkeling van nauwkeurige en gevoelige assays om relevante celoppervlak of extracellulaire targets voor antilichamen bij patiënten ontdekken staat voorop. De gouden standaard methode het gebied is gebaseerd op het gebruik van levende cellen in de zogenaamde &quot;cel-based assays &quot;. Deze werkwijze omvat de expressie van een antigeen op het oppervlak van zoogdiercellen (meest humane embryonische nier 293 (HEK293) cellen) in zijn natieve vorm door transfectie van vectoren die de volledige cDNA-sequentie van het antigeen van belang. Nonpermeabilized levende cellen worden vervolgens geïncubeerd met verdund patiënt serum en vervolgens fluorochroom-geconjugeerde anti-humaan immunoglobuline (Ig) secundair antilichaam. De intensiteit of het niveau van fluorescentie wordt vervolgens gedetecteerd en is gekoppeld aan het niveau van auto-antilichaam binding. Deze techniek is specifiek, aangezien slechts een antigeen tot overexpressie wordt gebracht in cellen. De meest gebruikte &quot;read-out&quot; heeft confocale microscopie analyse geweest na immunocytochemie 4,5,8-10. Echter, flowcytometrie celgebaseerde proeven zijn met succes gebruikt om antilichamen te detecteren bij patiënten met demyelineringsziekten 15-17. Vooral Waters et al.. 15 vergeleek de opsporing van antilichamen met een panel antilichaam detectietechnieken zoals celgebaseerde proeven gevolgd door microscopie of flowcytometrie geanalyseerd en blijkt flowcytometrie celgebaseerde analyse de meest gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare methode. Daarom flowcytometrie celgebaseerde analyse is voordelig omdat het kwantitatief, niet onderzoeker afhankelijk, en het gebruik van radioactieve stoffen geen sprake. Het is ook handig omdat hiermee grote patientencohorten worden getest in een korte tijd. Meer recent hebben wij een high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde assay NMDAR antilichaam en D2R opsporing van antilichamen bij patiënten met auto centrale zenuwstelsel 11 geoptimaliseerd. Heeft onze groep recent ontdekt NMDAR antilichaam in sera van patiënten met behulp van flowcytometrie-cel-gebaseerde test. Deze NMDAR antilichaam-positieve sera waren eerder geanalyseerd met confocale microscopie en bleken ook positief te zijn 11. Dit protocol beschrijft een doorstroomcytometrie-cellen gebaseerde assay voor de detectie van conformation-gevoelige CNS antilichaam in serum van de patiënt met behulp van een geautomatiseerde high-throughput sampler.

<table><tbody><tr><td>pIRES2-EGFP vector</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td><td>Missouri S&amp;T cDNA Resource Centre</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td><td></td><td></td><td>Gift van Prof A. Vincent&nbsp; (Oxford, UK)</td></tr><tr><td>Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine en 110 mg/L sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticine</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) met Fenol Rood</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Natriumchloride</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10481220001</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid&nbsp;Plus&nbsp;Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam van apparatuur/software</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Model/Versie</td></tr><tr><td>Flow cytometer met high-throughput sampler systeem</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII met HTS</td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (met kwiklamp en U-RFLT50 voeding)</td></tr><tr><td>Elektronische multikanaalspipet (15-300 &mu;l)</td><td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12-kanaals Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen conische buizen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekkolf (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V-bodem 96-well plate</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

high-throughput flowcytometrie-cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen n-methyl-d-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

De afgelopen jaren hebben antilichamen tegen oppervlak en conformationele proteïnen betrokken bij neurotransmissie waargenomen bij auto CNS aandoeningen bij kinderen en volwassenen. Deze antilichamen zijn gebruikt om te leiden diagnose en behandeling. Cel-gebaseerde testen hebben de detectie van antilichamen in het serum patiënt verbeterd. Ze zijn gebaseerd op de oppervlakte expressie van hersenantigenen op eukaryotische cellen, die vervolgens geïncubeerd met verdunde sera gevolgd door fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na wassen wordt voortgezet antilichaambinding vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Onze groep heeft een high-throughput flowcytometrie levende cellen gebaseerde test ontwikkeld om betrouwbaar te detecteren antilichamen tegen specifieke neurotransmitter receptoren. Deze stroom cytometrie methode is eenvoudig, kwantitatief, efficiënt en het gebruik van een high-throughput sampler systeem maakt grote patientencohorten gemakkelijk worden getest in een korte tijd. Bovendien, deze cel-gebaseerde alszegt kan gemakkelijk worden aangepast aan antilichamen vele verschillende antigene doelen, zowel het centrale zenuwstelsel en de periferie. Het ontdekken van extra nieuwe afweerstoffen zal een snelle en nauwkeurige diagnose mogelijk te maken en het verbeteren van de behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

Wonen HEK293 D2R + en HEK293 CTL-cellen werden verkregen bij de flowcytometer behulp van een high-throughput sampler. Tijdens de analyse werden de cellen gated gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (grootte) en zijwaartse verstrooiing (granulariteit) parameters (figuren 1A en 1D). Getransfecteerde HEK293 cellen brachten het reportermolecuul, GFP in het cytoplasma en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten van de analyse (figuren 1B en <stro...

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van neuronale anti-D2R- of NMDA-R-antilichamen in patiëntmonsters met behulp van een high-throughput flowcytometrie-celgebaseerde assay. Dit wordt bereikt door de volledige cDNA-sequentie van menselijke D2R of NMDA-R in een plasmide te kloneren. Als tweede stap wordt een menselijke cellijn getransfecteerd, wat leidt tot de expressie van neuronale antigenen op het celoppervlak.Vervolgens worden de getransfecteerde cellen geïncubeerd met patiëntenserum en een passend secundair antilichaam voorafgaand aan de flowcytometrie-acquisitie. Om de binding van antilichamen aan celoppervlak-antigenen te detecteren, worden de resultaten verkregen op basis van flowcytometrie-analyse. Onze high-throughput flowcytometrie-assay op basis van cellen met drie poorten is snel, kwantitatief en efficiënt voor grote cohorten patiëntensamples.Dit is een aanzienlijk voordeel ten opzichte van het gebruik van een celgebaseerde assay met immunochemie en confocale analyse. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het verlies van cellen tijdens het experiment om het juiste aantal cellen bij de flowcytometer

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes an immunoassay technique using fluorescent magnetic beads or microspheres coupled with different antigens to simultaneously detect various antibody isotypes in a serum sample. The assay is helpful in understanding seroconversion during an infection or post-vaccination.

Multianalyte Immunobead Assay: A Flow-Based Immunoassay Technique for Concurrent Detection of Multiple Antibody Subtypes in Human Serum Sample

This video demonstrates a technique for identifying antibodies against specific antigens in a sample using a rat hippocampal neuronal culture. By exposing cultured neurons to patient samples containing autoantibodies targeting N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs), the presence of autoantibodies bound to the neuronal surface is revealed through immunostaining.

An Assay to Detect Autoantibodies in Human Serum using a Hippocampal Neuronal Culture

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer een high-throughput flowcytometrie-celgebaseerde test voor het detecteren van antilichamen tegen NMDA-R en D2R in patiëntmonsters. Deze methode verbetert de diagnose van immuungemedieerde neurologische aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum (Video) | JoVE Journal

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Meer video's verkennen