Name: Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Leer biologische assemblages in vloeistof beelden met transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode gebruikt affiniteitscapture-microchips om rotavirusdeeltjes vast te leggen en hun dynamisch gedrag bij nanometerresolutie te observeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Dr. Michael J. Friedlander, directeur van het Virginia Tech Carilion Research Institute voor het aanmoedigen van onze onderzoeksinspanningen. Dit project werd ondersteund door ontwikkelingsfondsen aan S.M.M en D.F.K. en gedeeltelijk door het Nano-Bio initiatief van het Institute for Critical Technology and Applied Science van Virginia Tech.

1. Affiniteitsopnameapparaten voorbereiden16
<ol><li>Reinig de siliciumnitride E-chips door ze gedurende 2 minuten in 15 ml aceton te incuberen, gevolgd door 15 ml methanol gedurende 2 minuten (figuur 1A). Laat chips drogen onder laminaire luchtstroom.</li>
	<li>Incubeer de gedroogde chips op een verwarmde roerplaat (zonder roeren) gedurende 1,5 uur bij 150 °C en laat ze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.</li>
	<li>Gebruik Hamilton spuiten om lipidemengsels samen te stellen in kleine glazen buisjes om 25% chloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocholine) in chloroform (1 mg/ml) en 20% Ni-NTA lipide (1,2-dioleoyl-iminodiazijnzuur-succinyl-nikkelzout) in chloroform (1 mg/ml) te bevatten voor een totaal volume van 4 mg/ml.</li>
	<li>Breng een 1 μl aliquot van het mengsel aan over elke druppel Milli-Q water van 15 μl op een stuk Parafilm in een vochtige petrischaal (figuur 1B). Incubeer monsters minstens 60 minuten op ijs.</li>
</ol>2. Leg macromoleculen vast17
<ol><li>Plaats een E-chip met een geïntegreerde afstandsstuk van 150 nm bovenop een monolaagmonster en incubeer gedurende 1 min (figuur 1C).</li>
	<li>Til de chip voorzichtig van het monster af en voeg een 3 μl aliquot his-tagged Protein A. Incubate toe gedurende 1 min bij kamertemperatuur (Figuur 1D).</li>
	<li>Vlek de overtollige druppel weg met Whatman #1 filterpapier en voeg onmiddellijk een 3 μl aliquot antilichaamoplossing toe. Incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de overtollige oplossing met een Hamilton-spuit en voeg onmiddellijk een 1 μl aliquot rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) toe in bufferoplossing met 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 en 10 mM CaCl2. Incubeer minstens 2 minuten bij kamertemperatuur. De bereiding van DMP 's is eerder beschreven18.
</li>
</ol>3. Monteer de microfluïdische kamer en laad de in situ monsterhouder
<ol><li>Plaats de natte E-chip met het virale monster in de punt van de microfluïdische monsterhouder. Gloei een tweede platte E-chip gedurende 1 minuut en laad vervolgens bovenop de spacerchip(afbeelding 2, panelen 1-5).</li>
	<li>Als alternatief, om het contrast van biologische macromoleculen te verhogen, kan zware metaalvlek(bijv. 0,2% uranylformaat) worden toegevoegd aan natte monsters voordat de tweede E-chip op het natte monster wordt geplaatst. De E-chip die het monster bevat, moet echter worden gewassen met Milli-Q-water voordat het contrastreagens wordt toegevoegd.</li>
	<li>Sandwich het geheel samen tot een afgedichte behuizing, mechanisch op zijn plaats gehouden in de houder door 3 messing schroeven(afbeelding 2,panelen 6-8).</li>
	<li>Na montage wordt de punt van de houder met behulp van een turbogepompt drooggemaal naar10 -6 Torr gepompt voordat de houder in de TEM wordt geplaatst.</li>
</ol>4. Beeldvorming in vloeistof met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop
<ol><li>Laad de in situ monsterhouder in een Transmission Electron Microscope (FEI Company) uitgerust met een LaB6 filament en werkt bij 120 kV.</li>
	<li>Schakel de TEM-gloeidraad in en stel de eucentrische hoogte van het microscoopstadium ten opzichte van het monster in door de wiebelfunctie te gebruiken om het monster van -15° naar +15° heen en weer in de kolom te kantelen. Deze procedure past het stadium in de z-richting aan om rekening te houden met de juiste dikte van de vloeistofkamer. Deze stap zorgt er ook voor dat een nauwkeurige vergroting wordt gebruikt bij het opnemen van afbeeldingen.</li>
	<li>Neem eerst afbeeldingen op langs de randen en in de hoekgebieden van de microfluïdische kamer. Deze gebieden bevatten meestal de dunste oplossing. Neem beelden op van specimens onder lage dosisomstandigheden (1-3 elektronen/Å2) met behulp van een CCD-camera. Gebruik nominale vergrotingen van 6.000X - 30.000X.</li>
	<li>Bepaal de juiste defocuswaarde door scherp te stellen aan de rand van de vloeistofkamer. Gebruik een waarde van -1,5 μm om afbeeldingen op te nemen met een vergroting van 30.000 x. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen of als er geen contrastmiddel wordt gebruikt in het monsterpreparaat, gebruik dan hogere defocuswaarden in het bereik van -2 tot -4 μm.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat de oplossing zich tijdens de experimenten in de microfluïdische kamer bevindt, richt u de elektronenbundel totdat de bellen in de vloeistof in het apparaat worden gevormd.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

De auteur, Madeline J. Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc.

In ons gepresenteerde werk gebruikten we de affiniteitsregistratiebenadering om tether rotavirus DLL's tetheren naar een microfluïdisch platform. Dit maakte in situ beeldvorming van macromoleculaire complexen in een vloeibare micro-omgeving mogelijk. De vangstbenadering is belangrijk met betrekking tot andere microfluïdische beeldvormingstechnieken omdat het biologische exemplaren lokaliseert naar het beeldvormingsvenster om grote diffusieve problemen te ontkrachten die zich voordoen tijdens het ...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Een gemeenschappelijk doel van biologen en ingenieurs is om de innerlijke werking van moleculaire machines te begrijpen. Transmissie elektronenmicroscopen (TEM's) zijn ideale instrumenten om deze ingewikkelde details te visualiseren bij bijna-atomaire resolutie1-2. Om het hoogvacuümsysteem van een TEM in stand te houden , zijn biologische monsters doorgaans ingebed in dunne films van glasachtig ijs3, suikers4, zware metaalzouten5, of een combinatie daarvan6. Als gevolg hiervan kunnen afbeeldingen van ingesloten exemplaren slechts beperkte momentopnamen van dynamische processen onthullen.
Vroege pogingen om biologische monsters gehydrateerd in vloeibare omgevingskamers te behouden, werden uitgevoerd door Parsons en collega's met behulp van differentiële pompfasen. Elektronendiffractiepatronen van niet-aangetaste catalasekristallen werden met succes geregistreerd tot een resolutie van 3 Å in een gehydrateerde toestand7-8. Bovendien kunnen fase-gescheiden lipidedomeinen worden onderzocht in gehydrateerde membranen van menselijke erytrocyten9-10. Beweging veroorzaakt door diffusievloeistof en zijn interferentie met de elektronenbundel resulteerde echter in ernstig resolutieverlies en verdere experimenten met biologische monsters werden tot voor kort niet geprobeerd.
Nieuw ontwikkelde microfluïdische monsterhouders zijn geïntroduceerd die halfgeleidermicrochips gebruiken om een microgeschaalde milieukamer te vormen. Deze apparaten kunnen monsters in vloeistof bewaren terwijl ze in eenTEM-kolom 11-12worden geplaatst. Deze technische doorbraak in TEM-beeldvorming heeft onderzoekers in staat gesteld om voor het eerst progressieve gebeurtenissen op moleculair niveau13te bekijken. We verwijzen naar deze nieuwe modaliteit als "in situ moleculaire microscopie" omdat experimenten nu "binnen" deEM-kolom 14-15kunnen worden uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om biologische assemblages in vloeistof te beelderen om hun dynamische gedrag bij nanometerresolutie te observeren. De reden achter de ontwikkelde techniek is het registreren van real-time waarnemingen en het onderzoeken van nieuwe eigenschappen van biologische machines in oplossing. Deze methodologie breidt het gebruik van TEM's uit voor bredere doeleinden in de cellulaire en moleculaire biologie12-16.
In het huidige videoartikel presenteren we een uitgebreid protocol om een in de handel verkrijgde microfluïdische monsterhouder te assembleren en te gebruiken. Deze gespecialiseerde houders maken gebruik van siliciumnitride microchips geproduceerd met geïntegreerde afstandhouders om een vloeistofkamer te vormen die minuscule hoeveelheden oplossing omsluit. Dunne, transparante ramen zijn geëtst in de microchips voor beeldvormingsdoeleinden12. We demonstreren het juiste gebruik van een microfluïdische houder om simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLL's) in vloeistof te onderzoeken met behulp van een TEM. Om ervoor te zorgen dat biologische assemblages, zoals DMP's, niet snel over grote afstanden diffuus worden tijdens de beeldvorming, gebruiken we de Affinity Capture-benadering om ze aan het oppervlak van de microfluïdische kamer te vast temaken 16. Deze moleculaire opnamestap heeft een groot voordeel ten opzichte van alternatieve technieken voor het weergeven van biologische monsters in vloeistof, omdat het de verwerving van beelden mogelijk maakt die zullen worden gebruikt voor downstream verwerkingsroutines. Deze opnamestap die wordt gebruikt in combinatie met microfluïdische beeldvorming is uniek voor onze procedures17. Lezers die structurele biologietoepassingen gebruiken met TEM of microfluïdische beeldvormingskamers kunnen het gebruik van affiniteitsopnametechnieken overwegen wanneer dynamische observaties op moleculair niveau het einddoel zijn.

<table><tbody><tr><td>E-chips, spacer chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu;m x 50 &mu;m venster</td></tr><tr><td>E-chip, top chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu;m x 50 &mu;m venster</td></tr><tr><td>Ni-NTA lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Poedervorm</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Poedervorm</td></tr><tr><td>Volumetrische kolven&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton spuiten</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu;l; 1-25 &mu;l</td></tr><tr><td>Whatman #1 filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 stuks, 90 mm</td></tr><tr><td>Glazen Petri schotels</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipetten</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Glazen kweekbuisjes</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Electron Microcopy Sciences</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>His-getagd Proteïne A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q watersysteem</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Ultrazuiver water</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Uitrusting&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon In situ monsterhouder</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;FEI compatibel</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS CCD-camera</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp;&Aring;/pixel bemonstering bij 30.000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Dry pompstation</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Pomp houder tip tot 10-6&nbsp;bereik</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, ontlaadseenheid</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;Negatieve polariteitsmodus</td></tr><tr><td>Isotemp verwarmde roerplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Verwarmen tot 150 &ordm;C gedurende 1,5 uur</td></tr></tbody></table>

ter plaatse tem van biologische assemblages in vloeistof

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Onderzoekers gebruiken regelmatig Transmission Electron Microscopes (TEMs) om biologische entiteiten te onderzoeken en nieuwe materialen te beoordelen. Hier beschrijven we een extra toepassing voor deze instrumenten- het bekijken van virale assemblages in een vloeibare omgeving. Deze spannende en nieuwe methode voor het visualiseren van biologische structuren maakt gebruik van een recent ontwikkelde op microfluïdische basis gebaseerde monsterhouder. Ons videoartikel laat zien hoe u een microfluïdische houder kunt monteren en gebruiken om vloeibare monsters binnen een TEM in beeld te brengen. In het bijzonder gebruiken we simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DMP's) als ons modelsysteem. We beschrijven ook stappen om het oppervlak van de vloeistofkamer te coaten met affiniteitsbiofilms die DMP's aan het kijkvenster vastklappen. Dit stelt ons in staat om assemblages in beeld te brengen op een manier die geschikt is voor 3D-structuurbepaling. Zo presenteren we een eerste glimp van subvirale deeltjes in een inheemse vloeibare omgeving.

Representatieve afbeeldingen van DMP's in vloeistof met behulp van E-chips die gloeien (figuur 3A) tonen minder DMP's in een bepaald kijkgebied, vermoedelijk als gevolg van diffusie, in vergelijking met DMP's die zijn verrijkt op Affinity Capture-apparaten (Figuur 3B). De toevoeging van uranyl formate in de beeldvormingskamer verbetert het contrast van het monster en daarmee de zichtbaarheid van individuele DLL's in oplossing(figuur 3C, bovenpaneel). Een beter contrast m...

Hier beschrijven we een procedure om virale complexen in vloeistof met nanometerresolutie in beeld te brengen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Het algemene doel van deze procedure is het afbeelden van biologische assemblage en vloeistof om hun dynamische gedrag op nanometerschaal te observeren. Dit wordt bereikt door eerst siliciumnitride-microchips te prepareren met een affiniteitsvangstoppervlak, waardoor macromoleculen aan het oppervlak van de microchip kunnen worden gebonden om diffusie in de vloeistof te voorkomen. De tweede stap is het laden van biologische monsters op de microchip om rotavirusdeeltjes te rekruteren.Vervolgens wordt de microchip die de viruspartikels bevat gewassen met een contrastmiddel en daarna geplaatst in de microfluïdische monsterhouder. De laatste stap is het plaatsen van de bovenste chip en de dekplaat om een gesloten vat te vormen dat het vloeibare monster omsluit. Ten slotte worden er beelden opgenomen in de TEM om de kenmerken van het virusmonster binnen de vloeibare microkamer te onthullen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden om entiteiten in vloeistof te onderzoeken, is dat ons monster tijdens de beeldvorming niet snel over grote afstanden diffundeert dankzij de affiniteits-capturecoating die op de microchips is aangebracht. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot real-time beoordelingen van op nanodeeltjes gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen of de ontwikkeling van vaccins tegen virale pathogenen, omdat we voor het eerst kunnen zien hoe dynamische nanomachines in oplossing veranderen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij het visualiseren van biologische macromoleculen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals elektrochemische toepassingen.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het voorbereiden van affiniteitsvangstapparaten en het laden van de microfluïdische monsterhouder problematisch kan zijn voor de onervaren gebruiker. Begin met het reinigen van de siliciumnitride-chips door deze gedurende twee minuten te incuberen in 15 milliliters aceton, gevolgd door 15 milliliters methanol gedurende twee minuten.Om resterende fotolak die tijdens het productieproces is gebruikt te verwijderen, laat u de chips snel drogen onder een laminaire luchtstroom. Zodra ze droog zijn, incubeert u de chips 1,5 uur op een plaat die is verwarmd tot 150 °C. Laat ze daarna afkoelen tot kamertemperatuur.Gebruik vervolgens Hamilton-spuiten om een lipidenmengsel te bereiden in een klein glazen buisje. Voeg eerst 25% chloroform toe, gevolgd door 55% DLPC in chloroform met een concentratie van 1 mg/mL. Voeg tot slot, met een aparte spuit, 20% nikkel-NTA-lipiden in chloroform met een concentratie van 1 mg/mL toe voor een totaalvolume van 40 µL.Snijd vervolgens een stuk param op maat zodat het in een glazen Petrischaal van 100 bij 15 millimeter past, en voeg negen druppels van 15 µL Milli Q-water toe op het oppervlak van de param. Breng een aliquot van 1 µL van het lipidemengsel aan over elke druppel van 15 µL Milli Q-water en plaats de plaat gedurende ten minste 60 minuten op ijs in een vochtige omgeving, terwijl er een lipidemonolaag op het oppervlak van de druppels wordt gevormd. Plaats een EIP met een geïntegreerde spacer van 150 nm bovenop de monolaagdruppel en incubeer deze samen gedurende één minuut.Til vervolgens de chip voorzichtig van de druppel af en voeg drie µL hist-getagd proteïne A met een concentratie van 0,01 mg/mL direct toe aan het oppervlak van de chip. Incubeer de chip en proteïne A gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Blot daarna de overtollige vloeistof weg met Watman nummer 1 filterpapier en voeg onmiddellijk drie µL IgG-antilichaamoplossing met een concentratie van 0,01 mg/mL toe.Incubeer het monster gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de overtollige oplossing met een Hamilton-spuit en voeg onmiddellijk een aliquot van 1 µL rotavirus, dubbellaagse deeltjes met een concentratie van 0,1 mg/mL in een HEAPS-buffersolutie toe, en incubeer de chip gedurende ten minste twee minuten bij kamertemperatuur. Een tweede vlakke IP wordt geprepareerd door één minuut glow-discharge te passen; assembleer de microfluïdische kamer met behulp van een ST.Stereoscope door eerst de tip van de monsterkamer met O-ringen te laden.Laad vervolgens de natte E IP met het virale monster in de tip van de microfluïdische monsterhouder. Voeg daarna de glow discharge platte EIP bovenop de monster-sandwich toe en klem de gehele samenstelling samen om een afgesloten behuizing te vormen, die mechanisch in de houder wordt vastgezet met drie messing schroeven. Pomp na montage de tip van de houder af tot 10⁻⁶ tor.Laad de I two specimenhouder in een transmissie-elektronenmicroscoop die is uitgerust met een lab six filament en werkt op 120 kilovolt, waarbij een turbopomp droogpompsysteem wordt gebruikt voordat de houder in de TEM wordt geplaatst. Zet vervolgens het TEM-filament aan en stel de centrale hoogte van de microscoopstage ten opzichte van het specimen in door de wobbler-functie te gebruiken om het monster heen en weer te kantelen van min 15 graden naar plus 15 graden. Neem in de kolom beelden op met een vergroting van 6.000 tot 30.000 keer langs de randen en in de hoekregio's van de microfluidische kamer.Maak de eerste afbeelding met een CCD-camera bij lage dosisomstandigheden van één tot drie elektronen per angstrom kwadraat. Bepaal de juiste defocuswaarde door scherp te stellen op de rand van de vloeistofkamer. Gebruik over het algemeen een defocuswaarde van minus 1,5 micrometer om afbeeldingen op te nemen bij een vergroting van 30.000 keer, om ervoor te zorgen dat de oplossing zich in de microfluïdische kamer bevindt.Focus de elektronenbundel gedurende de experimenten totdat er bellen worden gevormd in de vloeistof binnen het apparaat. De hier getoonde afbeelding is gemaakt na twee minuten bij vijf elektronen per ångström kwadraat. Na vijf minuten vormden zich nog meer bellen, gloeiontlading, microchipbinding.Zeer weinig dubbellaagse deeltjes in oplossing, vermoedelijk als gevolg van diffusie. In vergelijking hiermee zijn de dubbellaagse deeltjes verrijkt op affiniteitsgedecoreerde microchips; hier getoond zijn representatieve afbeeldingen en een 3D-reconstructie van dubbellaagse deeltjes in een vloeistof die een contrastmiddel bevat. De diameter van de reconstructie is 80 nanometers.Klasse-gemiddelden van de dubbellagenpartikels en vloeistof onthulden duidelijk gedefinieerde kenmerken langs hun buitenoppervlak. De individuele panelen zijn 110 nanometers. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de E IPS in de punt van de specimenhouder te centreren en de houder te PrepU vóór het inbrengen in de elektronenmicroscoop.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het beoordelen van de transcriptionele activiteit, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: in welke mate heeft de elektronenbundel de functionele capaciteit van de virale complexen beïnvloed? Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u affinity-capture-apparaten produceert, deze decoreert met moleculaire adapters, virusmonsters in de microfluidische TEM-houder laadt en de monsters afbeeldt met behulp van cryo-elektronenmicroscopieprocedures. Vergeet niet dat werken met virale pathogenen extreem gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en een beschermende bril altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van procedures met BSL-2-pathogenen.

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We hebben een self-contained vloeibare cel die imaging doorlaat vloeistoffen met een transmissie-elektronenmicroscoop. Dynamische processen van nanodeeltjes in vloeistoffen kan worden onthuld in real-time met sub-nanometer resolutie.

Onthulling dynamische processen van de grondstoffen in vloeistoffen met behulp van vloeibare Cell Transmissie Elektronen Microscopie

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Door in situ vloeistof Scanning elektronen microscopie presenteren we een procedure voor real-time beeldvorming en elementaire samenstelling analyse van böhmiet deeltjes in gedeïoniseerd water.

In Situ Karakterisering van böhmiet deeltjes in het Water met behulp van vloeibare SEM

Hier introduceren we een experimentele protocollen voor het real-time opvolgen van een zelf-assemblage proces met behulp van vloeistof-cel transmissie-elektronenmicroscopie.

Vloeistof-cel transmissie-elektronenmicroscopie voor Tracking zelf-assemblage van nanodeeltjes

Een foto-optisch in situ microscopie apparaat is ontwikkeld om de grootte van afzonderlijke cellen direct in de celsuspensie te bewaken. De real-time meting wordt uitgevoerd door de foto-optische steriliseerbare sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Morfologische veranderingen verschijnen met afhankelijkheid van de groei toestand en de teeltomstandigheden.

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

Een protocol voor de bereiding van met grafeen ondersteunde titer vloeistof cellen voor in-situ elektronenmicroscopie van goud nano van de haucl4 precursor oplossing wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een analyse routine gepresenteerd om waargenomen etsen en groeidynamiek te kwantificeren.

Bereiding van met grafeen ondersteunde Microwell vloeistof cellen voor in-situ transmissie elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van TEM-gasreactie-experimenten met gesloten cellen in situ, terwijl we verschillende veelgebruikte monstervoorbereidingsmethoden beschrijven.

In situ gesloten-cel gasreacties uitvoeren in de transmissie-elektronenmicroscoop

Het huidige protocol beschrijft transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) modificaties met een lichtverlichtingssysteem, de fabricage van vloeibare cellen en in situ TEM-waarnemingen van door licht geïnduceerde interacties tussen bacteriële cellen en een fotosensitizer. De monstervoorbereidingsmethoden, elektronenbundelschade en beeldvorming worden ook besproken.

Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Leer biologische assemblages in vloeistof beelden met transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode gebruikt affiniteitscapture-microchips om rotavirusdeeltjes vast te leggen en hun dynamisch gedrag bij nanometerresolutie te observeren.

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

Meer video's verkennen