Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de mechanische eigenschappen en vouwingstoestanden van fusie-eiwitbindpartners te bestuderen met behulp van een FM-gebaseerde enkele molecuulkrachtspectroscopie. Dit wordt bereikt door eiwitbindpartners covalent te immobiliseren op een glazen plaat en op een A FM-cantilever om een goed gedefinieerde trekgeometrie te bereiken als een tweede stap. Het glazen oppervlak wordt geïndenteerd met de cantilever, waardoor receptor-ligandbinding kan worden gevestigd.

Vervolgens wordt de cantilever met een constante snelheid teruggetrokken om individuele eiwitdomeinen te ontvouwen en het receptor-ligandcomplex te associëren. Er worden resultaten verkregen die tertiaire structurele elementen onthullen die als energiebarrières langs de ontvouwingsroute fungeren, die worden onthuld in polymeerelasticiteitsmodellen. Verdere kinetische en energie-informatie over de bindpartners kan worden verkregen door kinetische modellen aan te passen aan het dynamische krachtspectrum. Het algemene doel van deze procedure is om de ontvouwingsroutes van eiwitten onder kracht te bestuderen.

Deze methode kan inzicht geven in de mechanische stabiliteit van eiwitten. Het kan worden toegepast op elk eiwitreceptor-ligandsysteem dat kan worden ontworpen met een toegankelijke bestandsgroep. Onderzoekers die deze methode voor de eerste keer gebruiken, worstelen omdat timing cruciaal is en het hanteren van de cantilevers moeilijk kan zijn.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het biofysicaveld te beantwoorden, zoals hoe een multi-domeineiwit zich ontvouwt om te beginnen. Plaats twee glazen deksels met een diameter van 24 millimeter en een dikte van 0,5 millimeter in een A-P-T-F-E houder en soniqueer. De deksels in een 50 op 50-mengsel van ethanol en ultrapuur water gedurende 15 minuten.

Wanneer de sonificatie voltooid is, spoelt u de deksels met ultrapuur water en etst u ze gedurende 30 minuten in een piranha-oplossing. Verwijder na 30 minuten de deksels en spoel ze met ultrapuur water en droog ze onder een zachte stroom stikstof. Dompel vervolgens de deksels onder in een 45 op vijf tot één mengsel van ethanol, ultrapuur water en drie aminopropyldimethylamino.

Plaats de ondergedompelde monsters op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten bij ongeveer 50 rotaties per minuut. Dompel vervolgens de deksel sequentieel in 100% ethanol, gevolgd door ultrapuur water, twee keer elk. Droog de deksels opnieuw onder een zachte stroom stikstof.

Eenmaal droog, bak de deksels in een oven op 80 graden Celsius gedurende 30 minuten. Bewaar de ongebruikte deksels onder Argonne gedurende maximaal zes weken om de amino-isatie van silicone cantilever-tips uit te voeren. Plaats eerst vier siliconen cantilevers op een schone glazen plaat en behandel ze gedurende 15 minuten met UV-ozon.

Dompel vervolgens de cantilevers gedurende drie minuten onder in een 50 op 50-oplossing van ethanol en drie aminopropyldimethyloxys Ilelene, samen met punt 25% ultrapuur water. Spoel vervolgens de cantilevers sequentieel gedurende 60 seconden in bakkers van tolueen, ethanol en ultrapuur water. Droog de cantilevers voorzichtig op filterpapier tussen de spoelbeurten na de laatste spoeling.

Plaats de cantilevers op een schone glazen plaat en bak ze gedurende 30 minuten op 80 graden Celsius. Bereid twee Ts van TEP diss sulfide reducerende korrels voor door eerst de punt van een 200 microliter pipettip af te snijden om de diameter te vergroten en vervolgens 100 microliter van de voorraadoplossing in elke 1,5 milliliter microbuis te pipetteren. Voeg vervolgens een milliliter TBS toe aan de TEP-korrelslurry OTTs en spoel de korrels door de microbuis kort te vortexen.

Pellet de korrels vervolgens door de monsters gedurende drie minuten bij 850 Gs te centrifugeren. Verwijder en gooi voorzichtig het supernatant weg met een micropipet en spoel de korrels nog twee keer met één milliliter TBS. Centrifugeer tussen de spoelbeurten na de laatste spoeling, voeg een geconcentreerde eiwitoplossing van drie milligram per milliliter toe aan de TEP-korrels in een verhouding van één op twee en meng de slurry voorzichtig door te roeren met een micropipettip om luchtbellen te voorkomen.

Plaats vervolgens de eiwit-TEP-korrelslurry-mengsel op een rotator gedurende 2,5 uur. Week amino-ogen cantilevers en deksels in natriumbaatbuffer bij een pH van 8,5 gedurende 45 minuten om de primaire aminegroepen op het oppervlak te deprotoneren. Verwarm vervolgens N-H-S-P-E-G malam-poeder tot kamertemperatuur en bereid 210 microliter ervan voor op 25 micromolar door het in natriumboy acht-buffer te vortexen.

De oplossing moet zo snel mogelijk worden gebruikt vanwege de extreem korte halfwaardetijd van NHS. Bij een pH van 8,5, deponeer snel druppels van 30 microliter N-H-S-P-E-G malam-oplossing op een petrischaal en 90 microliter op elke andere glazen deksel. Plaats voorzichtig de cantilevers in de druppels van 30 microliter.

Draai vervolgens de deksel zonder de druppel op een met N-H-S-P-E-G malam-oplossing om een sandwich te vormen met de N-H-S-P-E-G MALAM-oplossing. In het midden, incubeer de cantilevers en deksels met de N-H-S-P-E-G MALAM-oplossing bij kamertemperatuur gedurende één uur. Centrifugeer de TEP-korrel en gereduceerde eiwit-oplossing bij 100 GS gedurende één minuut en verzamel de snat.

Verdun vervolgens de eiwit-oplossing met TBS. Streef naar een eiwitconcentratie tijdens oppervlakteconjugatie in een bereik van 0,5 tot twee milligram per milliliter. Zet vervolgens de gereduceerde en verdunde eiwit-oplossingen een paar minuten opzij terwijl cantilevers en deksels worden gespoeld.

Spoel de deksels in drie opeenvolgende bekers met ultrapuur water. Verwijder restvloeistof van de deksels door de randen voorzichtig aan filterpapier te raken. Monteer vervolgens de deksels in een geschikte monsterhouder die compatibel is met het A FM-instrument en droog restvloeistof onder een zachte stroom stikstof.