Name: Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Verken AFM-gebaseerde single-molecule force spectroscopie om mechanische eigenschappen en vouwingstoestanden van cellulosome-eiwitten te bestuderen. Deze methode onthult energiebarrières en kinetische informatie over receptor-ligand interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen financiering van een gevorderde subsidie van de European Research Council toe aan Hermann Gaub. Michael A. Nash dankt graag de financiering van Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programma. De auteurs danken Edward A. Bayer, Yoav Barak en Daniel B. Fried aan het Weizmann Institute of Science voor het genereus verstrekken van de eiwitten die in dit onderzoek zijn gebruikt. De auteurs danken Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner en Stefan W. Stahl voor nuttige discussies.

<ol><li>Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellulosomes%3A+Multienzyme+machines+for+degradation+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides.</a> Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).</li>
<li>Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Cellulosomes+to+Cellulosomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">From Cellulosomes to Cellulosomics.</a> Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).</li>
<li>Garcı́a, R., Perez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Engel, A., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+single+biomolecules+at+work+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).</li>
<li>Li, H., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Mechanics%3A+From+Single+Molecules+to+Functional+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials.</a> Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).</li>
<li>Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).</li>
<li>Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+function%3A+probing+proteins+with+AFM-based+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+unfolding+of+individual+titin+immunoglobulin+domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM.</a> Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dissection+of+the+high-affinity+cohesin%E2%80%93dockerin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).</li>
<li>Boland, T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+hydrogen+bonding+in+DNA+nucleotide+bases+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).</li>
<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Stimuli-Responsive+Oligo%28ethylene+glycol%29+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold.</a> ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
<li>Ortiz, C., Hadziioannou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+Single+Polymer+Chains+of+Poly%28methacrylic+acid%29+Measured+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy.</a> Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+l-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of l-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).</li>
<li>Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Proteins+by+Their+Unfolding+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern.</a> Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).</li>
<li>Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+Response+of+Discrete+Semiflexible+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers.</a> Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based%2C+site-specific+and+covalent+immobilization+of+biomolecules+for+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastable+combined+atomic+force+and+total+internal+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+force+microscope+springs+optimized+for+optical-beam+deflection+and+with+tips+made+by+controlled+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture.</a> J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).</li>
<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
<li>Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+optical+spot+size+and+position+corrections+in+thermal+spring+constant+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration.</a> Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strength+of+molecular+adhesion+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic strength of molecular adhesion bonds.</a> Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om zinvolle gegevens te verkrijgen uit single molecule force spectroscopy experimenten, is het cruciaal om goed gedefinieerde en reproduceerbare trekgeometrieën te bereiken. Het hier gebruikte protocol resulteert in locatiespecifieke immobilisatie van eiwitcomplexen in een gedefinieerde trekgeometrie.
De cantilevers die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gekozen vanwege hun krachtgevoeligheid en hoge resonantiefrequentie in water. Bovendien is de kleine tipkromming van ongeveer 10 nm voo...

Cellulosomen zijn grote multi-enzymcomplexen die zichtbaar zijn op het oppervlak van anaërobe cellulytische bacteriën (bijv. C. thermocellum) die zijn geëvolueerd om plantencelbewonde lignocellulose efficiënt te depolymeriseren tot oplosbare oligosachariden1. Een centraal kenmerk van cellulosomen is de hoogwaardige cohesin-dockerin interactie. In het meest prominente paradigma wordt een sterk geconserveerd type I dockerin module van 60-75 aminozuren weergegeven aan het C-terminale uiteinde van de verschillende bacteriële enzymen. Het dockerin module dirigeert de assemblage van synergetische combinaties van enzymen op het niet-katalytische scaffold-eiwit ('scaffoldin'), dat bestaat uit een polyproteïne van cohesine domeinen die specifiek zijn voor het type I dockerin module. Op hogere niveaus kan de architectuur van cellulosomen zeer complex worden, waarbij alternatieve cohesine-dockerin paren (bijv. type II, type III) worden geïncorporeerd die de structuren aan het celoppervlak verankeren en de assemblage van vertakkingsstructuren met meerdere scaffoldinen mogelijk maken2. De verschillende cohesine-dockerin typen, ondanks gerelateerde structuren, vertonen differentiële bindingsspecificiteit, wat kruisreactiviteit onderdrukt met onbedoelde scaffoldinen of componenten van andere cellulosome-producerende bacteriesoorten. Terwijl bio-informatica benaderingen met succes duizenden unieke cellulosomale componenten op genetisch niveau hebben geïdentificeerd, zijn er relatief weinig bekende eiwitstructuren, en de mechanismen die werkzaam zijn bij de bepaling van de cohesin-dockerin specificiteit blijven een actief onderzoeksgebied binnen de structurele biologie.
Sinds de uitvinding van de atoomkrachtmicroscoop (AFM) door Binnig et al.3, zijn er verschillende operationele modi van de AFM ontwikkeld en continu verbeterd, waaronder non-contact beeldvorming, oscillatiemodus beeldvorming4, en enkele molecuulkrachtspectroscopie (SMFS)5,6. SMFS is uitgegroeid tot een veelgebruikt techniek om individuele eiwitten7-11, nucleïnezuren12-15, en synthetische polymeren16-19 rechtstreeks te onderzoeken. In een typische SMFS-experiment om receptor-ligand binding te onderzoeken20,21, is een AFM cantilever-tip gemodificeerd met een van de bindpartners, terwijl een vlakke glasoppervlak gemodificeerd is met de complementaire bindpartner. De gemodificeerde cantilever wordt dan in contact gebracht met het oppervlak waardoor de partners kunnen binden. De basis van de cantilever wordt vervolgens met constante snelheid teruggetrokken en de kracht wordt gemeten met behulp van de optische hefbomen-uitwijkingsmethode. De resulterende kracht-afstand data-traces vertonen zaagtand-achtige pieken als binding is tot stand gekomen. In gevallen waar de bindpartners zijn gefuseerd met meerdere eiwitdomeinen, kan elke piek in de kracht-afstand trace worden gecorreleerd aan het ontvouwen van een enkel eiwitdomein of gevouwen subdomein, terwijl de laatste piek overeenkomt met het breken van de eiwitbindingsinterface. De specifieke posities van de kracht-bestendige elementen kunnen worden gebruikt als een vingerafdruk om de verschillende eiwitdomeinen van belang te identificeren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke aminozuren te ondervragen die betrokken zijn bij eiwitvouwing en stabilisatie. Er zijn veel modellen in de literatuur gerapporteerd om het karakteristieke kracht-extensiegedrag dat in SMFS-experimenten wordt waargenomen, te behandelen. De meest gebruikte modellen zijn het vrij gekoppelde kettingmodel (FJC) model22, het wormachtige kettingmodel (WLC) model18,23-25, en het vrij roterende kettingmodel (FRC) model25,26.
In ons eerdere werk11, hebben we enkele molecuulkrachtspectroscopie gebruikt om de interactie van cohesine en dockerin modules te onderzoeken. Hier presenteren we een experimenteel protocol voor glasoppervlak en cantilever functionelering met enzym-dockerin en CBM-cohesine-eiwitconstructen. We presenteren ook een AFM-gebaseerd SMFS-protocol inclusief data-acquisitie en analyseprocedures. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar andere moleculaire systemen, en zou bijzonder nuttig blijken te zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in hoogwaardige receptor-ligandparen.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilane</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Disulfide reducing gel</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini silicon nitride cantilevers</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Soft batches</td></tr><tr><td>XYZ Piezoelectric actuators</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared &ldquo;broad spectrum&rdquo; IR laser</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Gegevensverzameling en -analyse</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumboraat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglazen</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml;ser</td><td></td><td>24 mm diameter, 0,5 mm dikte</td></tr><tr><td>PTFE monsterhouder</td><td></td><td></td><td>op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Sonicator-bad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>analysekwaliteit</td></tr><tr><td>Zwavelzuur (geconcentreerd)</td><td></td><td></td><td>analysekwaliteit</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (30%)</td><td></td><td></td><td>analysekwaliteit</td></tr><tr><td>Orbitaalschudder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tolueen</td><td></td><td></td><td>analysekwaliteit</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen plaatjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>geschikt voor microbuisjes</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bekers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoeken receptor-ligand systemen van de cellulosome met afm-gebaseerde single-molecule force spectroscopie

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomen zijn discrete multi-enzymcomplexen die worden gebruikt door een deel van anaërobe bacteriën en schimmels om lignocellulosische substraten te verteren. De assemblage van de enzymen op het niet-katalytische scaffold-eiwit wordt gereguleerd door interacties tussen een familie van verwante receptor-ligandparen, bestaande uit interacterende cohesie- en dockerine-modules. De extreem sterke binding tussen cohesie- en dockerine-modules resulteert in dissociatieconstanten in het bereik van lage picomolar tot nanomolar, wat nauwkeurige off-rate metingen met conventionele bulkmethoden kan belemmeren. Enkelmolecuulkrachtspectroscopie (SMFS) met de atoomkrachtmicroscoop meet het antwoord van individuele biomoleculen op kracht en is, in tegenstelling tot andere methoden voor manipulatie van enkele moleculen ( i.e. optische pincetten), optimaal voor het bestuderen van hoge-affiniteit receptor-ligandinteracties vanwege zijn vermogen om het hoge-krachtregime (>120 pN) te onderzoeken. Hier presenteren we ons volledige protocol voor het bestuderen van cellulosome eiwitassemblages op het niveau van enkele moleculen. Met behulp van een eiwittopologie afgeleid van het native cellulosome, werkten we met enzym-dockerine en koolhydraatbindingsmodule-cohesie (CBM-cohesie) fusie-eiwitten, elk met een toegankelijke vrije thiolgroep op een geëngend cysteïneresidu. We presenteren ons protocol voor plaatsspecifieke oppervlakte-immobilisatie, samen met onze meet- en data-analyseprocedure voor het verkrijgen van gedetailleerde bindingsparameters voor het hoog-affiniteit complex. We demonstreren hoe single subdomein ontvouwing krachten, complexe scheuringskrachten, kinetische off-rates en potentiële breedtes van de bindingsput worden gekwantificeerd. De succesvolle toepassing van deze methoden bij het karakteriseren van de cohesie-dockerine interactie verantwoordelijk voor de assemblage van multidomein cellulolytische complexen wordt verder beschreven.

We hebben de beschreven procedure gebruikt om een type I cohesine-dockerine-paar van C. thermocellum te onderzoeken. Na succesvolle binding van het cohesine-dockerine-paar vertoonden de geregistreerde kracht-afstandscurves karakteristieke piekpatronen. Een typische curve is weergegeven in Figuur 4a. Elke piek in de curve vertegenwoordigt de ontvouwing van één eiwit-subdomein, waarbij de laatste piek overeenkomt met de dissociatie van het receptor-ligandcomplex.
Voor h...

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de mechanische eigenschappen en vouwingsstaten van bindingspartners van fusie-eiwitten te bestuderen met behulp van FM-gebaseerde single-molecule krachtspectroscopie. Dit wordt bereikt door in een tweede stap bindingspartners van eiwitten covalent te immobiliseren op een glazen plaatje en op een FM-cantilever om een goed gedefinieerde trekkingsgeometrie te verkrijgen. Het glasoppervlak wordt geïndenteerd met de cantilever, waardoor de binding tussen receptor en ligand kan worden gevestigd.Vervolgens wordt de cantilever met een constante snelheid teruggetrokken om individuele proteïnedomeinen te ontvouwen en het receptor-ligandcomplex te associëren; de resultaten onthullen tertiaire structurele elementen die fungeren als energiebarrières langs het ontvouwingspad, welke zichtbaar worden in polymeer-elasticiteitsmodellen. Verdere kinetische en energetische informatie over de bindingspartners kan worden verkregen door kinetische modellen te fitten op het dynamische krachtspectrum. Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de ontvouwingspaden van proteïnen onder kracht.Deze methode kan inzicht bieden in de mechanische stabiliteit van eiwitten. Deze is toepasbaar op elk eiwit-receptor-ligandsysteem dat kan worden ontworpen met een toegankelijke functionele groep. Onderzoekers die deze methode voor het eerst gebruiken, kunnen tegen hindernissen aanlopen omdat de timing cruciaal is en de hantering van de cantilevers moeilijk kan zijn.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de biofysica, zoals de wijze waarop een multi-domein eiwit ontvouwt. Om te beginnen worden twee glazen dekglasjes met een diameter van 24 millimeter en een dikte van 0,5 millimeter in een P-T-F-E houder geplaatst en vervolgens gesoneerd. De dekglasjes worden 15 minuten lang gesoneerd in een mengsel van 50 tot 50 ethanol en ultrapuur water.Wanneer de sonicatie is voltooid, spoel de dekglasjes af met ultrapuur water en ets ze gedurende 30 minuten in een piranha-oplossing. Verwijder na 30 minuten de dekglasjes, spoel ze af met ultrapuur water en droog ze onder een zachte stroom stikstof. Dompel de dekglasjes vervolgens onder in een mengsel van ethanol, ultrapuur water en 3-aminopropyltriethoxysilaan in een verhouding van 45:5:1.Plaats de ondergedompelde monsters op een schudmachine bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten met een snelheid van ongeveer 50 omwentelingen per minuut. Dip het dekglas vervolgens opeenvolgend twee keer in 100% ethanol, gevolgd door twee keer in ultrapuur water. Droog de dekglazen opnieuw onder een zachte stroom stikstof.Bak de dekglasjes na het drogen in een oven bij 80 °C gedurende 30 minuten. Bewaar de ongebruikte dekglasjes onder argon tot zes weken om de aminoïsering van siliconen cantilever-tips uit te voeren. Plaats eerst vier siliconen cantilevers op een schoon glazen objectglas en behandel deze gedurende 15 minuten met UV-ozon.Dompel de cantilevers vervolgens gedurende drie minuten onder in een 50/50-oplossing van ethanol en 3-aminopropyltrimethoxysilaan, samen met 0,25% ultrapuur water. Spoel de cantilevers daarna opeenvolgend gedurende 60 seconden in bekerglazen met tolueen, ethanol en ultrapuur water. Droog de cantilevers na de laatste spoelbeurt voorzichtig op filterpapier tussen de spoelstappen door.Plaats de cantilevers op een schone glazen objectglas en bak ze 30 minuten lang bij 80 °C. Bereid twee Ts van TEP diss sulfide reducerende kralen voor door eerst de punt van een 200 µL pipetpunt af te snijden om de diameter te vergroten en vervolgens 100 µL van de stock-kralenoplossing in elke 1,5 mL microbuis te pipetteren. Voeg daarna één mL TBS toe aan de TEP-kralensuspensie-OTTs en spoel de kralen door de microbuis kortstondig te vortexen.Pellet vervolgens de beads door de monsters drie minuten lang te centrifugeren bij 850 Gs. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg met een micropipet en spoel de beads nog twee keer met één milliliter TBS. Centrifugeer tussen de spoelstappen door; voeg na de laatste spoeling een geconcentreerde eiwitoplossing van drie milligram per milliliter toe aan de TEP-beads in een verhouding van één op twee en meng het mengsel voorzichtig door te roeren met een micropipetpunt om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen.Plaats vervolgens het mengsel van de eiwit-TEP-bead-slurry op een rotator voor 2,5 uur. Week amino-eyes-cantilevers en dekglasplaatjes 45 minuten in natriumborre-buffer bij een pH van 8,5 om de primaire aminegroepen op het oppervlak te deprotoneren. Laat daarna het N-H-S-P-E-G-malam-poeder opwarmen tot kamertemperatuur en bereid 210 µL hiervan in een concentratie van 25 µM door het te vortexen in natriumborre-buffer.De oplossing moet zo snel mogelijk worden gebruikt vanwege de extreem korte halfwaardetijd van NHS. Breng bij pH 8.5 snel druppels van 30 microliter N-H-S-P-E-G malam-oplossing aan op een Petrischaal en 90 microliters op om en om op glazen dekglasjes. Plaats de cantilevers voorzichtig in de druppels van 30 microliter.Keer vervolgens het dekglas zonder de druppel om op een glas met N-H-S-P-E-G malam-oplossing, zodat er een sandwich met de N-H-S-P-E-G MALAM-oplossing wordt gevormd. Incubeer daarna de cantilevers en dekglazen met de N-H-S-P-E-G MALAM-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer de TEP-beads en de gereduceerde eiwitoplossing bij 100 GS gedurende één minuut en verzamel het supernatant.Verdun vervolgens de eiwitoplossing met TBS. Streef bij de oppervlakteconjugatie naar een eiwitconcentratie in het bereik van 0,5 tot twee mg/mL. Zet de gereduceerde en verdunde eiwitoplossingen daarna enkele minuten opzij terwijl de cantilevers en dekglasjes worden gespoeld.Spoel de dekglasjes na in drie opeenvolgende bekerglazen met ultrapuur water. Verwijder resterende vloeistof van de dekglasjes door de randen voorzichtig tegen filterpapier aan te tikken. Monteer de dekglasjes vervolgens in een geschikte monsterhouder die compatibel is met het AFM-instrument en droog resterende vloeistof onder een zachte stroom stikstof.Breng 20 µL van de verdunde eiwitoplossing als een druppel aan op het midden van de dekglasjes. Spoel de cantilevers vervolgens in drie opeenvolgende bekerglazen met ultrapuur water, gevolgd door druppels van 30 µL van de tweede verdunde eiwitoplossing. Incubeer de gepegyleerde dekglasjes en cantilevers met de respectievelijke verdunde eiwitoplossingen gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer.Gebruik vervolgens een pipet om de dekglasjes ten minste 10 keer te spoelen met één milliliter TBS en bewaar ze daarna in TBS tot aan de meting. Spoel ook de cantilevers door drie opeenvolgende bekerglazen met TBS om ongebonden eiwitten te verwijderen en bewaar deze eveneens in TBS. Monteer de gefunctionaliseerde cantilever en de glazen objectglaasjes in een AFM-model dat geschikt is voor metingen in vloeistoffen en een toegankelijk snelheidsbereik op de Z-piëzo ondersteunt van ongeveer 200 tot 5.000 nanometer per seconde.Minimaliseer bij het monteren de blootstelling aan lucht en zorg ervoor dat de oppervlakken gedurende het gehele proces met buffer bedekt blijven tijdens de juiste afstelling van de laserstraal. Laat het systeem ten minste 30 minuten equilibreren om eventuele drifteffecten te verminderen en stel indien nodig opnieuw af. Begin vervolgens met het uitvoeren van metingen zodra de cohesie succesvol is gebonden.De hier getoonde geregistreerde kracht-afstandscurves van Docker in paren vertonen een karakteristiek piekpatroon. Elke piek in de curve representeert de ontvouwing van één proteïnesubdomein, waarbij de laatste piek overeenkomt met de dissociatie van het receptor-ligandcomplex.De geregistreerde kracht-afstandscurves werden vervolgens getransformeerd naar de kracht-contourlengte-ruimte en samengevoegd in een histogram van de barrièrepositie. De gegevens tonen een toename in contourlengte van ongeveer 89 nanometers, wat ondubbelzinnig kan worden toegeschreven aan de ontvouwing van het xin-domein om het energielandschap van de cohesieve docker en de interactie te onderzoeken. In totaal werden 186 datacurves verkregen bij vier verschillende treksnelheden.Het resulterende dynamische krachtspectrum, weergegeven als grote blauwe cirkels, vertegenwoordigt de meest waarschijnlijke ruptiekrachten bij een bepaalde belastingsnelheid. Deze waarden werden vervolgens gefit volgens het Bell Evans-model; de fit leverde waarden op voor Koff en delta X, die in goede overeenstemming waren met eerder gepubliceerde resultaten. Zodra de methode onder de knie is, kan het experimentele deel van deze techniek in acht tot negen uur worden voltooid.Na deze procedure kan in een vervolgexperiment site-specifieke mutagenese worden uitgevoerd om aminozuren te bepalen die na de ontwikkeling cruciaal zijn voor binding. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de biofysica van enkelvoudige moleculen om eiwitvouwingslandschappen te verkennen. Wij gebruiken deze methode om de mechanische eigenschappen van cellulose SOE's te bestuderen, die behoren tot de meest mechanisch stabiele eiwitsystemen die bekend zijn.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u single-molecule krachtspectroscopie uitvoert op eiwitreceptor-ligandparen.

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Hier presenteren we een protocol om de kracht van de interacties tussen een goed gedefinieerde anorganische oppervlak en ofwel peptiden of aminozuren door single-molecule force spectroscopy metingen te meten met behulp van een atomic force microscope (AFM). De resultaten van de meting informatie is belangrijk voor een beter begrip van het peptide-anorganisch materiaal interfase.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.

Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.

Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Verken AFM-gebaseerde single-molecule force spectroscopie om mechanische eigenschappen en vouwingstoestanden van cellulosome-eiwitten te bestuderen. Deze methode onthult energiebarrières en kinetische informatie over receptor-ligand interacties.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Meer video's verkennen