Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van dendritische cellen en epitheelcellen uit de menselijke thymus. Dit wordt bereikt door het gedisseceerde weefsel eerst te fragmenteren via mechanische disruptie. Vervolgens worden de weefselfragmenten enzymatisch verder verteerd om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.

Ten slotte wordt de celsuspensie verrijkt voor de fractie cellen met een lage dichtheid door middel van Percoll-scheiding. Uiteindelijk kunnen de dendritische en epitheliale cellen uit deze fractie worden geïsoleerd via magnetische sortering, FACS-sortering, of een combinatie van beide. De hier gepresenteerde methode biedt een efficiënte, reproduceerbare en kosteneffectieve procedure voor de succesvolle isolatie en daaropvolgende studie van zeldzame celpopulaties, zoals dendritische cellen en thymische epitheliale cellen in de menselijke thymus.

I rotta, een promovendus van ons laboratorium, zal de procedure voor u demonstreren. Begin met het plaatsen van het thymusweefsel in een Petrischaal met steriele PBS op kamertemperatuur en spoel eventueel resterend bloed weg. Voeg vervolgens verse PBS toe aan de Petrischaal en gebruik een pincet en een schaar om bloedstolsels, bindweefsel, vetweefsel en alle delen van het weefsel die niet gezond lijken, te verwijderen.

Zodra het thymusweefsel schoon is, weegt u het voor referentie en snijdt u het weefsel vervolgens in gelijkmatige stukken van één kubieke centimeter. Bedek de stukken nu met PBS en plaats ze op ijs. Gebruik daarna de achterkant van een steriele spuitenzuiger van 10 tot 20 milliliter om snel een lichte druk op het weefsel uit te oefenen, om zo het grootste deel van de thymocyten te verwijderen en het totale volume van het te verteren weefsel te verminderen.

De oplossing wordt zichtbaar troebel. Zodra de thymocyten zijn vrijgekomen, wordt de schaal voorzichtig geroerd en wordt vervolgens een glazen aspirator gebruikt om het supernatant dat de thymocyten bevat te verwijderen, waarbij er zorgvuldig wordt opgelet dat de weefselstukjes niet per ongeluk worden geaspireerd. Het kan nuttig zijn om een steriele celkweekschraper te gebruiken om alle weefselstukjes naar één kant van de schaal te concentreren, om vervolgens de schaal onder een hoek van 45 graden te kantelen en het resterende supernatant te aspireren.

Spoel het schaaltje met verse PBS en ga door met het opvangen van het supernatant totdat de PBS relatief transparant is. Voer een laatste wasbeurt uit met RPMI en gebruik vervolgens een scherpe schaar om de weefselstukjes zo fijn mogelijk te vermalen, in ieder geval klein genoeg om in een pipet van vijf milliliter te passen om dendritische cellen of dc te isoleren. Plaats eerst tot 10 gram gemalen weefselstukjes in 50 milliliter buisjes met 10 milliliter collagenase DNA-oplossing en 10 milliliter RPMI per vijf gram weefsel.

Incubeer vervolgens de weefselsuspensie gedurende 40 minuten onder langzame rotatie in een thermische incubator bij 37 °C. De enzymoplossing zal troebel worden naarmate de cellen erin vrijkomen. Centrifugeer aan het einde van de digestie de celsuspensie gedurende twee minuten bij 110 G en kamertemperatuur om de weefselfragmenten te laten bezinken, verzamel het supernatant en pellet vervolgens de celsuspensie.

Gooi ditmaal het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 10 tot 50 milliliters compleet RPMI. Bepaal, afhankelijk van de grootte van het pellet, het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-uitsluiting en plaats de celsuspensie vervolgens bij 37 degrees Celsius met een losse dop om de thymische epitheelcellen (TEC) te isoleren. Resuspendeer daarna de weefselresten in 10 milliliters verse collagenase DNA-oplossing, plus 10 milliliters RPMI en trypsine-EDTA.

Verteer de weefselfragmenten verder gedurende 40 minuten bij 37 °C onder zachte rotatie. Voeg tijdens de laatste 10 tot 15 minuten van de incubatie foetaal kalfsserum toe in een verhouding van één op vijf om de trypsine te neutraliseren. Verzamel na het pelleten van de weefselfragmenten het supernatant en centrifugeer de cel-suspensie opnieuw.

Aspireer nu zorgvuldig het supernatant en gooi dit weg, waarbij u erop let dat het losse pellet behouden blijft. Nadat het aantal levensvatbare cellen is geteld, plaatst u deze celstuspensie eveneens bij 37 °C. Om de fractie met lage dichtheid of LDF-cellen te verrijken, begint u met het pelletteren van de celstuspensies die eerder opzij waren gezet voor DC- en tech-verrijking terwijl de cellen centrifugeren.

Stel een Percoll-dichtheidsgradiënt van 1,07 gram per milliliter op. Resuspendeer beide pellets volgens deze tabel tot 1 × 10⁹ cellen in 6 milliliter van de bereide Percoll-oplossing. Meng de celoplossing voldoende om een homogene suspensie te verkrijgen en breng de oplossingen vervolgens over in 50 milliliter Oakridge polycarbonaat centrifugebuisjes met schroefdop.

Gebruik vervolgens een pipet om langzaam 30 milliliter compleet RPMI per buis bovenop de perca-cel suspensie aan te brengen. Breng de buizen voorzichtig over naar een vooraf gekoelde centrifuge met een vaste hoekrotor, waarbij u er zorg voor draagt de lagen niet te mengen, en scheid de cellen gedurende 35 minuten. Gebruik daarna steriele posterior-pipetten om de verrijkte fracties cellen met een lage dichtheid voorzichtig van de interface tussen de perca-cel en het medium over te brengen naar 50 milliliter buizen die koud compleet RPM bevatten.

Vervolgens vul ik de buisjes met aanvullend compleet RPMI om de resterende cellen per buisje te verdunnen. Was daarna de verrijkte cellen twee keer met incompleet RPMI, resuspendeer het pellet in vers medium en bepaal het aantal levensvatbare cellen. In deze eerste figuur wordt, zoals zojuist gedemonstreerd, een vrij groot stuk weefsel van negen centimeter getoond, afkomstig van een 6-jarig kind.

Een belangrijke eerste stap is het reinigen van het weefsel van ongewenste delen. Zoals aangegeven door de witte pijlen, werd vervolgens een enkelcellsuspensie van thymusweefsel verkregen en verrijkt met cellen uit de fractie met een lage dichtheid. Hoewel een typische enkelcellsuspensie na dichtheidsgradiëntscheiding ongeveer 3% H-L-A-D-R-positieve cellen bevat, stijgt dit percentage naar 15 tot 40% in de grote cellen.

Lage-dichtheidsfractie in de hoge-dichtheidsfractie, die hoofdzakelijk bestaat uit uniforme, kleine thymocyten. Er zijn vrijwel geen van dergelijke thymische cellen aanwezig.

Myeloïde dendritische cellen kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de expressie van een aantal oppervlaktemarkers, waaronder CD 11 C. Deze figuur toont de efficiënte isolatie van CD 11 C-positieve cellen met behulp van een aangepast magnetisch celseparatieprotocol na isolatie. De zuiverheid van de CD 11 C-positieve DC was 93%, vastgesteld door immunokleuring van de geïsoleerde cellen. Gemiddeld is de opbrengst van geïsoleerde CD 11 C-positieve cellen 5 × 10⁵ tot 5 × 10⁶ myeloïde dendritische cellen per 10⁹ totale thymische cellen.

In deze tabel worden representatieve gegevens getoond die zijn verkregen uit verschillende individuele thymusmonsters van uiteenlopende leeftijd en weefselgewicht met een variërend volume aan input-cel-suspensies van enkelvoudige cellen, evenals de totale celaantallen van de fractie met lage dichtheid en de daaropvolgende opbrengst en zuiverheid van CD 11 C-positieve cellen uitsluitend in de verrijkte fractie van antigeen-presenterende cellen. Ongeveer 0,5% van de cellen zijn CD 45-lage, EPCA-positieve of CD 45-negatieve, EPAM-positieve corticale epitheelcellen; medullaire epitheelcellen kunnen worden gesorteerd uit de trypsine-verteerde CD 45-lage/negatieve verrijkte stromale cellen als respectievelijk epam-lage, CDR 2-positieve en epam-hoge, CD 2-negatieve cellen. De isolatie van dendritische cellen en subsets van thymische epitheelcellen uit de menselijke thymus.

Tijd is van essentieel belang. Hoe sneller de ululatieprocedure wordt uitgevoerd, hoe beter de conditie van de cellen. Zodra dit protocol onder de knie is, kunnen dendritische cellen binnen vijf tot zes uur en thymusepitheelcellen binnen acht tot 10 uur worden geïsoleerd.

Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe menselijk thymusweefsel moet worden behandeld voor een succesvolle isolatie van dendritische cellen en thymusepitheelcellen. De geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in diverse downstream-applicaties voor vervolgstudies, om de cellen verder te karakteriseren en hun biologie beter te begrijpen.