Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een chimeer van lymfeklieren en vetkussentjes om de bijdrage van vetweefsel aan de vorming van het stroma van de lymfeklieren te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst lymfeklieren te isoleren uit pasgeboren muizen en vetkussentjes uit muizenembryo's van dag 18,5. De lymfeklier wordt verwijderd uit het embryonale vetkussentje en vervangen door de lymfeklier van de pasgeborene.

De lymfekliervetkussen-chimera wordt samengesteld door één pasgeboren lymfeklier in vitro te herassociëren en vervolgens te kweken met één embryonale vetkussen. De chimera wordt vervolgens onder het nierkapsel van een gastmuis getransplanteerd. Drie weken na de transplantatie wordt de nier geoogst en de chimera teruggewonnen.

Uiteindelijk kan de bijdrage van de uit het vetkussen afgeleide cellen aan het stroma van de lymfeknoop worden beoordeeld via flowcytometrische analyse en immunofluorescentiemicroscopie. Het idee voor deze methode ontstond toen we zochten naar een manier om vast te stellen of cellen uit het vetkussen bijdroegen aan de vorming van de lymfeklieren. Om de inguinale lymfeklieren van pasgeborenen te isoleren: gebruik na het afzetten van de kop een schaar om het lichaam van het dier open te maken, van de bovenkant van de thoraxregio tot aan de onderkant van de abdomen.

Nadat alle ingewanden zorgvuldig uit de buikholte zijn verwijderd, wordt het lichaam in een Petrischaal van 90 millimeter geplaatst die RF 10-medium bevat. Plaats de schaal in een steriele weefkweekkast en breng het lichaam vervolgens over naar een nieuwe steriele Petrischaal van 90 millimeter met vers RF 10. Detacheer daarna zorgvuldig het peritoneum van de huid in de liesstreek en lokaliseer de inguïnale lymfeklieren, die zich bevinden op het kruispunt van drie bloedvaten in het vetkussen.

Verwijder zorgvuldig de lymfeklieren en zorg ervoor dat al het vetweefsel is verwijderd. Plaats vervolgens de lymfeklieren in een Petri-schaal van 50 millimeter met RF 10-medium op ijs om de inguinale vetkussentjes van embryo's van dag 18.5 te isoleren. Nadat de ingewanden zijn verwijderd zoals zojuist gedemonstreerd, worden de lichamen gewassen in steriele PBS om alle bloedsporen te elimineren.

Verplaats de gereinigde lichamen naar een schone Petrischaal van 90 millimeter en detach vervolgens het peritoneum, lokaliseer de inguinale lymfeknoop en verwijder deze zoals zojuist gedemonstreerd. Gooi het geïsoleerde weefsel weg. Zorg ervoor dat de volledige lymfeknoop wordt verwijderd om contaminatie van de vetkussenchimera te voorkomen.

Verwijder vervolgens het inguinale vetkussentje en plaats dit in een Petri-schaal van 50 millimeter met RF 10-medium op ijs. Om het in vitro orgaankultuursysteem op te zetten, knip je eerst wat Vulcan under wrap in stukjes van 1 tot 1,5 vierkante centimeter. Kook daarna de sponzen gedurende twee uur en de filters gedurende 20 minuten in gedestilleerd water en laat ze enkele uren drogen in een celcultuurkap.

Zodra de materialen droog zijn, plaatst u één spons in een Petri-schaal van 50 millimeter die twee milliliters medium bevat. Dompel elke spons in het medium om beide zijden te bevochtigen en plaats vervolgens één filter per in vitro orgaan culturesysteem op de grensvlak tussen vloeistof en lucht. Herassocieer daarna voorzichtig één embryonaal vetkussentje met één lymfeklier van een pasgeborene, direct bovenop elk filter.

Plaats de Petrischalen in een rechthoekige plastic bak met water op de bodem en gaten in het deksel. Plak het deksel op de bak, waarbij de gaten open blijven. Plaats de bak vervolgens in een celkweekincubator op 37 °C met 5% CO2.

Laat de box twee uur equilibreren en seal vervolgens de gaten in het deksel met tape. Incubeer de weefsels gedurende ten minste twee dagen om de lymfeklieren te laten hechten aan de vetkussentjes voordat ze, drie tot vier weken na transplantatie, onder het nierkapsel worden overgebracht. Isoleer elke chimeer van lymfeklier en vetkussentje in elke nier en dissecteer de lymfeklieren eruit.

Maak vervolgens voor elke lymfeklier met een klein schaartje één incisie in het weefsel om de enzymatische digestie te bevorderen. Plaats daarna elke lymfeklier in een individuele eppendorfbuis van 1,5 milliliter met 600 µL digestiebuffer. Incubeer de buisjes gedurende 30 minuten bij 37 °C op een agiterend warmteblok en pipetteer elke 10 minuten op en neer om de dissociatie van het weefsel te ondersteunen.

Voeg vervolgens zes µL EDTA toe aan de buizen en tritureer de cel-suspensie een paar keer om de dissociatie te voltooien. De cellen kunnen vervolgens worden gekleurd met de gewenste antilichamen en geanalyseerd worden via flowcytometrie om de expressie van het enhanced yellow fluorescent protein of EYFP te behouden. Fixeer de lymfeklieren gedurende drie tot vier uur.

Plaats vervolgens voor elke lymfeklier een enkele druppel koud OCT-compound op een klein stukje aluminiumfolie. Plaats voorzichtig één lymfeklier in het midden van elke druppel, waarbij luchtbellen worden vermeden, en leg de folie daarna op droogijs om de weefsels te bevriezen. De lymfeklieren kunnen vervolgens worden gesneden, gekleurd en geanalyseerd via fluorescentiemicroscopie.

Een zorgvuldige isolatie van de lymfeklier maakt verdere analyse mogelijk van het nageslacht van EYFP-positieve vetweefsel-afgeleide cellen. Cryosecties en immunofluorescentie-analyse van de lymfeklier tonen aan dat EYFP-positieve vetweefsel-afgeleide cellen migreren naar de lymfeklier, waar ze bijdragen aan het GP38-positieve ERTR7-positieve netwerk van stromale cellen in de lymfeklier. Flowcytometrische analyse bevestigt dat een belangrijk deel van de stromale cellen in de lymfeklier afkomstig is van lokale EYFP-positieve progenitorcellen uit het vetweefsel, die bijdragen aan 30% van de CD45-negatieve GP38-positieve CD31-negatieve fibroblastische fractie en 10% van de CD45-negatieve GP38-negatieve CD31-positieve bloedendotheelcel-fractie. Tot 80% van de CD45-negatieve GP38-positieve CD31-negatieve fibroblastische fractie kan afkomstig zijn van precursorcellen uit het vetweefsel, wat de cruciale rol van vetweefsel aantoont bij het in stand houden van de groei van het stroma van de lymfeklier. Zodra deze techniek beheerst is, kan een onderzoeker op het gebied van lymfoïde organogenese de rol verkennen van verschillende moleculen die betrokken zijn bij de vorming van het lymfoïde stroma.