Name: Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer hoe je lymfeklier-vetkussen-chimaeren genereert om de oorsprong van lymfeklier-stromacellen te bestuderen. Deze methode gebruikt pasgeboren muizen en embryonale vetkussens voor transplantatie onder de niercapsule.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar aan het personeel van de Biomedical Services Unit van de Universiteit van Birmingham voor de zorg voor onze dierkolonies. Dit werk werd ondersteund door het EU FP7 geïntegreerde project INFLACARE aan JC.

Muizen werden gefokt en onderhouden onder SPF-omstandigheden in de Biomedical Service Unit aan de Universiteit van Birmingham volgens de regelgeving van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en de lokale ethische commissie. Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, vallen onder een projectlicentie die is goedgekeurd door zowel de lokale ethische commissie als het ministerie van Binnenlandse Zaken.
1. Isolatie van pasgeboren lymfeklieren
<ol>
	<li>Offer de pasgeboren muizen door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Snijd het hoofd af en open het lichaam met een schaar vanaf de bovenkant van de thoracale regio tot de onderkant van de abdominale regio en verwijder voorzichtig alle viscera (hart, longen, lever, darm, nier, blaas) uit de buikholte.</li>
	<li>Breng het lichaam over in een 90 mm petrischaal met RF10-medium (RPMI1640-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine en 2 mM L-glutamine). Vanaf deze stap zullen de weefsels onder steriele omstandigheden worden bewaard en in een weefselkweekkap worden behandeld.</li>
	<li>Breng het lichaam over in een nieuwe 90 mm petrischaal met RF10.</li>
	<li>Los onder de dissectiemicroscoop voorzichtig het peritoneum van de huid in de inguinale regio. De inguinale lymfeklier bevindt zich op het kruispunt van drie bloedvaten in de vetkussen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de lymfeklier. Zorg ervoor dat al het vetweefsel wordt verwijderd. Breng de lymfeklier over in een 50 mm petrischaal met RF10-medium. Houd de weefsels op ijs terwijl u doorgaat met de procedure.</li>
</ol>
2. Isolatie van E18.5-vetkussens
<ol>
	<li>Om muizenembryo's op dag 18,5 van de zwangerschap (E18,5) te genereren, zet geplande zwangerschappen op door een vrouwtje en een mannetje per kooi een nacht lang te plaatsen. Scheid de muizen in de ochtend en controleer op vaginale pluggen (zwangerschapsdag E0,5).
	<ol>
		<li>Euthaniseer de geplugde vrouwtjes op dag 18,5 van de zwangerschap door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Verwijder de embryo's en plaats ze in een 90 mm petrischaal met RF10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vanaf deze stap moeten weefsels worden behandeld met behulp van steriele techniek in de weefselkweekkap. Onder de dissectiemicroscoop snijdt u het hoofd, opent u de embryo's met een schaar van de thoracale regio tot de onderkant van de abdominale regio en verwijdert u voorzichtig alle viscera (hart, longen, lever, darm, nier, blaas) uit de lichaamsholte.</li>
	<li>Reinigt het lichaam van alle overgebleven viscerale weefsels en was het in PBS om alle bloedsporen te verwijderen die de dissectie moeilijker kunnen maken.</li>
	<li>Breng de schone lichamen over in een nieuwe 90 mm petrischaal met RF10.</li>
	<li>Los voorzichtig het peritoneum van de huid in de inguinale regio op. De inguinale lymfeklier bevindt zich op het kruispunt van drie bloedvaten in het vetkussen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de lymfeklier en gooi deze weg. Het is erg belangrijk om de lymfeklier volledig te verwijderen om ervoor te zorgen dat het vetkussen dat voor de chimera's wordt gebruikt niet wordt besmet met lymfoïde stromacellen.</li>
	<li>Verwijder het inguinale vetkussen en breng het over in een 50 mm petrischaal met RF10-medium. Houd de weefsels op ijs terwijl u doorgaat met de procedure.</li>
</ol>
3. Generatie van de lymfeklier-vetkussenchimer
<ol>
	<li>Bereid het in vitro orgaankweeksysteem15 voor.
	<ol>
		<li>Bereiding van sponzen en filters: Dit kan van tevoren worden gedaan en sponzen en filters steriel worden opgeslagen in een petrischaal in de kweekkap.
		<ol>
			<li>Snij de Vulkan Underwrap in stukken van 1-1,5 cm2</li>
			<li>Kook de sponzen 2 uur in gedistilleerd water.</li>
			<li>Laat de sponzen een paar uur drogen in de celkweekkap.</li>
			<li>Kook de filters gedurende 20 minuten.</li>
			<li>Laat de filters een paar uur drogen in de celkweekkap.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereid DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 10 mM HEPES, 1x MEM Nonessential Amino Acid Solution, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine en 2 mM L-Glutamine.</li>
		<li>Voeg 2 ml medium toe aan een 50 mm petrischaal.</li>
		<li>Plaats een spons op de bodem van de petrischaal. Bevochtig beide zijden van de spons door ze onder te dompelen in het medium.</li>
		<li>Plaats een filter bovenop de spons. Het filter bevindt zich op de vloeistof-lucht-interface.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Los onder de dissectiemicroscoop voorzichtig een pasgeboren lymfeklier los van een embryonaal vetkussen.</li>
	<li>Plaats de lymfeklier-vetkussenchimer bovenop het filter.</li>
	<li>Breng de petrischaal over in een rechthoekige plastic doos met een paar gaatjes in het deksel en bevat water op de bodem om vocht te garanderen.</li>
	<li>Verzegel het deksel op de doos met plakband. Laat de twee gaatjes in het deksel open.</li>
	<li>Breng de doos over naar een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2. Laat de doos 2 uur gelijkwaardig worden voordat u de gaatjes in het deksel afsluit met plakband.</li>
	<li>Incubeer de weefsels gedurende ten minste 2 dagen om de lymfeklier toe te laten om zich aan het vetkussen te hechten en overdraagbaar te zijn onder de niercapsule.</li>
</ol>
4

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+stromal+organizer+cells+during+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development.</a> J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).</li>
<li>Cupedo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presumptive+lymph+node+organizers+are+differentially+represented+in+developing+mesenteric+and+peripheral+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes.</a> J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).</li>
<li>Avan de Pavert, S., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of lymphoid tissues.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 664-674 (2010).</li>
<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel presenteerden we een methode om de bijdrage van adipositeceln voorlopercellen aan de ontwikkeling van LK's te meten en te kwantificeren, en twee technieken die de analyse van hun nakomelingen mogelijk maken. Het dissekeren van embryonale vetkussens en pasgeboren LK's is delicaat en vereist handmatige vaardigheden die worden opgedaan door veel oefening voorafgaand aan het genereren van de daadwerkelijke LK-vetkussenchimeren. Om de kwaliteit van de dissecties te controleren, kan flow-cytometrische analyse wo...

Lymfeklieren (LK) zijn belangrijke organen van het immuunsysteem, gelegen op strategische plaatsen in het lichaam, langs het lymfatische vaatstelsel. Ze maken filtratie van antigenen en pathogenen mogelijk en bieden een locatie voor antigeenpresentatie aan lymfocyten en inductie van adaptieve immuunresponsen. Het stroma, dat de basisstructuur van de LK vormt en de beweging van de verschillende hematopoëtische deelnemers van de adaptieve immuunrespons coördineert, is centraal voor de functie van deze organen. Verschillende populaties van stromacellen leveren essentiële en specifieke signalen voor de bewegingen, lokalisatie, overleving, proliferatie en rijping van de hematopoëtische component van het immuunsysteem1-3. Stromacellen van volwassen LK vallen in drie categorieën: de bloed-endotheelcellen, de lymfatische endotheelcellen en fibroblasten. Deze drie categorieën omvatten heterogene populaties. De fibroblastische populaties bevatten fibroblastische reticulaire cellen (FRC), folliculaire dendritische cellen (FDC), marginale reticulaire cellen (MRC), terwijl de fibroblasten de capsule, het merg en andere cellen vormen die nog niet geïdentificeerd zijn1-5. De oorsprong en de mechanismen die de rijping van de verschillende LK-stromacellenpopulaties regelen, zijn onduidelijk en het ontbreken van specifieke markers die de bestemmingsmapping van specifieke LK-stromacellenpopulaties mogelijk maken, maakt hun studie bijzonder moeilijk. Een volledig begrip van de ontwikkeling van LK-stromacellen is echter noodzakelijk voor het begrijpen van adaptieve immuunresponsen, de mechanismen die bijdragen aan tolerantie en ligt aan de basis van de ontwikkeling van kunstmatige LK.
Tot nu toe is de studie van de oorsprong en ontwikkeling van LK-stromacellen meestal beperkt gebleven tot de directe beoordeling van de ontwikkeling van LK bij embryo's en pasgeborenen bij wilde muizen en verschillende knockout-muizenstammen6-9. Deze benaderingen worden beperkt door de embryonale en perinatale letaliteit van sommige muizenstammen met deleties in genen die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van LK. Bovendien zijn sommige van de genen die essentieel zijn voor de ontwikkeling van lymfoïde weefsels ook betrokken bij een breed scala aan biologische processen, zoals het geval is voor RANK10-11 of NF-κB212. Om deze problemen aan te pakken, is isolatie en transplantatie van embryonale LK's onder de niercapsule van een gastheermuis uitgevoerd12-13. Deze techniek maakt bijvoorbeeld de overdracht van genetisch gemodificeerde embryonale LK's in een wildtype-omgeving mogelijk om orgaanontwikkeling en de rekrutering en organisatie van gastheercellen te beoordelen. Echter, de groei van embryonale LK's die onder de niercapsule van een volwassen gastheer zijn getransplanteerd, is gehinderd, waardoor het gebruik van deze techniek beperkt wordt.
LK's en vetafzettingen zijn anatomisch nauw verbonden en ze ontwikkelen zich gelijktijdig tijdens de embryogenese. We hebben onlangs aangetoond dat de associatie tussen LK en vetweefsel een cruciale rol speelt bij het leveren van stromacellen voor de LK's. In het bijzonder regelt de signaaltransductie via de LTβR het lot van adipocyte-precursorcellen door adipogenese te blokkeren en in plaats daarvan rijping naar een LK-stromacellenfenotype te bevorderen14. Hier beschrijven we een methode op basis van de generatie van LK-vetkussenchimeren die het traceren van vetweefsel-afgeleide cellen in de zich ontwikkelende LK mogelijk maakt. Deze methode zal nuttig zijn om de bijdrage van vetweefsel aan verschillende LK-stromacellenpopulaties te bepalen en in combinatie met het gebruik van weefsels van genetisch gemodificeerde muizenstammen, zal een beter begrip mogelijk maken van de mechanismen die de differentiatie van de verschillende LK-stromacellensubsets regelen.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sterilin Petri Dish</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Sterilin Petri Dish</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive slides</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgM Rhodamine Red</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Podoplanin PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Podoplanin purified</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Extra fijne pincetten voor embryonale en pasgeboren dissecties</td></tr><tr><td>EDTA solution 0.5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Hardened fine iris scissors straight 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Kleine schaar voor dissectie</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Membrane Filters 0.8 &mu;m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Plastic box with lid</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E6052</td><td>Sandwichbox voor in vitro orgaancultuur. Boor twee gaten in het deksel om gasuitwisseling in de CO2-incubator mogelijk te maken.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Sponges Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Dissectiemicroscoop met zoom</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Het stroma is een essentieel onderdeel van de structuur en functie van lymfeklieren. Er is echter weinig bekend over de oorsprong, de exacte cellulaire samenstelling en de mechanismen die de vorming ervan regelen. Lymfeklieren zijn altijd omhuld met vetweefsel en we hebben onlangs de belangrijkheid van deze relatie voor de vorming van lymfeklieron stroma aangetoond. Adipocyt-precursorcellen migreren tijdens de ontwikkeling van de lymfeklieren naar binnen en bij activering van de Lymphotoxin-b receptor schakelen ze adipogenese uit en differentiëren ze in lymfoïde stromale cellen (Bénézechet al.14). Op basis van het lymfoïde stromapotentieel van vetweefsel presenteren we een methode met behulp van een lymfeknood/vetkussen chimaer die het traceren van de lijn van lymfeknoodstroma-celprecursoren mogelijk maakt. We laten zien hoe pasgeboren lymfeklieren en EYFP+ embryonaal vetweefsel geïsoleerd kunnen worden en een LN/ EYFP+ vetkussen chimaer gemaakt kan worden. Na transfer onder de niercapsule van een gastheermuis, integreert de lymfeklieren lokale vetweefselprecursorcellen en voltooit zijn vorming. Afstammingsanalyse van EYFP+ vetkussencellen in de resulterende lymfeklieren kan worden uitgevoerd door middel van flow-cytometrische analyse van enzymatisch verteerde lymfeklieren of door immunofluorescentieanalyse van cryosecties van lymfeklieren. Door vetkussens van verschillende knockout muismodellen te gebruiken, zal deze methode een efficiënte manier bieden om de oorsprong van de verschillende lymfeklieron stroma-celpopulaties te analyseren.

Drie weken na transplantatie wordt de LN/vetkussenchimeera uit de nier teruggewonnen. De chimeera vertoont nu grote overeenkomsten met een normale LN in zijn eigen vetkussen, en de LN is zichtbaar in het centrum van het vetweefsel (Figuur 1). Als de LN niet kan worden geïdentificeerd, is het mogelijk dat deze tijdens de transplantatie op de nier is verloren gegaan. Bij het beoordelen van de rol van genen die mogelijk belangrijk zijn voor de LN-ontwikkeling, kunnen de teruggewonnen LN's zeer klein blijven...

Generatie van lymfeknoop-/vetcuilchimera's voor de studie van de oorsprong van lymfeknoopstromacellen wordt beschreven. De methode omvat de isolatie van lymfeklieren van pasgeboren muizen en embryonale vetkussens, de generatie van chimerische lymfeknoop-vetkussens en hun overdracht onder de niercapsule van een gastheermuis.

Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een chimeer van lymfeklieren en vetkussentjes om de bijdrage van vetweefsel aan de vorming van het stroma van de lymfeklieren te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst lymfeklieren te isoleren uit pasgeboren muizen en vetkussentjes uit muizenembryo's van dag 18,5. De lymfeklier wordt verwijderd uit het embryonale vetkussentje en vervangen door de lymfeklier van de pasgeborene.De lymfekliervetkussen-chimera wordt samengesteld door één pasgeboren lymfeklier in vitro te herassociëren en vervolgens te kweken met één embryonale vetkussen. De chimera wordt vervolgens onder het nierkapsel van een gastmuis getransplanteerd. Drie weken na de transplantatie wordt de nier geoogst en de chimera teruggewonnen.Uiteindelijk kan de bijdrage van de uit het vetkussen afgeleide cellen aan het stroma van de lymfeknoop worden beoordeeld via flowcytometrische analyse en immunofluorescentiemicroscopie. Het idee voor deze methode ontstond toen we zochten naar een manier om vast te stellen of cellen uit het vetkussen bijdroegen aan de vorming van de lymfeklieren. Om de inguinale lymfeklieren van pasgeborenen te isoleren: gebruik na het afzetten van de kop een schaar om het lichaam van het dier open te maken, van de bovenkant van de thoraxregio tot aan de onderkant van de abdomen.Nadat alle ingewanden zorgvuldig uit de buikholte zijn verwijderd, wordt het lichaam in een Petrischaal van 90 millimeter geplaatst die RF 10-medium bevat. Plaats de schaal in een steriele weefkweekkast en breng het lichaam vervolgens over naar een nieuwe steriele Petrischaal van 90 millimeter met vers RF 10. Detacheer daarna zorgvuldig het peritoneum van de huid in de liesstreek en lokaliseer de inguïnale lymfeklieren, die zich bevinden op het kruispunt van drie bloedvaten in het vetkussen.Verwijder zorgvuldig de lymfeklieren en zorg ervoor dat al het vetweefsel is verwijderd. Plaats vervolgens de lymfeklieren in een Petri-schaal van 50 millimeter met RF 10-medium op ijs om de inguinale vetkussentjes van embryo's van dag 18.5 te isoleren. Nadat de ingewanden zijn verwijderd zoals zojuist gedemonstreerd, worden de lichamen gewassen in steriele PBS om alle bloedsporen te elimineren.Verplaats de gereinigde lichamen naar een schone Petrischaal van 90 millimeter en detach vervolgens het peritoneum, lokaliseer de inguinale lymfeknoop en verwijder deze zoals zojuist gedemonstreerd. Gooi het geïsoleerde weefsel weg. Zorg ervoor dat de volledige lymfeknoop wordt verwijderd om contaminatie van de vetkussenchimera te voorkomen.Verwijder vervolgens het inguinale vetkussentje en plaats dit in een Petri-schaal van 50 millimeter met RF 10-medium op ijs. Om het in vitro orgaankultuursysteem op te zetten, knip je eerst wat Vulcan under wrap in stukjes van 1 tot 1,5 vierkante centimeter. Kook daarna de sponzen gedurende twee uur en de filters gedurende 20 minuten in gedestilleerd water en laat ze enkele uren drogen in een celcultuurkap.Zodra de materialen droog zijn, plaatst u één spons in een Petri-schaal van 50 millimeter die twee milliliters medium bevat. Dompel elke spons in het medium om beide zijden te bevochtigen en plaats vervolgens één filter per in vitro orgaan culturesysteem op de grensvlak tussen vloeistof en lucht. Herassocieer daarna voorzichtig één embryonaal vetkussentje met één lymfeklier van een pasgeborene, direct bovenop elk filter.Plaats de Petrischalen in een rechthoekige plastic bak met water op de bodem en gaten in het deksel. Plak het deksel op de bak, waarbij de gaten open blijven. Plaats de bak vervolgens in een celkweekincubator op 37 °C met 5% CO2.Laat de box twee uur equilibreren en seal vervolgens de gaten in het deksel met tape. Incubeer de weefsels gedurende ten minste twee dagen om de lymfeklieren te laten hechten aan de vetkussentjes voordat ze, drie tot vier weken na transplantatie, onder het nierkapsel worden overgebracht. Isoleer elke chimeer van lymfeklier en vetkussentje in elke nier en dissecteer de lymfeklieren eruit.Maak vervolgens voor elke lymfeklier met een klein schaartje één incisie in het weefsel om de enzymatische digestie te bevorderen. Plaats daarna elke lymfeklier in een individuele eppendorfbuis van 1,5 milliliter met 600 µL digestiebuffer. Incubeer de buisjes gedurende 30 minuten bij 37 °C op een agiterend warmteblok en pipetteer elke 10 minuten op en neer om de dissociatie van het weefsel te ondersteunen.Voeg vervolgens zes µL EDTA toe aan de buizen en tritureer de cel-suspensie een paar keer om de dissociatie te voltooien. De cellen kunnen vervolgens worden gekleurd met de gewenste antilichamen en geanalyseerd worden via flowcytometrie om de expressie van het enhanced yellow fluorescent protein of EYFP te behouden. Fixeer de lymfeklieren gedurende drie tot vier uur.Plaats vervolgens voor elke lymfeklier een enkele druppel koud OCT-compound op een klein stukje aluminiumfolie. Plaats voorzichtig één lymfeklier in het midden van elke druppel, waarbij luchtbellen worden vermeden, en leg de folie daarna op droogijs om de weefsels te bevriezen. De lymfeklieren kunnen vervolgens worden gesneden, gekleurd en geanalyseerd via fluorescentiemicroscopie.Een zorgvuldige isolatie van de lymfeklier maakt verdere analyse mogelijk van het nageslacht van EYFP-positieve vetweefsel-afgeleide cellen. Cryosecties en immunofluorescentie-analyse van de lymfeklier tonen aan dat EYFP-positieve vetweefsel-afgeleide cellen migreren naar de lymfeklier, waar ze bijdragen aan het GP38-positieve ERTR7-positieve netwerk van stromale cellen in de lymfeklier. Flowcytometrische analyse bevestigt dat een belangrijk deel van de stromale cellen in de lymfeklier afkomstig is van lokale EYFP-positieve progenitorcellen uit het vetweefsel, die bijdragen aan 30% van de CD45-negatieve GP38-positieve CD31-negatieve fibroblastische fractie en 10% van de CD45-negatieve GP38-negatieve CD31-positieve bloedendotheelcel-fractie. Tot 80% van de CD45-negatieve GP38-positieve CD31-negatieve fibroblastische fractie kan afkomstig zijn van precursorcellen uit het vetweefsel, wat de cruciale rol van vetweefsel aantoont bij het in stand houden van de groei van het stroma van de lymfeklier. Zodra deze techniek beheerst is, kan een onderzoeker op het gebied van lymfoïde organogenese de rol verkennen van verschillende moleculen die betrokken zijn bij de vorming van het lymfoïde stroma.

generation-lymph-node-fat-pad-chimeras-for-study-lymph-node-stromal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Generatie van Lymfeklieron-vetpottenchimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfeklestreekscellen

In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.

Reaggregate Thymus Culturen

Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.

Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

De hier gepresenteerde experimentele opzet biedt een bruikbaar voortplantingsmodel voor de studies van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens lymfekliermetastase (LN), waarbij de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders wordt uitgesloten.

Drainerend lymfekliermetastasemodel voor het beoordelen van de dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens tumorigenese

Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste basaalmembraanmatrix. Basale membraanmatrixconstructies kunnen worden gebruikt in driedimensionale kweek voor het bestuderen van de ontwikkeling van organoïden, of voor in vivo transplantatie- en weefselregeneratiestudies.

Basement Membrane Matrix Ingekapselde Celaggregatie voor het onderzoeken van de vorming van miltweefsel bij muizen

Leer hoe je lymfeklier-vetkussen-chimaeren genereert om de oorsprong van lymfeklier-stromacellen te bestuderen. Deze methode gebruikt pasgeboren muizen en embryonale vetkussens voor transplantatie onder de niercapsule.

Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

Meer video's verkennen