Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

Het algemene doel van deze procedure is om een chimaera van lymfeknopen en vetkussen te genereren om de bijdrage van vetweefsel aan de vorming van het stroma van de lymfeknopen te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst lymfeknopen van pasgeboren muizen en vetkussens van muisembryo's op dag 18,5 te isoleren. Het vetkussen wordt verwijderd uit de embryonale lymfeknoop en vervangen door de pasgeboren lymfeknoop.

De chimaera van lymfeknopen en vetkussen wordt geassembleerd door een pasgeboren lymfeknoop opnieuw te associëren en vervolgens één embryonaal vetkussen in vitro te kweken. De chimaera wordt vervolgens onder de niercapsule van een gastheermuis getransplanteerd. Drie weken na de transplantatie wordt de nier geoogst en wordt de chimaera opgehaald.

Uiteindelijk kan de bijdrage van de cellen van het vetkussen aan het stroma van de lymfeknoop worden beoordeeld door flowcytometrische en immunofluorescentiemicroscopische analyse. Dus we hadden het idee voor deze methode toen we op zoek waren naar een manier om te beoordelen of cellen van het vetkussen bijdragen aan de vorming van de lymfeknopen Om pasgeboren inguinale lymfeknopen te isoleren. Na het doorsnijden van het hoofd gebruik je een paar schaar om de lichaam van het dier vanaf de bovenkant van het borstgebied tot aan de onderkant van de buik te openen.

Na het voorzichtig verwijderen van alle ingewanden uit de buikholte, plaats je het lichaam in een 90 millimeter petrischaal met RF 10 media. Plaats de schotel in een steriele weefselkweekkap en breng het lichaam vervolgens over in een nieuwe steriele 90 millimeter petrischaal met vers RF 10. Trek vervolgens voorzichtig het peritoneum los van de huid in de inguinale regio en lokaliseer de inguinale lymfeknopen op de kruising van drie bloedvaten in het vetkussen.

Verwijder voorzichtig de lymfeknopen en zorg ervoor dat al het vetweefsel wordt verwijderd. Plaats vervolgens de lymfeknopen in een 50 millimeter petrischaal met RF 10 media op ijs om de inguinale vetkussens van dag 18,5 embryo's te isoleren. Na het verwijderen van de ingewanden zoals net gedemonstreerd, spoel je de lichamen in steriele PBS om alle bloedsporen te verwijderen.

Breng de schoongemaakte lichamen over in een nieuwe 90 millimeter petrischaal en los vervolgens het peritoneum, lokaliseer de inguinale lymfeknood en verwijder deze zoals net gedemonstreerd. Gooi het geïsoleerde weefsel weg. Zorg ervoor dat je de hele lymfeknood verwijdert om besmetting van het vetkussen chimaera te voorkomen.

Verwijder vervolgens het inguinale vetkussen en plaats het in een 50 millimeter petrischaal met RF 10 media op ijs. Om het in vitro orgaankweeksysteem op te zetten, snij je eerst wat Vulcan onderfolie in stukken van één tot 1,5 vierkante centimeter. Kook de sponzen twee uur en de filters 20 minuten in gedistilleerd water en laat ze vervolgens enkele uren drogen in een celkweekkap.

Zodra de materialen droog zijn, plaats je één spons in een 50 millimeter petrischaal met twee milliliter media. Dompel elke spons onder in het media om beide kanten nat te maken en plaats vervolgens één filter per in vitro orgaankweeksysteem op het vloeibare lucht-interface. Breng vervolgens voorzichtig één embryonaal vetkussen met één pasgeboren lymfeknood direct op de bovenkant van elk filter.

Breng de petrischalen over in een rechthoekige plastic doos met water op de bodem en gaten in het deksel. Plak het deksel op de doos met de gaten open. Plaats vervolgens de doos in een celkweekincubator met een temperatuur van 37 graden Celsius en 5% CO2.

Laat de doos twee uur gelijkmatig verdelen en verzegel vervolgens de gaten in het deksel met plakband. Incubeer de weefsels gedurende ten minste twee dagen om de lymfeknopen toe te laten hechten aan de vetkussens voordat ze drie tot vier weken na de transplantatie onder de niercapsule worden overgebracht. Isoleer elke lymfeknop-vetkussen chimaera in elke nier en ontleed de lymfeknopen.

Gebruik vervolgens voor elke lymfeknood een klein paar schaar om een enkele insnijding in het weefsel te maken om de enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken. Plaats vervolgens één lymfeknood in afzonderlijke 1,5 milliliter einorbuisjes met 600 microliters spijsverteringsbuffer. Incubeer de buisjes gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius op een schuddend thermisch blok en pipet om de 10 minuten omhoog en omlaag om de weefsels te helpen dissociëren.

Voeg vervolgens zes microliters EDTA toe aan de buisjes en tritureer de celsuspensie een paar keer om de dissociatie te voltooien. De cellen kunnen vervolgens worden gekleurd met de gewenste antilichamen van belang en geanalyseerd door flowcytometrie om de verbeterde gele fluorescente eiwit of EYFP expressie te behouden. Fixeer de lymfeknopen gedurende drie tot vier uur.

Plaats vervolgens voor elke lymfeknood een enkele druppel koude OCT-verbinding op een klein stuk aluminiumfolie. Vermijd luchtbellen en plaats voorzichtig één lymfeknood in het midden van elke druppel en plaats vervolgens het folie op droog ijs om de weefsels te bevriezen. De lymfeknopen kunnen vervolgens worden gesneden, gekleurd en geanalyseerd door middel van fluorescentiemicroscopie.

P door zorgvuldige isolatie van de lymfeknood is verdere analyse van de nakomelingen van EYFP positieve vet-afgeleide cellen mogelijk. Cryo secties en immunofluorescentie analyse van de lymfeknood onthullen dat EYFP positieve vet-afgeleide cellen migreren naar de lymfeknood waar ze bijdragen aan het GP 38 positieve E RTR zeven positieve lymfeknood stromale celnetwerk Flow cytometrische analyse bevestigt dat een belangrijk deel van de lymfeknood stromale cellen afkomstig is van lokale EYFP positieve vetweefsel voorlopercellen die bijdragen aan 30% van de CD 45 negatieve G 38 positieve CD 31 negatieve fibroblastische fractie, en 10%