A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van circulerende cellen naar een chemokinegradiënt kwantitatief te meten. Onder omstandigheden van fysiologische schuifspanning wordt dit bereikt door eerst een monolaag van endotheelcellen te kweken op met collageen gecoate microporeuze inserts, en deze vervolgens te assembleren in een flowkamer waarin zij een apart statisch compartiment bevatten met chemokines. Vervolgens wordt er schuifspanning op de cellen uitgeoefend om de fysiologische omstandigheden in het vaatstelsel na te bootsen.

Als tweede stap mogen testcellen van belang, zoals leukocyten, stamcellen of tumorcellen, tijdens de circulatie circuleren in het 3D-systeem. De inhoud van het statische compartiment beïnvloedt de efficiëntie van interacties tussen circulerende cellen en endotheelcellen, en vervolgens de snelheid van transmigratie van de testcellen door de endotheellaag. Vervolgens wordt het 3D-systeem gedemonteerd en worden getransmigreerde testcellen uit het onderste statische compartiment verzameld om de celmigratie kwantitatief te meten met behulp van diverse state-of-the-art methoden; de resultaten tonen het vermogen van circulerende testcellen om onder fysiologische stroomcondities te interageren met endotheelcellen en de circulatie te verlaten op basis van de concentratie chemokinen in het statische compartiment.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van parallelle laminaire stroomkamers en statische transfer-assays, is dat het zowel schuifspanning in het bovenste compartiment als kines in het onderste statische compartiment combineert. Hierdoor kunnen onderzoekers de externalisatie van circulerende cellen naar de kin-gradiënt en de omstandigheden van fysiologische stroming kwantitatief meten. Deze methode kan ook worden gebruikt om het effect van crosstalk tussen de cellen van de lokale micro-omgeving en endotheelcellen op de extravasatie van circulerende cellen te bestuderen.

Door een extra cellaag op een aparte insert onder de endotheelcellen te plaatsen, zal de procedure worden gedemonstreerd door Valentina against rova, een technicus uit mijn laboratorium. Begin met het berekenen van het aantal inserts dat nodig is voor het experiment en plaats elke insert in een aparte steriele Petrischaal. Steriliseer deze door middel van gamma-bestraling totdat de totale dosis 11 gray bereikt, afhankelijk van de individuele opstellingen.

Verdun vervolgens de stockoplossing van collageen type I tot 50 µg/mL met behulp van 0,01 M zoutzuur bewaard bij 4 °C en bereid aliquoten van 154 µL van de uiteindelijke oplossing voor elk insert. Plaats daarna enkele druppels van deze oplossing in een circulair patroon op het oppervlak van het insert.

Voeg vervolgens de rest van het aliquot toe om één grote druppel op het oppervlak van de insert te vormen. Zorg ervoor dat de pipetpunt op geen enkel moment de insert raakt en dat het collageen het gehele oppervlak van de insert bedekt, zonder weg te vloeien. Zodra de insert bedekt is, plaatst u het deksel op de Petrischaal en zet u deze voorzichtig op een vlak oppervlak.

Incubeer de inserts gedurende één uur bij kamertemperatuur; zuig na de incubatie de collageenoplossing af en was het membraan met 160 µL PBS. Zuig vervolgens de PBS af. Plaats het deksel terug en wikkel de schaal in parafilm.

Als de inserts op dezelfde dag worden gebruikt, bewaar de Petrischaal dan op een droge plaats bij kamertemperatuur. Plaats de schaal anders bij vier graden Celsius en gebruik de insert binnen zeven dagen. Oogst gekweekte menselijke endotheelcellen uit de navelstrengader vlak voor gebruik en resuspendeer ze in het gewenste kweekmedium op 2,5 miljoen cellen per milliliter.

Controleer bij het tellen van de cellen met trypaanblauw of de celviabiliteit groter is dan 98%, en voeg vervolgens 160 µL van de celsuspensie toe aan elke insert. Plaats hiertoe eerst enkele kleine druppels in een cirkel op het oppervlak van de collageen-gecoate insert, waarna de rest van de celsuspensie voorzichtig wordt toegevoegd om één grote druppel te vormen. Plaats na voltooiing de deksels terug en zet de schalen voorzichtig in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten om de cellen de kans te geven zich aan het membraan te hechten.

Haal na 30 minuten de platen uit de incubator en voeg voorzichtig vijf milliliter voorverwarmd kweekmedium toe over elke insert. Let er hierbij op dat de insert op de bodem van de schaal blijft en volledig door het medium wordt bedekt. Plaats vervolgens de deksels terug en zet de schalen voorzichtig terug in de incubatorcultuur.

Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Schroef voor de assemblage van de flowkamer eerst de bovenste en onderste platen aan elkaar. Verbind vervolgens de platen met de gasuitwisselingsunit met behulp van PVC-slangen met een binnendiameter van 1,42 mm en een wanddikte van 0,8 mm.

Plaats vervolgens het geassembleerde apparaat in een schone plastic zak en steriliseer het door gammabestraling totdat de totale dosis 11 gray bereikt. De volgende stap is het verwijderen van een incubatorschaal, deze in een steriele weefselkweekkap plaatsen en steriliseren met 70% ethanol. Bedek de schaal vervolgens met een grote steriele servet.

Verwijder vervolgens het apparaat uit de plastic zak en plaats het op de steriele incubatorschaal. Sluit het apparaat daarna aan op de peristaltische pomp en programmeer de pomp om te draaien met een snelheid van 0,2 milliliters per minuut. Pipetteer vijf tot zeven milliliters van het gewenste kweekmedium in een steriele 15 milliliter buis om als inlaat te gebruiken.

Koppel vervolgens de inlaatslang los van de uitlaat door de metalen naald uit de slang te trekken met behulp van kleine steriele doekjes om de steriliteit van de slang te behouden; plaats de metalen inlaatnaald in de 15 milliliter buis met het medium en plaats de uitlaatslang in de lege 15 milliliter buis. Zet daarna de pomp aan, zodat de stroom tegen de klok in verloopt. Laat de negatieve druk het medium vanuit de 15 milliliter inlaatbuis in de slang zuigen en stop de pomp wanneer het medium het einde van de slang bereikt, vlak voordat het het apparaat binnengaat.

Open vervolgens het apparaat door de buisplaten los te draaien en verwijder voorzichtig de bovenplaat. Pipetteer 1500 tot 1550 µL medium in de onderste putjes, waarbij u ervoor zorgt dat de putjes voldoende medium bevatten om een hemisfeer te vormen die één tot twee mm boven de onderste plaat uitsteekt. Plaats daarna de voorbereide inserts vanuit de petrischalen in de putjes van de onderste plaat. Zorg er met een steriele pincet voor dat er geen luchtbellen onder de inserts gevangen zitten en aspireer al het medium dat op het oppervlak van de onderste plaat verschijnt.

Plaats vervolgens de bovenplaat terug op de onderplaat en verbind deze opnieuw. Zet direct na het vastdraaien van de schroeven de peristaltische pomp aan en laat het medium door het 3D-device stromen. Til het uitlaatuiteinde van het device op en houd de kamer in deze positie om de vorming van bellen in de ruimte tussen de platen te voorkomen.

Vul de slang die de kamer met de gasuitwisselingsunit verbindt verder met medium tot het de gasuitwisselingsunit bereikt. Plaats vervolgens drie milliliter medium in de gasuitwisselingsunit. Zet de pomp aan en laat de luchtbellen erdoorheen ontsnappen.

Til de eenheid op zodat het medium de slang die eruit komt kan vullen en stop de pomp wanneer het medium twee tot drie centimeter voor het einde is. Zodra het systeem volledig is geprimd, verbindt u de inlaatnaald met de uitlaatslang met behulp van kleine steriele servetten. Keer vervolgens de pomp om zodat het medium met de klok mee naar de gasuitwisselingseenheid stroomt en zorg ervoor dat alle resterende luchtbellen worden verwijderd.

Terwijl de pomp opnieuw tegen de klok in stroomt, voegt u 100 µL van de testsuspensie van de cellen toe aan de gasuitwisselingsunit. Sluit vervolgens het deksel van de respirator.

Plaats de tray terug in de incubator en laat de testcellen in het apparaat circuleren bij 37 °C. Wanneer de gewenste tijd is verstreken, haal dan de tray met het werkende systeem uit de incubator en plaats deze in de zuurkast. Stop de pomp, koppel de in- en uitlaat los en plaats de uiteinden in lege steriele buisjes van 15 ml.

Zet vervolgens de pomp aan en verzamel de cel-suspensie uit het systeem. Bewaar de cel-suspensie op ijs tot gebruik. Demonteer daarna de kamer door de schroeven te verwijderen en de bovenplaat op te tillen.

Verwijder de inserts uit de onderste plaat en breng deze over naar petrischalen voor kleuring of celverzameling. Verwijder vervolgens de celsuspensie uit de onderste wells en breng deze over naar 15 milliliter buizen. Spoel elke well tweemaal met 1,5 milliliter medium en voeg dit toe aan de betreffende buis.

Centrifuge de buizen vervolgens vijf minuten bij 200 Gs en verwerk de cellen volgens de specifieke experimentele doelen, zoals die vermeld staan in het bijbehorende tekstprotocol. Hier is een voorbeeld van een van de vele tests die met dit systeem kunnen worden uitgevoerd. De opstelling bestaat uit spiegelende uit het beenmerg afgeleide endotheelcellen, gekweekt op inserts met poriën van vijf micron; onder de inserts werd stromal cell derived factor one of SDF-1 toegevoegd in concentraties van 0,5 of 50 ng/mL.

Beenmergcellen kregen de gelegenheid om te circuleren in het 3D-systeem. Cellen die door de insert migreerden, werden verzameld en vervolgens gekweekt op platen met Methylcellulose-medium. In aanwezigheid van hematopoëtische groeifactoren, die progenitorcellen aanzetten tot het vormen van kolonies, werd het aantal kolonies 14 dagen later geteld om het aantal progenitors in elke well te bepalen en hun vermogen om naar sdf te migreren vast te stellen.

Eén onder omstandigheden van fysiologische flow. Met de toevoeging van stromale fibroblasten gekweekt op het onderste insert in de statische kamer, migreerden er meer hematopoëtische cellen vanuit de circulatie naar de kamer bij toevoeging van sdf, één bij 50 nanograms per milliliter, dan met alleen SDF één na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in verschillende velden van de medische en biologische wetenschappen om weefselspecifieke vasculaire bedden in vitro te modelleren en om cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die de migratie van circulerende cellen naar normale weefsels versus zieke weefsels mediëren.