High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de maximale potentiële snelheden waarmee extracellulaire enzymen in bodems hun doelsubstraten afbreken. Dit wordt bereikt door eerst veldvochtige bodem en buffer in een blender te mengen, en vervolgens de gemengde monsters te pipetteren in een deep-well monsterplaat en deep-well standaardplaten. De deep-well platen worden geïncubeerd en gecentrifugeerd voordat 250 µL van elke put van de deep-well platen wordt overgebracht naar overeenkomstige putten van zwarte platen met een platte bodem.

Platen met 96 putjes. De drie platen worden vervolgens uitgelezen op de fluorimeter en de resulterende gegevens worden geanalyseerd. Uiteindelijk worden potentiële extracellulaire enzymactiviteiten in de bodem bepaald op basis van de snelheid waarmee fluorescerende kleurstof uit het substraat wordt vrijgegeven via een enzymgekatalyseerde reactie, waarbij een hogere fluorescentie duidt op meer substraatafbraak.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de mogelijkheid om enzymactiviteiten in een groot aantal monsters te meten door gebruik te maken van het deep-well 96-wells microplate-formaat. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de mogelijkheid zagen om het monstervolume te vergroten ten opzichte van standaard microplates door andere protocollen aan te passen aan het deep-well plate-formaat. De implicaties van deze techniek stellen ons in staat om de microbiële fysiologie beter te koppelen aan processen op ecoschaal.

Een visuele demonstratie is essentieel voor deze techniek, omdat er veel nuances en aspecten van monsterbehandeling zijn die niet eenvoudig te volgen zijn in een geschreven procedure. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van de microbiële ecologie en bodembiogeochemie, zoals de vraag hoe bodemmicroben reageren op veranderingen in hun omgeving en hoe hun fysiologische reacties kritieke ecosysteemprocessen beïnvloeden, zoals afbraak en nutriëntenkringloop. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de afbraak van organische stof in de bodem en de nutriëntenkringloop in terrestrische ecosystemen, kan deze ook worden toegepast op mariene systemen en zoetwatersystemen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de pipetteertechnieken en de tijdgevoeligheid van dit protocol. Bovendien is de grote hoeveelheid data die bij deze procedure wordt gegenereerd soms overweldigend voor beginnende gebruikers. Om de opzet van de assay te starten, labelt u drie deep well plates als monster, MUB-standaard voor 4-methylumbelliferone en MUC-standaard voor 7-amino-4-methylcoumarine.

Giet elke standaard en elk substraat in afzonderlijke, schone en vooraf gelabelde reservoirs die in rijen zijn georiënteerd. Pipetteer vervolgens de juiste MUB-standaard in de overeenkomstige putjes van de MUB-standaardplaat, zoals vermeld in het tekstprotocol. Herhaal dit proces voor de MUC-standaarden in de overeenkomstige putjes van de MUC-standaardplaat om bodemsuspensies voor te bereiden.

Weeg voor elk bodemmonster 2,75 gram veldvochtige grond voordat u deze aan een blender toevoegt. Voeg 91 milliliters van een 50 millimolaire buffer toe en meng gedurende één minuut op hoge snelheid. Giet de inhoud van de blender in een schone glazen kom met een roerstaaf die minstens zo breed is als een achtkanals pipet.

De bodemsuspensie kan door een zeef van ongeveer één millimeter worden gezeefd voordat deze in de kom wordt gegoten. Plaats de kom op een roerplaat en meng de bodemsuspensie. Pipetteer vervolgens 800 µL bodemsuspensie in de eerste kolom van de monsterplaat.

Doe hetzelfde voor de eerste kolom van de MUB-standaard- en MUC-standaardplaten. Spoel de blender, roerplaat en roerstaf met gedeïoniseerd water of buffer tussen de bodemmonsters door. Herhaal dit proces voor elk bodemmonster.

Ga voor elk volgend monster naar de volgende kolom. Pipetteer vervolgens het juiste substraat in de overeenkomstige putjes van de monsterplaat. Bereid, zoals vermeld in het tekstprotocol, een monsterplaat voor voor elke incubatietemperatuur die wordt getest.

Sluit de deep well plates af met plaatmatten. Keer elke afgesloten plaat handmatig om totdat de oplossing grondig is gemengd. Plaats de platen in de juiste incubator voor de vereiste incubatietijd zoals vermeld in het tekstprotocol; noteer het begintijdstip als tijd nul, evenals de respectievelijke incubatietijden aan het einde van elke incubatieperiode.

Centrifugeer de afgesloten platen gedurende drie minuten bij ongeveer 2.900 G. Breng na centrifugatie 250 µL uit elke well van de geïncubeerde deep well plates over naar de overeenkomstige wells van zwarte vlakbodem 96-well platen. Eén zwarte plaat wordt gebruikt voor elke geïncubeerde deep well plaat.

Het is belangrijk om de monsters uit de geïncubeerde deep-wellplaten over te brengen naar de overeenkomstige putjes in de zwarte flat-bottom 96-wellplaten, volgens de instructies van de fabrikant van de gebruikte fluorimetrische platenlezer. Stel de excitatiegolflengte in op 365 nanometer en de emissiegolflengte op 450 nanometer.

Laad een van de standaardplaten, stel de fluorimeter in op automatische versterking (automatic gain) en lees de plaat af. Stel de versterking vervolgens handmatig in en verlaag de waarde van optimaal naar het volgende laagste getal, afgerond op het dichtstbijzijnde veelvoud van vijf. Herhaal de meting voor elke standaardplaat tweemaal.

Laad vervolgens de monsterplaat. Stel de gain in op automatisch en analyseer de monsterplaat. Analyseer de monsterplaat handmatig opnieuw om de hoogste gain van elk van de standaardplaten te matchen.

Begin de data-analyse door de fluorescentiegegevens van de standaardcurve voor de MUB- en MUC-standaard in een spreadsheet in te voeren. Zet de micromolaire concentraties om in micromolen voor elke monster. Bereken op basis van de fluorescentiegegevens van de standaardcurve de helling, het y-intercept en de R-kwadraatwaarden voor de MUB- en MUC-standaardconcentraties.

Acceptabele r²-waarden moeten voor elk monster hoger zijn dan 0,98. Standaardcurves kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot, waarbij de fluorescentiewaarden zijn uitgezet als de afhankelijke variabele en de standaardconcentratie als de onafhankelijke variabele. Voer de ruwe fluorescentiegegevens van het monster plus substraat in een nieuw spreadsheet in.

Vermeld daarnaast de incubatietijd en het drooggewicht van de bodem voor elk monster, trek de onderscheppingswaarden van de standaardcurve af van de overeenkomstige fluorescentiewaarden van de monsters en deel dit vervolgens door de helling van de overeenkomstige standaardcurve. Vermenigvuldig met behulp van de vergelijking van de standaardlijn de micromolen van het monster met 91 milliliters, wat het buffervolume is dat is gebruikt in het bodemsuspensie. Deel de verkregen waarde door de monsterspecifieke incubatietijd en de droge bodemmassa.

Vermenigvuldig tot slot de verkregen waarde met 1000 om de gewenste eenheden te verkrijgen. De resultaten zijn afkomstig uit een experimentele klimaatstudie waarin bodems die aan omgevingsklimaatcondities waren blootgesteld, werden vergeleken met bodems die waren blootgesteld aan verhoogde koolstofdioxide en verwarmingsbehandelingen; hier worden de potentiële extracellulaire enzymactiviteiten of EEA's weergegeven op de locatie voor prairieverwarming en verhoogde koolstofdioxideverrijking in controlepercelen en behandelpercelen. In dit voorbeeld verschilden de assays voor potentiële enzymactiviteiten voor de acquisitie van koolstof, stikstof en fosfor op bodemdieptes van 0 tot 5 cm niet per experimentele behandeling.

Op bodemdieptes van 5 tot 15 centimeter verschilden echter verschillende potentiële EEA's significant. Zo waren de koolstof afbrekende enzymen beta-1,4-glucosidase en beta-D-cellobiohydrolase lager in de percelen met verhoogde CO2-concentratie en opwarming in vergelijking met de percelen onder omgevingsklimaatcondities. De stikstof- en fosfor mineraliserende enzymen waren eveneens lager in de behandelingspercelen vergeleken met de omgevingsklimaatcondities op bodemdieptes van 5 tot 15 centimeter.

Het berekenen en uitzetten van de som van alle potentiële EEA's voor de koolstof-, stikstof- of fosforcyclus kan een nuttige benadering zijn om bredere patronen waar te nemen met betrekking tot potentiële koolstof-, stikstof- en/of fosforcycli in de bodem. In dit voorbeeld werd de som van de potentiële EEA's van bèta 1,4-glucanase, bèta-D-cellobiosehydrolase, bèta-xylosidase en alfa 1,4-glucanase berekend om de potentiële koolstofcyclusactiviteiten te representeren. De som van bèta 1,4-N-acetylglucosaminidase en L-leucine-aminopeptidase werd berekend om de potentiële stikstofcyclusactiviteiten te representeren.

Fosfatase werd gebruikt om potentiële fosforcycleringsactiviteiten weer te geven. Potentiële EEA's voor de cyclering van totaal koolstof, stikstof en fosfor vertoonden een dalende trend in de percelen met verhoogde koolstofdioxide en verwarming in vergelijking met de percelen onder omgevingsklimaatcondities bij bodemdieptes van 5 tot 15 centimeter. Deze trend was echter alleen significant voor de cycleringsactiviteiten van totaal stikstof en fosfor, en de bodem-EEA's verschilden niet significant tussen de behandelde percelen.

Op een bodemdiepte van nul tot vijf centimeter. De resultaten suggereren contrasterende trends in enzymactiviteit en functionele groepen tussen de behandelingspercelen in reactie op de bodemdiepte; de ratio van potentiële EEA's is één manier om de microbiële nutriëntenbehoefte te beoordelen. Hier verschillen bodemenzymen, tochi-geometrie, koolstof-stikstof, koolstof-fosfor of stikstof-fosfor activiteiten significant tussen de behandelingspercelen op een bodemdiepte van nul tot vijf centimeter.

De potentiële enzymatische koolstof-fosfor- en stikstof-fosforverhoudingen waren echter hoger in de percelen met verhoogde koolstofdioxide en opwarming. In vergelijking met de omgevingsklimaatcondities op bodemdieptes van 5 tot 15 centimeter kan temperatuur de bodem-EEA's sterk beïnvloeden. Toch worden bodemenzymen in typische laboratoriumassays gemeten bij één enkele temperatuur die mogelijk niet overeenkomt met de in situ temperatuuromstandigheden.

Arran-plots worden gebruikt om de activeringsenergie te visualiseren en worden uitgezet met het logaritme van de enzymactiviteit als functie van de inverse temperatuur, omgerekend naar kelvins op de x-as. Activeringsenergie wordt gewoonlijk gedefinieerd als de minimale energie die nodig is om een chemische reactie te katalyseren en wordt hier gebruikt als maatstaf voor de temperatuurgevoeligheid van enzymgekatalyseerde reacties. Een hogere activeringsenergie duidt op een grotere temperatuurgevoeligheid van het enzym.

Hetzelfde geldt voor activeringsenergieën, die direct corresponderen met de Q₁₀-temperatuurcoëfficiëntwaarden. De potentiële enzymkinetiek voor de EEA's van koolstof, stikstof en fosfor werd beoordeeld in beide behandelingspercelen op de twee bodemdiepten, en de resultaten toonden aan dat de temperatuurgevoeligheid van de EEA's niet significant verschilde tussen de behandelingspercelen op 어느 van beide bodemdiepten. Eenmaal beheerst kunnen 12 monsters in 30 minuten of minder worden geïnoculeerd in de 96-wells microtiterplaten.

Bovendien kunt u na de voorgeschreven incubatietijden de platen doorgaans binnen een half uur opnieuw centrifugeren, overbrengen en uitlezen op de urometer. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om consistent te pipetteren. Elke luchtbel bij het pipetteren zal de resultaten na het volgen van deze procedure nadelig beïnvloeden.

Andere methoden, zoals DNA-extractie en sequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol van de samenstelling van de bodemmicrobiële gemeenschap in de bodemfunctie na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de microbiële ecologie om nutriëntencycli en biogeochemische processen in terrestrische ecosystemen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe potentiële enzymactiviteiten kunnen worden gekwantificeerd.

Bovendien moet u in staat zijn om de gegevens te interpreteren om potentiële microbiële reacties op factoren zoals klimaat en verschillende bodemtypen binnen diverse ecosystemen weer te geven. Vergeet niet dat er bij het werken met fluorescerende materialen altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om de blootstelling aan licht te minimaliseren vanwege de lichtgevoeligheid van de fluorofoor.