Name: Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer fotothermische straalafbuiging om submilliseconden conformatieveranderingen in calciumbindende eiwitten te bestuderen. Deze methode meet volume- en enthalpieveranderingen bij calciumbinding aan neurale calciumsensoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) en J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

1. Monster Voorbereidingen <ol><li> Voer de monstervoorbereiding en alle monster manipulaties in een donkere kamer om een ​​ongewenste uncaging voorkomen. </li><li> Oplosbaar DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimethoxyfenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oxy-carbonyl) methyl] -1,2-ethaandiamine) in 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 uM (ε 350 nm = 4330 M-1 cm -1 9). </li><li> Voeg CaCl2 van de 0,1 M stockoplossing aan een wenselijke verhouding van [Ca 2 +] te bereiken: [DM-nitrophen]. Voor eiwitten met Kd voor Ca 2 + associatie groter dan 10 uM, de verhouding van [Ca 2 +] [DM-nitrophen] 1:1 de voorkeur binding van foto-model Ca2 + tot uncaged DM-nitrophen voorkomen . Immers, gezien de Kd waarde DM-nitrophen zijn 10 nM en de totale concentratie van DM-nitrophen en Ca2 + om 400 mM, ~ 90% van een calcium bindend eiwitmet K d = geeft 10 uM in de apoform. Anderzijds, voor studie van Ca2 + bindende eiwitten met Kd &lt;10 uM, het de voorkeur de [Ca 2 +] verlagen: [DM-nitrophen] ratio 0.95 Ca 2 + complexering voorkomen dat de apo- eiwit voorafgaand de kooi fotodissociatiegebieden. </li><li> Solubiliseren de referentieverbinding, K3 [Fe (III) (CN) 6] of Na 2 CrO 4, in dezelfde buffer als het monster. </li></ol> 2. Het opzetten van het experiment <ol><li> De basis experimentele configuratie is getoond in figuur 2. </li><li> Gebruik een pengat (P2) aan de diameter van de sonde bundel (632 nm uitgang van He-Ne laser, ~ 5 mW laservermogen) aanpassen aan 1 mm en propageren de testbundel door het midden van een cel in een temperatuur gecontroleerde cel houder met behulp van een M 1 spiegel. </li><li> Gebruik een spiegel (M 2) achter het monster aan de testbundel centrerenop een centrum van positie gevoelige detector. </li><li> Concentreer de sonde bundel op het midden van de detector zodanig dat het verschil in spanning tussen de bovenste twee diodes en onderste twee dioden en het verschil in spanning tussen de twee diodes links en rechts van de detector nul. </li><li> Vervolgens vorm een diameter van de pompbundel, een 355 nm uitgang Q-switched Nd: YAG laser, FWHM 5 nsec) met een 3 mm pinhole (P1) geplaatst tussen twee spiegels 355 nm laser. </li><li> Copropagate de pompbundel door het midden van de cuvet zoals aangetoond in figuur 2. Het is belangrijk dat beide laserstralen worden voortgeplant door het midden van de optische cel in bijna collineaire wijze een meetbare afbuighoek en dus hoge amplitude van PBD signaal te verkrijgen. Onder experimentele omstandigheden, de hoek van het snijpunt van de sonde en pomp bundels kleiner is dan 15 °. </li><li> Gebruik een referentieverbinding de sonde en pomp uitlijnenbeam om een bevredigende PBD signaal bereiken, dat wil zeggen een goede S / R-verhouding en stabiel PBD amplitude op langere tijdschalen (~ 100 msec). </li><li> Pas de positie van de pompbundel ten opzichte van de testbundel met een incrementele aanpassing van de 355 nm laser spiegels. </li><li> Meet de amplitude van de PBD referentiesignaal als een verschil tussen twee bovenste en onderste fotodiodes op de positiegevoelige detector. De PBD signaal zou een snelle toename van de amplitude op een snelle tijdschaal (&lt;10 usec) vertonen en stabiel op 100 msec tijdschema zoals aangetoond in figuur 3. De twee opnamen variabiliteit van de VOB amplitude ligt op 5% van het signaal amplitude en het signaal reproduceerbaarheid wordt vooral beïnvloed door trillingen. </li><li> Controleer de lineariteit van de PBD signaalamplitude ten opzichte van de vrijkomende warmte-energie door meting van de lineaire afhankelijkheid van de PBD signaal op de excitatie laservermogen en het aantal Einsteins geabsorbeerd, E een= (1-10-A), waarbij A overeen met de referentie absorptie bij de excitatiegolflengte. </li><li> Houd het laservermogen onder ca. 1000 mJ en absorptie van het monster / referentieverbinding bij de excitatie golflengte van minder dan 0,5 multiphoton absorptie en vermindering van de pomp bundelvermogen respectievelijk voorkomen en zorgen lineariteit van de PBD signaal. </li></ol> 3. PBD Metingen <ol><li> Begin met de meting van de PBD sporen voor de referentie. Plaats de oplossing van de referentieverbinding in een 1,0 cm x 1,0 cm of 1,0 cm x 0,5 cm kwarts cel en plaats de cel in de temperatuur gecontroleerde houder. Beide weglengtes verstrekken vergelijkbare PBD amplitude. </li><li> Detecteer referentie PBD signaal als functie van de temperatuur in het temperatuurgebied 16-35 ° C waarbij de temperatuur toename van 3 ° C. </li><li> Bij iedere wijziging van de temperatuur, controleren van de positie van de sonde straal op de positie gevoelige detector en rede aan te passen naar het midden van de detector indien nodig. </li><li> Controleer de lineariteit van de PBD signaal als functie van de [(dn / dt) / Cp ρ] termijn volgens vergelijking 2. </li><li> Plaats de monsteroplossing in dezelfde optische cel als de referentieverbinding houden dezelfde oriëntatie van de optische cel en voor de referentiemeting. </li><li> Detecteer sample PBD sporen op dezelfde temperatuur als de referentie en controleer de lineariteit van het monster PBD amplitude ten opzichte van het [(dn / dt) / Cp ρ] termijn. </li></ol> 4. Data Analysis De grootte van de vervorming is recht evenredig met de volumeverandering door het monster verwarming (AV th) en nonthermal volumeverandering (AV nonth) volgens vergelijking 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" /> De amplitude van de bemonstering (A S) En referentie (A r) PBD signaal kan worden beschreven met behulp van respectievelijk de vergelijkingen 2 en 3. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Vergelijking 3" /> PBD signaal is recht evenredig met het parameterantwoord instrument (K) en het aantal Einsteins geabsorbeerd (Ea). De eerste term in vergelijking 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q overeenkomt met het signaal wisselgeld voor de vrijkomende warmte het oplosmiddel. De dn / dt term vertegenwoordigt de temperatuurafhankelijke verandering van de brekingsindex, ρ de dichtheid van het oplosmiddel, Cp de warmtecapaciteit. Alle parameters bekend voor gedestilleerd water en kan worden bepaald voor een bufferoplossing door vergelijking van een PBD signaal voor de referentieverbinding in gedestilleerd water en in een geschikte buffer. Q is de hoeveelheid warmte returned om het oplosmiddel. De ρ (dn / d ρ) termijn is een eenheid meer constante die onafhankelijk van de temperatuur in het temperatuurbereik 10-40 ° C 10. An abs stemt overeen met de verandering van de brekingsindex door de aanwezigheid van absorberende species in de oplossing en het is verwaarloosbaar indien de golflengte van de sonde bundel wordt verschoven ten opzichte van de absorptiespectra van elke species in de oplossing. Het signaal ontstaan ​​uit de referentieverbinding (A r) wordt uitgedrukt door Vergelijking 3 waar Eh ν is de foton energie op de excitatiegolflengte, Eh ν = 80,5 kcal / mol voor 355 nm excitatie. <ol><li> Neem de amplitude van de referentie-PBD signaal als het verschil tussen de pretrigger en na de trigger-PBD signaal zoals getoond in figuur 3. Op soortgelijke wijze bepaalt de amplitude van de snelle (A en snelle) en langzame fase (A en langzame) Van het monster PBD signaal. </li><li> De parameter instrumentresponstijd, K elimineren schaal de amplitude van de bemonstering PBD signaal de amplitude van het PBD signaal voor de referentie. De verhouding van het monster signaal het referentiesignaal geeft Vergelijking 4 en kan worden geschreven als: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Vergelijking 4" /> </li><li> Met deze vergelijking bepaalt de vrijkomende warmte aan de oplossing (Q) en nonthermal volumeverandering (AV nonth) geassocieerd met een foto-geïnitieerde reactie van de helling en intercept van respectievelijk een grafiek van [(A s / A r) e h ν] termijn versus temperatuur afhankelijke term [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Om het reactievolume en enthalpie verandering voor de snelle en de langzame proces bepalen schaal de waargenomen omvang en enthalpie verandering de juiste quantum opbrengst volgens Vergelijkingen 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Vergelijking 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Vergelijking 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Vergelijking 7" /> Voor een meerstaps proces kinetiek plaatsvindt op de tijdschaal tussen 10 psec ~ 200 msec, het volume en de enthalpie veranderingen in verband met de afzonderlijke stappen van de reactie worden bepaald. De amplitudes en looptijden van de afzonderlijke stappen worden geanalyseerd door het aanbrengen van de gegevens aan de functie F (t) die het tijdsprofiel van het volume en enthalpie veranderingen beschrijft. <img alt="Vergelijking 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> waarbij α 0 correspondeert met de A is snel en α i stemt overeen met een langzame s voor elk proces en τ i zijn de levensduur van de afzonderlijke reactiestappen. Van de temperatuur-afhankelijkheid van de snelheidsconstante for individuele processen (k i = 1 / τ i) de activering enthalpie en entropie parameters kunnen gemakkelijk worden bepaald met behulp Eyrings plaatsen. </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel 1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen i...

Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten 1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch &quot;stille&quot; processen. Tot dusver fotoakoestische calorimetrie en voorbijgaande rooster is met succes toegepast op conformationele dynamica van foto-geactiveerde processen waaronder twee atomen ligand migratie globins 3,4 ligand interacties met zuurstofsensor eiwit bestuderen FixL 5, elektronen en protonen transport in heem-koper oxidasen 6 eennd fotosysteem II evenals foto-isomerisatie in rhodopsin 7 en conformationele dynamica in cryptochrome 8. Om de toepassing van fotothermische technieken om biologische systemen die ontbreken intern chromofoor en / of fluorofoor te breiden, werd de PBD techniek in combinatie met het gebruik van gekooide verbinding aan foto-trekker verhoging van ligand / substraat concentratie binnen enkele microseconden of sneller, afhankelijk het gekooide compound. Deze aanpak zorgt voor de opvolging van de dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met de ligand / substraat binden aan eiwitten die ontbreken een interne fluorofoor of chromofoor en op tijd-schaal die niet toegankelijk door commerciële stopstroming instrumenten. Hier een toepassing van PBD de thermodynamica van de kooi verbinding Ca2 + DM-nitrophen, foto-splitsing en de kinetiek voor Ca 2 + associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor omlaag monitorenstroom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gepresenteerd. De Ca 2 + is foto-vrijgelaten uit Ca 2 + DM-nitrophen binnen 10 usee en rebinds een unphotolysed kooi met een tijdconstante van ~ 300 msec. Anderzijds, in aanwezigheid van apoDREAM extra kinetische zich op de milliseconde tijdschaal waargenomen en weerspiegelt de ligand binding aan het eiwit. De toepassing van PBD conformationele transities in biologische systemen sonde of andere manier beperkt vanwege de instrumentele moeilijkheden, bijvoorbeeld zware uitlijning van de sonde en pompbundel een sterke en reproduceerbare PBD signaal bereiken. Echter, een zorgvuldige ontwerp van een instrumentatie set-up, een nauwkeurige controle van de temperatuur, en een zorgvuldige afstemming van de sonde en pompbundel een consistente en robuuste PBD signaal dat monitoring van tijdopgeloste volume en enthalpie veranderingen maakt op een breed tijdschaal van 10 usee ongeveer 200 msec. Bovendien modificaties van de experimentele procedure voor de detectie van monster en referentiesporen verzekeren onder identieke temperatuur, buffersamenstelling, optische cel oriëntatie, laservermogen, etc. vermindert de experimentele fout in afgemeten reactievolumes en enthalpie.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#039;,N&#039;-Tetraazijnzuur</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrofen, calciumkooi-verbinding, bewaar oplossingen in het donker om fotodissociatie te voorkomen</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(2-ethaansulfonzuur)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES-buffer</td></tr><tr><td>Kaliumferricyanide (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>referentie-verbinding voor PBD-metingen</td></tr><tr><td>Natriumchromat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>referentie-verbinding voor PBD-metingen</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>gebruiken als sondebundel voor PBD-metingen</td></tr><tr><td>Oscilloscoop,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bandbreedte</td></tr><tr><td>Nd:YAG-laser</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>pompbunde voor PBD-metingen</td></tr><tr><td>M355; Nd:YAG-laserspiegel</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>laserspiegel voor 355 nm laserlijn</td></tr><tr><td>M1 en M2; Laserdiode spiegel</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>zichtbare laser vlakke spiegel, golflengtebereik 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 en P2; Iris Diafragma</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>pin-hole om de sonde- en pompbundels te vormen</td></tr><tr><td>L1; bi-convexe lens</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>een lens om de sondebundel op de detector te richten, EFL 50 mm, golflengtebereik 350-2.000 nm</td></tr><tr><td>DM, dichroïsche spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>een longpass dichroïsche spiegel met een afsnijgolflengte van 505 nm</td></tr><tr><td>F1; Randfilter</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>een langpassfilter met een afsnijgolflengte van 500 nm</td></tr><tr><td>Temperatuurgeregeld cuvettehouder</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

submillisecond conformational veranderingen in eiwitten opgelost door fotothermische straalafbuiging

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca 2 monitoren + binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ &lt;20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.

Een representatief voorbeeld van PBD sporen voor Ca 2 + foto afgifte van Ca2 + DM-nitrophen wordt getoond in figuur 3. De snelle fase komt overeen met de foto-splitsing van Ca 2 + DM-nitrophen en Ca 2 + bevrijding, terwijl de langzame fase weerspiegelt Ca 2 + binding aan de nonphotolysed kooi. De plot van het monster PBD amplitude van de snelle en langzame fase geschaald op de amplitude van de referentieverbinding als functie van de temperatuur afha...

Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om conformationele veranderingen te karakteriseren die gepaard gaan met ligandbinding aan calciumtransducatoren op een sub-milliseconde tijdschaal. De conformationele overgang van het APO-eiwit naar het calciumgebonden eiwit wordt getriggerd door de fotolytische splitsing van een gecaged calciumverbinding, calcium-DM-nitro, wat leidt tot de fotovrijgave van vrij calcium. De bijbehorende verandering in de brekingsindex wordt gemeten als een verplaatsing van de probe-straal met behulp van een quadruppel position-sensitive detector.Vervolgens worden de fotothermische bundelafbuigingssporen gemeten als functie van de temperatuur voor zowel het monster als de referentie. Een samengestelde analyse van de fotothermische bundelafbuigingssporen biedt inzicht in het mechanisme van de calcium-geïnduceerde conformationele schakeling in termen van reactievolume en enthalpieveranderingen. Het belangrijkste voordeel van fotothermische bundelafbuiging ten opzichte van bestaande methoden, zoals top flow, is dat deze techniek gelijktijdige detectie van volume- en entropieveranderingen op een sub-milliseconde tijdschaal mogelijk maakt.De visuele demons

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We presenteren een techniek die de ruimtelijke scheiding mogelijk maakt van verschillende conformers of clusters die aanwezig zijn in een moleculaire straal. Een elektrostatische deflector wordt gebruikt om soorten te scheiden door hun massa-dipoolmomentverhouding, wat leidt tot de productie van gasfase-ensembles van een enkele conformer of cluster stoichiometrie.

Ruimtelijke scheiding van moleculaire conformers en clusters

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

We presenteren een protocol voor het creëren van een realtime film van een moleculair rotatiegolfpakket met behulp van een hoogwaardige Coulomb-explosie-beeldvormingsopstelling.

Direct Imaging van Laser-driven Ultrasnelle Moleculaire Rotation

Hier presenteren we de protocollen van differentiaal-detectie analyses van time-resolved infrarood Vibrationele spectroscopie en elektron diffractie waarmee opmerkingen van de vervormingen van de lokale structuren rond photoexcited moleculen in een in kolomvorm vloeibare kristallen, het geven van een atomaire perspectief op de relatie tussen de structuur en de dynamiek van dit photoactive materiaal.

Nieuwe technieken voor het observeren van structurele dynamica van Photoresponsive vloeibare kristallen

Het succes van een time-resolved seriële femtoseconde kristallografie experiment is afhankelijk van efficiënte monster levering. We beschrijven hier protocollen voor het optimaliseren van de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals van een hoge viscositeit micro-extrusie injector. De methodologie steunt op monster homogenisering met een roman drieweg koppelstuk en visualisatie met een high-speed camera.

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

We presenteren een protocol voor het immobiliseren van enkele macromoleculen in microfluïde apparaten en het kwantificeren van veranderingen in hun conformaties onder schuifstroom. Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische en functionele eigenschappen van biomoleculen zoals eiwitten en DNA in een stroomomgeving.

Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

We presenteren een uitgebreide gids voor de voorbereiding van vaste doelmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotronkristallografie op Diamond beamline I24.

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Plasmonische nanopincetten gebruiken gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in gouden nanostructuren om afzonderlijke nanodeeltjes, waaronder eiwitten, op te vangen in een optisch veld op nanometerschaal. Veranderingen in het verstrooide signaal onthullen de aanwezigheid van eiwitten en de conformationele dynamiek, waardoor monitoring mogelijk is zonder fluorofoormodificaties of oppervlaktetethering.

Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

Leer fotothermische straalafbuiging om submilliseconden conformatieveranderingen in calciumbindende eiwitten te bestuderen. Deze methode meet volume- en enthalpieveranderingen bij calciumbinding aan neurale calciumsensoren.

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Meer video's verkennen