Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Het algemene doel van het volgende experiment is om conformationele veranderingen te karakteriseren die gepaard gaan met ligandbinding aan calciumtransducatoren op een sub-milliseconde tijdschaal. De conformationele overgang van het APO-eiwit naar het calciumgebonden eiwit wordt getriggerd door de fotolytische splitsing van een gecaged calciumverbinding, calcium-DM-nitro, wat leidt tot de fotovrijgave van vrij calcium. De bijbehorende verandering in de brekingsindex wordt gemeten als een verplaatsing van de probe-straal met behulp van een quadruppel position-sensitive detector.

Vervolgens worden de fotothermische bundelafbuigingssporen gemeten als functie van de temperatuur voor zowel het monster als de referentie. Een samengestelde analyse van de fotothermische bundelafbuigingssporen biedt inzicht in het mechanisme van de calcium-geïnduceerde conformationele schakeling in termen van reactievolume en enthalpieveranderingen. Het belangrijkste voordeel van fotothermische bundelafbuiging ten opzichte van bestaande methoden, zoals top flow, is dat deze techniek gelijktijdige detectie van volume- en entropieveranderingen op een sub-milliseconde tijdschaal mogelijk maakt.

De visuele demonstratie van deze techniek is noodzakelijk, aangezien de nauwkeurige uitlijning van het instrument cruciaal is voor het bepalen van de thermodynamische parameters. De procedure wordt gedemonstreerd door Walter Gonzalez, een promovendus uit mijn laboratorium. Voer de monsterbereiding en alle manipulaties van de monsters uit in een donkere kamer om ongewenst uncaging te voorkomen. In deze video worden de stappen bij daglicht gedemonstreerd voor filmaandoeleinden.

Begin met het oplossen van DM Nitro in 50 millimolaire HEPS-buffer met 100 millimolair kaliumchloride, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 micromolair. Voeg calciumchloride uit de 0,1 molaire voorraadoplossing toe om de gewenste calcium-tot-DN-nitro-concentratieverhouding te bereiken. Los vervolgens de referentieverbinding kaliumcyanide of natriumchromaat op in dezelfde buffer.

Wat betreft het monster, raadpleeg het tekstprotocol voor een schema van de basisexperimentele configuratie voor fotothermische straalafbuiging. Laat bij het opzetten van het experiment de probe-straal door het midden van een cel lopen, geplaatst in een temperatuurgereguleerde celhouder. Gebruik vervolgens een pinhole om de diameter van de probe-straal aan te passen naar 1 mm en gebruik een tweede spiegel achter het monster om de probe-straal te centreren op het midden van de positiegevoelige detector.

Focus de pro-beam op het centrum van de detector, zodat het spanningsverschil tussen de bovenste twee diodes en de onderste twee diodes, evenals het spanningsverschil tussen de twee diodes aan de linker- en rechterzijde van de detector, nul is. Pas vervolgens de diameter van de pompstraal aan, een 355 nanometer output van een ND YAG-laser. Gebruik een pinhole van drie millimeter, geplaatst tussen twee 355 nanometer laserspiegels, om de pompstraal door het centrum van de vete te laten co-propageren.

Het is belangrijk dat beide laserstralen nagenoeg collineair door het centrum van de optische cel worden geleid. Om een meetbare afbuighoek en daarmee een hoge amplitude van de fotothermische straalafbuiging of PBD-signaal te verkrijgen, dient een referentieverbinding te worden gebruikt om de probe- en pompstraal af te stellen tot een bevredigend PBD-signaal is bereikt, gekenmerkt door een goede signaal-ruisverhouding en een stabiele PBD-amplitude over langere tijdsperioden. Positioneer vervolgens de pompstraal ten opzichte van de probe-straal door incrementele aanpassing van de spiegels van de 355 nanometer laser.

Meet de amplitude van het PBD-referentiesignaal als het verschil tussen twee bovenste en onderste fotodiodes op de positiegevoelige detector. Het PBD-signaal moet een snelle toename in amplitude vertonen op een korte tijdschaal en stabiel blijven op een tijdschaal van 100 milliseconden. Controleer de lineariteit van de PBD-signaalamplitude ten opzichte van de vrijgekomen warmte-energie door de lineaire afhankelijkheid van het PBD-signaal van het vermogen van de excitatielaser en van het aantal geabsorbeerde Einsteinen te meten.

Houd het laservermogen onder ongeveer 1000 micro joules om multifotonabsorptie te voorkomen. Houd daarnaast de absorptie van de monster- of referentiestof bij een excitatiegolflengte lager dan 0,5 om een afname van het vermogen van de pompstraal te voorkomen. Deze stappen waarborgen de lineariteit van het PBD-signaal.

Begin met de meting van de PBD-sporen. Plaats voor de referentie de oplossing van de referentieverbinding in een kwartscuvet en positioneer de cuvet in de temperatuurgecontroleerde houder. Detecteer het referentie-PBD-signaal als functie van de temperatuur in het temperatuurbereik van 16 tot 35 graden Celsius met een temperatuurincrement van drie graden Celsius.

Bij elke temperatuurwijziging moet de positie van de probestraal op de positiegevoelige detector worden gecontroleerd en opnieuw worden gecentreerd op de detector. Controleer indien nodig de lineariteit van het PBD-signaal zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats vervolgens de monsteroplossing in dezelfde optische cel als gebruikt voor de referentieverbinding, waarbij dezelfde oriëntatie van de optische cel als bij de referentiemeting wordt aangehouden. Ga over tot het detecteren van de PBD-sporen van het monster in hetzelfde temperatuurbereik als voor de referentie, en controleer de lineariteit van de PBD-amplitude van het monster. Neem de amplitude van het referentie-PBD-signaal als het verschil tussen het PBD-signaal vóór de trigger (pret trigger) en na de trigger (post trigger).

Bepaal op soortgelijke wijze de amplitude van de snelle en langzame fase van het PBD-signaal van het monster. Om de instrumentrespons-parameter te elimineren, wordt de amplitude van het PBD-signaal van het monster geschaald naar de amplitude van het PBD-referentiesignaal. Voor de referentie geeft de verhouding tussen het monstersignaal en het referentiesignaal een vergelijking waarop de warmtevrijgave aan de oplossing en de niet-thermische volumeverandering geassocieerd met een foto-geïnitieerde reactie kunnen worden bepaald; dit gebeurt via de helling en het snijpunt van de grafiek van de amplitudeverhouding vermenigvuldigd met de energie tegenover de temperatuurafhankelijke term. Om de reactievolume- en enthalpieverandering voor de snelle en langzame processen te bepalen, wordt de waargenomen volume- en enthalpieverandering geschaald naar de passende kwantumopbrengst.

Volgens de vergelijkingen in het tekstprotocol worden de amplitudes en levensduren van de individuele stappen geanalyseerd door de gegevens te fitten aan de tijdsafhankelijke functie die de volume- en enthalpieveranderingen beschrijft. De amplitude van de snelle stap komt overeen met de amplitude van de prompt-fase van het PBD-signaal van het monster, en de amplitude van de daaropvolgende stap komt overeen met de amplitude van de langzame fase van het PBD-signaal van het monster. Voor elk individueel proces kunnen de activeringsenthalpie- en entropieparameters eenvoudig worden bepaald met behulp van IR-plots op basis van de temperatuurafhankelijkheid van de snelheidsconstante voor de individuele processen.

Een representatief voorbeeld van PBD-sporen voor calciumfotorelease vanuit calcium-DM-nitro wordt hier getoond. De snelle fase komt overeen met de fotoclieving van calcium-DM-nitro en de calciumvrijgave, terwijl de langzame fase de calciumbinding aan de niet-gefotolytiseerde cage weerspiegelt. Het PBD-spoor voor de calciumassociatie aan het C-terminale domein van de neuronale calciumsensor downstream regulatory element antagonist, regulator, of dream wordt hier getoond na calciumfotodissociatie.

Het door licht vrijgekomen ligand associeert met het C-terminale domein van dream met een tijdconstante van 1,3 ± 0,3 milliseconden bij 20 °C, afgeleid uit de temperatuursafhankelijkheid van de waargenomen snelheidsconstante. De activeringsbarrière voor calciumbinding aan het C-terminale domein van dream werd bepaald op 9,2 ± 0,4 kilocalorieën per mol. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de PBD-sporen van het monster te meten onder omstandigheden die identiek zijn aan die van de referentie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u monsters voorbereidt, instrumentatie uitlijnt en gegevens analyseert om een reproduceerbare thermodynamische parameter te verkrijgen.