Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging
18 februari 2014
Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .
Het algemene doel van het volgende experiment is om bevestigingsveranderingen te karakteriseren die geassocieerd zijn met ligandbinding aan calciumtransducers op de sub-milliseconden tijdschaal. De bevestigingstransitie tussen het APO-eiwit naar het calciumgebonden eiwit wordt veroorzaakt door de foto-splitsing van een gekooide calciumverbinding calcium DM nitro die leidt tot de foto-vrijlating van vrij calcium. De geassocieerde verandering in de reflectie-index wordt gemeten als een verplaatsing van de sondebundel met behulp van een quadruple positiegevoelige detector.
Vervolgens worden de fotothermische straalbuigingssporen gemeten als functie van de temperatuur voor zowel het monster als de referentie. Analyse van de fotostraalbuigingssporen biedt inzicht in het mechanisme van calciumgeïnduceerde bevestigingsschakelaar in termen van reactievolume en enthalpie-veranderingen. Het belangrijkste voordeel van fotothermische straalbuiging ten opzichte van de bestaande mast, zoals top flow, is dat deze techniek een gelijktijdige detectie van volume- en entropieveranderingen op sub-milliseconden tijdschaal mogelijk maakt.
De visuele demonstratie van deze techniek is noodzakelijk omdat de nauwkeurige uitlijning van het instrument van cruciaal belang is voor de herstel van thermodynamische parameters. De procedure wordt gedemonstreerd door Walter Gonzalez, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, die de monstervoorbereiding en alle monstermanipulaties in een donkere kamer uitvoert om ongewenst ontketenen te voorkomen. In deze video worden stappen in het licht gedemonstreerd voor filmdoeleinden.
Om te beginnen, lost DM Nitro op in 50 millimolair heaps-buffer 100 millimolair kaliumchloride, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 micromolair. Voeg calciumchloride toe vanuit de 0,1 molaire stamoplossing om de gewenste calcium naar DN nitro concentratieverhouding te bereiken. Los vervolgens het referentiecompound kaliumcyanide of natriumchromate op in dezelfde buffer.
Wat betreft het monster, raadpleeg de tekstprotocol voor een schematisch overzicht van de basisconfiguratie van het experiment voor de fotothermische straalbuiging. Bij het opzetten van het experiment, geef de sondebundel door het centrum van een cel, geplaatst in een temperatuurgestuurde celhouder. Gebruik vervolgens een pinhole om de diameter van de sondebundel aan te passen tot één millimeter, gebruik een tweede spiegel achter het monster om de sondebundel te centreren op het centrum van de positiegevoelige detector.
Richt de pro-straal op het centrum van de detector zodat het verschil in spanning tussen de bovenste twee diodes en de onderste twee diodes, evenals het verschil in spanning tussen de twee diodes aan de linker- en rechterkant van de detector, nul is. Vorm vervolgens de diameter van de pompstraal, een 355 nanometer uitvoer van een ND YAG-laser. Gebruik een drie millimeter pinhole geplaatst tussen 2 355 nanometer laserspiegels om de pompstraal door het centrum van de vete te co-propageren.
Het is belangrijk dat beide laserstralen op een bijna colineaire manier door het centrum van de optische cel worden gepropageerd. Om een meetbare afbuigingshoek en dus een hoge amplitude van fotothermische straalbuiging of PBD-signaal te verkrijgen, gebruik een referentiecompound om de sonde- en pompstraal uit te lijnen om een bevredigend PBD-signaal te verkrijgen, gekenmerkt door een goede signaal-ruisverhouding en stabiele PBD-amplitude op langere tijdschalen. Posisioneer vervolgens de pompstraal ten opzichte van de sondebundel door incrementele aanpassing van de 355 nanometer laserspiegels.
Meet de amplitude van het PBD-referentiesignaal als een verschil tussen twee bovenste en onderste fotodioden op de positiegevoelige detector. Het PBD-signaal moet een snelle toename van de amplitude op een snelle tijdschaal vertonen en stabiel blijven op de 100 milliseconden tijdschaal. Controleer de lineaire relatie in de PBD-signaalamplitude met betrekking tot de vrijgekomen warmte-energie door de lineaire afhankelijkheid van het PBD-signaal op de excitatielaservermogen te meten, en op het aantal geabsorbeerde Einstein's.
Houd het laservermogen lager dan ongeveer 1000 microjoules om meervoudige fotonabsorptie te voorkomen. Houd ook de absorbentie van het monster of referentiecompound op een excitatiegolflengte lager dan 0,5 om een afname van het pompstraalvermogen te voorkomen. Deze stappen zorgen voor lineariteit van het PBD-signaal.
Begin met de meting van de PBD-sporen. Plaats voor de referentie de oplossing van het referentiecompound in een kwartscel en plaats de cel in de temperatuurgestuurde houder. Detecteer het referentie PBD-signaal als functie van de temperatuur in het temperatuurbereik van 16 tot 35 graden Celsius met een temperatuurverhogingen van drie graden Celsius.
Bij elke temperatuurverandering. Controleer de positie van de sondebundel op de positiegevoelige detector en pas de positie aan op het centrum van de detector. Controleer indien nodig de lineariteit van het PBD-signaal zoals beschreven in het tekstprotocol.
Plaats vervolgens de monsteroplossing in dezelfde optische cel als gebruikt voor het referentiecompound, waarbij dezelfde oriëntatie van de optische cel wordt behouden voor de referentiemeting. Ga door met het detecteren van de monster PBD-sporen in hetzelfde temperatuurbereik als voor de referentie, en controleer de lineariteit van de monster PBD-amplitude. Neem de amplitude van het referentie PBD-signaal als het verschil tussen het pret-trigger en post-trigger PBD-signaal.
Op een vergelijkbare manier, bepaal de amplitude van de snelle en trage fase van het monster PBD-signaal. Om de instrumentresponsparameter te elimineren, schaal de amplitude van het monster PBD-signaal door de amplitude van het PBD-signaal. Voor de referentie geeft de verhouding van het monstersignaal tot het referentiesignaal een vergelijking waaruit de warmteafgifte aan de oplossing en niet-thermische volumeverandering geassocieerd met een foto-geïnitieerde reactie kan worden bepaald uit de helling en het snijpunt van de grafiek van de amplitudeverhouding vermenigvuldigd met energie versus de temperatuurafhankelijke term om de reactievolume- en enthalpie-verandering voor het snelle en trage proces te bepalen, schaal de waargenomen volume- en enthalpie-verandering naar de juiste quantumopbrengst.
Volgens de vergelijkingen in het tekstprotocol
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van de fotothermische straalbuigingstechniek samen met een caged calciumverbinding, DM-nitrofen, om de dynamica van structurele veranderingen in neuronale calciumsensoren te onderzoeken. De focus ligt op de microseconden en milliseconden tijdschalen van calciumbindingsgebeurtenissen.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Structurele biologie
Achtergrond
- Calciumtransducers spelen een cruciale rol in neuronale signalering.
- Begrip van conformationele veranderingen is essentieel voor het verduidelijken van calciumsignaleringsmechanismen.
- Fotothermische straalbuiging biedt een nieuwe aanpak om deze snelle dynamica te bestuderen.
- DM-nitrofen is een caged calciumverbinding die gecontroleerde calciumafgifte mogelijk maakt.
Doel van de studie
- Om conformationele veranderingen te karakteriseren die geassocieerd zijn met ligandbinding aan calciumtransducers.
- Om de dynamica van deze veranderingen op een sub-milliseconden tijdschaal te meten.
- Om de reactievolume- en enthalpieveranderingen tijdens calciumbinding te analyseren.
Gebruikte methoden
- Toepassing van de fotothermische straalbuigingstechniek.
- Gebruik van DM-nitrofen voor foto-afgifte van vrij calcium.
- Meting van index van reflectie veranderingen als een verplaatsing van de sondestraal.
- Analyse van fotothermische straalbuigingssporen als functie van temperatuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van conformationele overgangen tussen APO en calcium-gebonden eiwitten.
- Inzichten in het mechanisme van calcium-geïnduceerde conformationele schakelaars.
- Demonstratie van gelijktijdige detectie van volume- en entropieveranderingen.
- Voordelen van fotothermische straalbuiging boven traditionele methoden geaccentueerd.
Conclusies
- De studie biedt een dieper begrip van calciumsignaleringsdynamica.
- Fotothermische straalbuiging is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van snelle moleculaire veranderingen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om andere calcium-gerelateerde processen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of ligand-induced conformational changes on microsecond to millisecond timescales.
- Quantifies reaction volume and enthalpy changes, supporting mechanistic de-risking of target engagement.
- Facilitates functional validation of protein targets without the need for extrinsic labels.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of protein conformational dynamics for assay development.
- Supports reproducibility and standardization by enabling simultaneous detection of volume and enthalpy changes.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows, even for non-fluorescent targets.
- Enables reliable evaluation of compound-induced structural effects in early screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein function for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying activation barriers and kinetic parameters relevant to preclinical models.
- Provides mechanistic data to inform biomarker strategies when supported by target biology.
Pipeline & Workflow Integration
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fast structural transitions and thermodynamic parameters.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of reaction kinetics, volume, and enthalpy changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning kinetic and thermodynamic data with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across protein systems.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative biophysical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with robust mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photothermal instrumentation alignment and data analysis.
- Demands precise temperature control and optical setup for reproducible measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and reference calibration.
- Adaptable to proteins lacking chromophores or fluorophores, broadening applicability.
- Instrument sensitivity and alignment are critical for accurate thermodynamic parameter recovery.
