Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes
14 januari 2014
Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.
Het algemene doel van deze procedure is om hypoxische pulmonale vasoconstrictie van spiegelende intrapulmonaire arteriën met binnendiameters van 20 tot 100 micron te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst de luchtwegen van de longen te vullen met laagsmeltend aros. De tweede stap is om een vibrator te gebruiken om de geïsoleerde longen in plakjes van 200 micron dik te snijden.
Vervolgens wordt de aros uit de longsecties verwijderd door incubatie in 37 graden Celsius warm medium, dat is gebabbeld met normoxisch gas. Zo bewegen de secties langzaam in de vloeistof. Vervolgens wordt een individuele longsectie overgebracht naar een doorstromende superfusiekamer, gevolgd door videomorfometrische analyse van vasoreactiviteit van een dwarsgesneden arterie.
Uiteindelijk worden veranderingen in het luminaal gebied van het vat in reactie op verschillende behandelingen geëvalueerd. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals intravitale microscopie van subpleurale microvaten, is dat het meten van de vasculaire spanning in geïsoleerde proximale longslagaderen mogelijk maakt om de VA-reactiviteit van intrapulmonaire arteriën met diameters tussen de 20 en 100 micrometer kwantitatief te analyseren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Anna Goldenberg en twee technici van dit lab.
Onmiddellijk na het doden van een muis door cervicale dislocatie, opent u de buikholte, verplaatst u de darmlussen opzij en snijdt u de grote buikvaten door voor de bloeding. Gebruik vervolgens fijne schaar om het diafragma te doorboren. Dit veroorzaakt dat de longen instorten als gevolg van het binnendringen van lucht in de pleuraholte.
Ga door met snijden om het diafragma los te maken van de inferieure thoracale opening. Snijd nu de ribben en het sleutelbeen lateraal. Om het ventrale deel van de ribbenkast te verwijderen, verwijdert u de thymus.
Vul een spuit met warme perfusiebuffer. Snijd vervolgens een klein gaatje in de linkerventrikel van het hart. Pas de uitstroom van de perfusiebuffer aan en perfuseer langzaam de pulmonale vaten via de rechterventrikel totdat de longen wit lijken.
Verwijder vervolgens de speekselklieren, kleine spieren en bindweefsel van de luchtpijp. Ontkoppel de luchtpijp van het omliggende bindweefsel en plaats een stuk naaiwatten tussen de slokdarm en de luchtpijp voor latere ligatie. Gebruik vervolgens een microschaar om een klein gaatje te snijden in het bovenste deel van de luchtpijp tussen twee naburige kraakbeenringen van de luchtpijp.
Na het vullen van een spuit met 37 graden Celsius warm, laagsmeltend aros, verbindt u deze met een flexibele plastic canule en drukt u langzaam de zuiger in totdat de lucht uit de canule is verwijderd. Breng de canule in het kleine gaatje in de luchtpijp en veranker het voorzichtig op zijn plaats met naaiwatten. Vul vervolgens langzaam de luchtwegen met de aros en observeer de longen.
Aanvankelijk begint de rechterlong uit te zetten, gevolgd door de linkerlong. Na 30 tot 40 seconden is het vullen voltooid en zijn beide longen opgeblazen tot een volume vergelijkbaar met de in vivo situatie, wat ongeveer 1,2 tot 2,0 milliliter is. Afhankelijk van geslacht, leeftijd en gewicht, is het belangrijk om de eirose snel genoeg te injecteren, zodat deze niet zo verstevigd raakt tijdens de procedure, maar niet zo snel dat de longen worden beschadigd.
Nadat de longen gelijktijdig zijn gevuld, trekt u de plastic canule eruit en legt u de luchtpijp vast met de naaiwatten om lekkage van de aros te voorkomen. Snijd vervolgens de luchtpijp boven de ligatuur en om de longen en het hart op het blok los te maken van de borst, brengt u de organen over in ijskous koude heaps ringer buffer om de agros te laten stollen, wat binnen enkele minuten gebeurt tijdens het wachten. Gebruik superlijm om een stuk champagnekurk aan de monstershouder van de vibrator te bevestigen om als scheeflaag voor het longweefsel te dienen. Nadat de agros is gestold, scheidt u de individuele longkwabben.
Superlijm vervolgens een kwab aan de monstershouder. Om dwarsdoorsneden van de kleine intra-asner-slagaderen te verkrijgen, neemt u de cranale kwab van de rechterlong en bevestigt deze met superlijm aan het hilumoppervlak naar de houder, met behulp van een vibrato uitgerust met een nieuw scheermesje dat vanaf de rand is gesneden, snijd de longkwab in plakken van 200 micron dik. Om dwarsdoorsneden van de grotere pre-aser-slagaderen te verkrijgen, lijnt u het hilum van de linkerlong uit met de champagnekurk en lijmt u de kwab in deze oriëntatie aan de houder, waarna u vanaf de rand snijdt voor het verwijderen van de aros.
Breng de orgaansecties over in een glazen beker gevuld met ongeveer 200 milliliter 37 graden Celsius. MEM. Plaats de beker in een verwarmingskast en bubbelt met normoxisch gas zodat de longsecties langzaam in het medium bewegen. Na ongeveer twee uur zijn de aros-plaques die de lucht vullen verwijderd uit het longweefsel en zijn de secties naar de bodem van de beker gezakt.
Voor videomorfometrische analyse van intrapulmonaire arteriën, brengt u een longsectie over in de doorstromende superfusiekamer, die is gemonteerd op een microscoop en gevuld met 1,2 milliliter normoxisch gassed.MEM. Bevestig de longsectie aan de bodem van de kamer met nylon snaren verbonden aan een platina ring. Begin met het perfunderen van de kamer met normoxisch gassed medium.
Gebruik een fasecontrastmicroscoop met een 10 x objectief om de longsectie te scannen op dwarsgesneden arteriën met binnendiameters tussen 20 en 100 micron. Zodra een redelijke kandidaatvat is gevonden, gebruikt u het 20 x objectief om een foto te maken van een pre-asner-vat of zoals hier getoond, het 40 x objectief om een foto te maken van een intra-asner-arterie voor het meten van de binnendiameter van het vat. Voordat u met het experiment begint, stelt u de software in om elke minuut tijdens het hele experiment foto's te maken van de dwarsgesneden arterie.
Na het activeren van de fotografie,
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van hypoxische pulmonale vasoconstricie (HPV) in muispulmonale bloedvaten met diameters variërend van 20 tot 100 μm. De methode omvat het vullen van de longen met lage smeltpunt agarose, het snijden van de longen en het uitvoeren van video morfometrische analyse om vasculaire reactiviteit te evalueren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Fysiologie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Hypoxische pulmonale vasoconstricie is cruciaal voor het matchen van longperfusie met ventilatie tijdens alveolaire hypoxie.
- De intra-acinaarterie speelt een belangrijke rol in HPV.
- Het begrijpen van HPV kan inzichten bieden in pulmonale vasculaire ziekten.
- Deze studie richt zich op een methode om HPV kwantitatief te analyseren in kleine pulmonale slagaders.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het analyseren van HPV in muismodellen.
- Om de vaso-reactiviteit van intra-pulmonale slagaders te beoordelen.
- Om bestaande methoden voor het meten van vasculaire spanning in geïsoleerde pulmonale slagaders te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het vullen van de longen met lage smeltpunt agarose.
- Het snijden van de longen in 200 micron dikke secties.
- Het incuberen van longsecties om agarose te verwijderen.
- Het uitvoeren van video morfometrische analyse van dwarsgesneden slagaders.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van intra-pulmonale slagaders met diameters van 20-100 μm.
- Kwantitatieve beoordeling van vasculaire reactiviteit in reactie op verschillende behandelingen.
- Demonstratie van de voordelen van deze methode ten opzichte van traditionele technieken.
- Inzichten in de fysiologische mechanismen van HPV.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt een gedetailleerde analyse van HPV in muismodellen mogelijk.
- Deze methode verbetert het begrip van pulmonale vasculaire reacties op hypoxie.
- Toekomstige studies kunnen op deze techniek voortbouwen om therapeutische interventies te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of hypoxic pulmonary vasoconstriction in murine intra-pulmonary arteries, a key mechanism in matching perfusion to ventilation. By providing access to vessels 20-100 μm in diameter that are inaccessible to conventional techniques, it supports mechanistic de-risking in pulmonary vascular target validation. The approach delivers reproducible, shear-stress-free vasoreactivity data that can inform early discovery decisions for hypoxia-modulating compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses targeting hypoxic pulmonary vasoconstriction pathways in physiologically relevant arterial segments.
- Operational Value: Provides quantitative luminal area measurements as a functional readout for target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating contractile responses in intra-acinar and pre-acinar arteries under controlled hypoxic conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized lung slice preparations suitable for compound screening against hypoxic vasoconstriction endpoints.
- Quantitative Output: Delivers time-resolved luminal area changes enabling EC50/IC50 determination for vasoactive compounds.
- Scalability: Uses precision cut lung slices to allow parallel testing of multiple arterial cross-sections per lung lobe.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models a core physiological mechanism implicated in pulmonary hypertension and ventilation-perfusion mismatch.
- Translational Continuity: Bridges ex vivo vascular reactivity to in vivo hypoxic responses through measurable arteriolar tone.
- Mechanistic De-risking: Clarifies contribution of specific arterial segments (intra-acinar vs pre-acinar) to overall hypoxic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative vasoreactivity data that informs hit-to-lead progression in pulmonary vascular programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of hypoxic signaling pathways in arterial subtypes using videomorphometric luminal area as a primary readout.
- Screening: Enables assay development for compounds modulating HPV via standardized, reproducible vessel preparation and imaging.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (luminal area %) that allow comparison across treatment conditions and compound concentrations.
- Translational Research: Connects ex vivo arteriolar responses to pathophysiological mechanisms of hypoxic pulmonary vasoconstriction in lung disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating vascular reactivity across multiple compounds and genetic models in pulmonary discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in HPV by enabling direct observation of vasoconstriction in resistance-sized pulmonary arteries.
- Operational Value: Standardizes vascular reactivity assessment through controlled agarose filling, sectioning, and superfusion conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy and specificity data for hypoxia-targeting compounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on validated arteriolar responsiveness in disease-relevant segments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine lung dissection, agarose perfusion, and vibratome sectioning.
- Depends on phase contrast microscopy and image analysis software for luminal area quantification.
- Necessitates standardized gas control systems for normoxic/hypoxic medium perfusion and airway gassing.
- Involves optimization of slice incubation and washout periods to ensure agarose removal and vascular viability.
- Limited to ex vivo acute responses; chronic remodeling or structural changes require complementary models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:44
Isolation of Murine Lungs and Preparation of Precision Cut Lung Slices
6:05
Videomorphometric Analysis of Intrapulmonary Arteries of Precision Cut Lung Slices
8:50
Analysis of Vasoreactivity and Graphic Presentation
9:30
Results: Hypoxia-induced Vasoconstriction of Pre-acinar and Intra-acinar Arteries
12:42
Conclusion
