Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van spiegelende intrapulmonale arteriën met innerdiameter van 20 tot 100 micron. Dit wordt bereikt door eerst de luchtwegen van de longen te vullen met laagsmeltende agarose. De tweede stap is het gebruik van een vibratoom om de geïsoleerde longen in plakjes van 200 micron dikte te snijden.

Vervolgens wordt de aros verwijderd uit de longcoupes door incubatie in warm medium bij 37 °C, waarin normoxisch gas wordt gebubbeld, zodat de coupes langzaam in de vloeistof bewegen. Daarna wordt een individuele longcoupe overgebracht naar een flow-through superfusiekamer, gevolgd door een videomorfometrische analyse van de vasoreactiviteit van de dwarsdoorsnede van de arterie.

Uiteindelijk worden veranderingen in het luminale oppervlak van het vat als reactie op verschillende behandelingen geëvalueerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intravitale microscopie van subpleurale microvaten of het meten van de vasculaire spanning in geïsoleerde proximale longslagaders, is dat het de kwantitatieve analyse mogelijk maakt van de VA-reactiviteit van intrapulmonale slagaders met diameters tussen 20 en 100 micrometers. De procedure zal worden gedemonstreerd door Anna Goldenberg en twee technici van dit laboratorium.

Open direct na het doden van een muis door middel van cervicale dislocatie de buikholte, schuif de darmwindingen opzij en doorsnij de grote abdominale vaten om bloedingen te veroorzaken. Gebruik vervolgens een fijne schaar om het diafragma te doorprikken. Dit zorgt ervoor dat de longen inklappen als gevolg van luchttoetreding in de pleuraholte.

Snijd verder om het diafragma los te maken van de onderste borstopening. Snijd nu de ribben en het sleutelbeen lateraal door. Om het ventrale deel van de borstkas te verwijderen, dient de thymus te worden uitgenomen.

Vul een spuit met warme perfusiebuffer. Maak vervolgens een klein gaatje in de linker ventrikel van het hart. Pas de uitstroom van de perfusiebuffer aan en perfundeer de pulmonale vasculatuur langzaam via de rechter ventrikel totdat de longen wit kleuren.

Verwijder vervolgens de speekselklieren, kleine spieren en het bindweefsel van de trachea. Ontkoppel de trachea van het omliggende bindweefsel en plaats een stukje naaigaren tussen de slokdarm en de trachea voor latere ligatie. Gebruik daarna een microschaar om een klein gaatje in het bovenste gedeelte van de trachea te maken, tussen twee aangrenzende tracheaal kraakbeenen.

Nadat een spuit is gevuld met op 37 graden Celsius verwarmde, laagsmeltende agarose, sluit u deze aan op een flexibele plastic canule en duwt u de zuiger langzaam in totdat de lucht uit de canule is verwijderd. Voer de canule in het kleine gaatje in de trachea in en veranker deze voorzichtig op zijn plaats met naaigaren. Vul vervolgens langzaam de luchtwegen met de agarose en observeer de longen.

Eerst begint de rechterlong uit te zetten, gevolgd door de linkerlong. Na 30 tot 40 seconden is de vulling voltooid en zijn beide longen opgeblazen tot een volume dat vergelijkbaar is met de in vivo situatie, wat ongeveer 1,2 tot 2,0 milliliters is. Afhankelijk van geslacht, leeftijd en gewicht is het belangrijk om de eier-roos snel genoeg te injecteren zodat deze tijdens de procedure niet stolt, maar niet zo snel dat de longen beschadigd raken.

Nadat de longen gelijktijdig zijn gevuld, trekt u de plastic canule eruit en ligatureert u de trachea met hechtgaren om lekkage van de agros te voorkomen. Snijd vervolgens de trachea boven de ligatuur door en, om de longen en het hart als blok uit de borstkas te verwijderen, brengt u de organen over in ijskoude heaps Ringer-buffer om de agros te laten stollen, wat binnen enkele minuten gebeurt terwijl u wacht. Gebruik secondelijm om een stukje champagnekurk aan de monsterhouder van de vibrator te bevestigen, die dient als steun voor het longweefsel. Nadat de agros is gestold, scheidt u de individuele longkwabben.

Breng vervolgens secondelijm aan om één lob aan de specimenhouder te bevestigen. Om dwarsdoorsneden van de kleine intra-asner-arteriën te verkrijgen, neemt u de craniale lob van de rechterlong en lijmt u deze met het hilumoppervlak aan de houder; gebruik vervolgens een vibrato die is uitgerust met een nieuw scheermesje om vanaf de periferie te snijden, waarbij de longlob in plakjes van 200 micron dik wordt gesneden. Om dwarsdoorsneden van de grotere pre-aser-arteriën te verkrijgen, lijnt u het hilum van de linkerlong uit met de champagnekurk en lijmt u de lob in deze oriëntatie aan de houder, waarna vanaf de periferie wordt gesneden voor verwijdering van de aros.

Breng de organesecties over in een glazen bekerglas gevuld met ongeveer 200 milliliters MEM bij 37 degrees Celsius. Plaats het bekerglas in een warmtekast en spoel met normoxisch gas zodat de longsecties langzaam in het medium bewegen. Na ongeveer twee uur zullen de luchtbellen uit het longweefsel zijn verdwenen en zullen de secties naar de bodem van het bekerglas zijn gezakt.

Voor de videomorfometrische analyse van intrapulmonale arteriën wordt één longsectie overgebracht naar de flow-through superfusiekamer, die is gemonteerd op een microscoop en is gevuld met 1,2 milliliters normoxisch gegasde MEM. Fixeer de longsectie op de bodem van de kamer met nylon draden die verbonden zijn met een platinaring. Start de perfusie van de kamer met normoxisch gegasde medium.

Gebruik een fasecontrastmicroscoop met een 10 x objectief om de longsectie te scannen op dwarsdoorsneden van slagaders met een binnendiameter tussen 20 en 100 microns. Zodra een geschikt kandidaatvat is gevonden, gebruik dan het 20 x objectief om een foto te maken van een pre-asner vat of, zoals hier getoond, het 40 x objectief om een foto te maken van een intra-asner slagader voor de meting van de binnendiameter van het vat. Stel vóór aanvang van het experiment de software zo in dat er elke minuut gedurende het gehele experiment foto's van de dwarsdoorsnede van de slagader worden gemaakt.

Nadat de fotografie is gestart, wordt de kamer gedurende 10 minuten verder geperfuseerd met normoxisch gast-medium. Bad vervolgens de longsectie 10 minuten in U 466 19 zonder doorstroming om de contractiliteit van de arterie te analyseren, waarbij alleen vaten worden gebruikt waarvan de luminale oppervlakte met ten minste 30% is afgenomen door de U 466 19. Spoel het geneesmiddel gedurende 10 minuten uit met normoxisch gast-medium.

Dilate vervolgens de arterie door res gedurende 10 minuten toe te dienen zonder doorstroming. Verwijder het geneesmiddel vervolgens opnieuw met een spoeling van 10 minuten met normoxisch gasvormig medium bij een stroomsnelheid van 6 ml/min, gevolgd door 10 minuten bij een stroom van 0,7 ml/min. Incubeer de longslice daarna 40 minuten met hoog hypoxisch gasvormig medium.

Laat tevens het hypoxische gasmengsel via een extra set slangetjes in de luchtruimte van de perfusiekamer stromen. Verwijder het hypoxische medium door 20 minuten te spoelen met normoxisch gegasst medium en schakel de gasstroom naar de luchtruimte van de kamer over van hypoxisch naar normoxisch om de levensvatbaarheid van het vat te controleren. Breng aan het einde van het experiment U 466 19 aan in de perfusiekamer en incubeer dit 20 minuten zonder doorstroming om vasoconstrictie op te wekken.

Herhaal deze stappen met een nieuw longdoorsnede om de vasoreactiviteit van een ander bloedvat te meten. Begin de analyse door de beelden van de dwarsdoorsneden van de slagaders te laden in een programma voor beeldanalyse. Gebruik vervolgens een cursor om het luminale oppervlak van het bloedvat te omlijnen.

Het drogen van de hand is noodzakelijk om artefacten te voorkomen die bijvoorbeeld ontstaan door bloedcellen die aan de vaatwand kleven. Analyseer de dwarsdoorsnedebeelden op een soortgelijke wijze verder. Elk beeld moet worden geanalyseerd wanneer een conditie in de flow-through incubatiekamer wordt gewijzigd; wanneer de condities niet veranderen, is het analyseren van om het ene beeld over te slaan echter voldoende.

Hypoxische pulmonale vasoconstrictie is waarneembaar in deze fasecontrastbeelden van een dwarsdoorsnede van een pre-ASIN-slagader, die zich in nauwe nabijheid van een dwarsdoorsnede van een bronchus bevindt. De beelden zijn genomen op tijdstippen die zijn aangegeven met cirkels in de grafiek: aan het begin van de meting, aan het einde van de meting met U 466 19, aan het einde van de blootstelling aan RAs, na 30 of 40 minuten in een hypoxisch gegast medium, na het wassen met een normoxisch gegast medium, en na de uiteindelijke toediening van U 466 19. De vasoreactiviteit wordt geregistreerd als relatieve veranderingen van het luminale areaal van de dwarsdoorsnede van de slagader ten opzichte van de tijd. Het areaal aan het begin van het experiment is gedefinieerd als 100% en vasoconstrictie wordt weergegeven als waarden relatief aan het initiële areaal.

In dit geval induceert blootstelling aan hypoxie een reductie van 60% van het luminale oppervlak voor een duidelijkere presentatie van de hypoxische respons. De initiële fase van het experiment waarin de vasculaire reactiviteit werd getest wordt hier niet getoond, en de waarde die direct vóór blootstelling aan verminderd zuurstof werd verkregen, is gesteld op 100%. Het andere type vaten dat in deze studies is onderzocht, zijn de intra-ASIN-arteriën, die zich bevinden bij de plooien van de alveolaire septa. In deze reeks experimenten wordt hiervoor de impact van sidal, een niet-selectieve opener van mitochondriale ATP-gevoelige kaliumkanalen, op de hypoxische pulmonale vasoconstrictie van kleine intra-ASIN-arteriën geanalyseerd.

Sneden worden geïncubeerd in hypoxisch medium. In afwezigheid of aanwezigheid van 50 µM sidal worden controle-incubaties uitgevoerd in normoxisch gastmedium voor een duidelijkere presentatie van de respons op normoxie, hypoxie of hypoxie plus sidal. De waarden die direct voor blootstelling aan normoxisch of hypoxisch gastmedium zijn verkregen, worden vastgesteld als 100%. De arterie die is blootgesteld aan pineal vertoont geen afname in oppervlakte, in tegenstelling tot de arterie die is geïncubeerd in hypoxisch medium zonder additieven.

In normoxisch medium zijn geen veranderingen in het luminale oppervlak detecteerbaar. De opnames van kleine intra-ASIN arteriën die zijn blootgesteld aan hypoxisch gast-medium met of zonder 50 micromolar sidal worden gepresenteerd als gemiddelden plus of minus SEM. In deze grafiek worden de relatieve gegevens ten opzichte van de waarde aan het begin van de hypoxische incubatie weergegeven.

Er is geen vasoactiviteit detecteerbaar. In de longcoupes die zijn blootgesteld aan hypoxisch gas, wordt de door U 466 19 geïnduceerde pineale vasoconstrictie in het medium niet beïnvloed door het geneesmiddel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u precisie-instrumenten voorbereidt, longcoupes snijdt en hoe u deze gebruikt voor de kwantitatieve meting van de VA-reactiviteit van kleine intra-alveolaire arteriën met diameters tussen 20 en 40 µm, die zich in de alveolaire septa bevinden, en van grotere pre-alveolaire arteriën met diameters tussen 40 en 100 µm, die naast bronchiën en bronchioli lopen.