Name: Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer exosoomisolatie en kwantificering uit menselijk bloed met nanoparticle tracking analysis. Deze semi-geautomatiseerde methode optimaliseert NTA-instellingen voor nauwkeurige deeltjesmeting in vloeistof.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Christina Ballázs, Hug Aubin en Jörn Hülsmann bedanken voor het kritiek lezen van het manuscript en de uitstekende redactionele ondersteuning. Bovendien bedanken de auteurs Gisela Mueller voor de technische ondersteuning. De auteurs bedanken Particle Metrix GmbH voor het verstrekken van de fondsen die de publicatiekosten dekken.

OPMERKING: De informatie in dit werk experimenten zijn door de institutionele ethische bestuur van de Universiteit van Düsseldorf goedgekeurd. 1. exosome Voorbereiding <ol><li> Verzamel volledig bloed in 3 citraat tubes via venapunctie (totaal 9 ml). Giet het bloed in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Centrifugeer het monster bij 1500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om scheiding van cellen initiëren van plasma. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe 15 ml falcon buis. </li><li> Centrifugeer het monster bij 2800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om alle cellen uit het plasma verwijderd (celvrij plasma; CFP). Transfer van het GVB te ultracentrifugeren tubes, 1 ml per buis. </li><li> Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C exosomes afbreken. Verwijder 900 pl supernatant. Resuspendeer de pellet in de resterende 100 pi in de ultracentrifuge buis. Voeg 900 ul PBS. </li><li> Centrifugeer opnieuw bij 100.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder 900 ul van supernatant. Resuspendeer de pellet met de resterende 100 pi. </li><li> Transfer 5 tot 20 gl resuspensie in 40 ml gedestilleerd water. Filter de suspensie door een 450 nm filter om exosomen scheiden van grotere deeltjes. Gebruik deze laatste suspensie voor deeltje meting. </li></ol> 2. Startup orde van de Particle Tracking Instrument <ol><li> Start het programma door te dubbelklikken op de software-icoon. Klik op de verschillende tabs software (&quot;Cell Check&quot;, &quot;Meten&quot;, &quot;analyse&quot;) om te schakelen tussen hen gedurende het protocol. </li><li> Volg de instructies op het scherm voor een geautomatiseerde uitvoering van de opstartprocedure. Selecteer de vakjes voor zowel mobiele kwaliteitscontrole en automatische uitlijning. OPMERKING: Elk van deze stappen kan afzonderlijk indien nodig worden herhaald door de knop (A) of (B) te drukken op het tabblad &quot;cel check&quot;. </li><li> Open de inlaat- en uitlaatpoort van de NTA instrument en injecteer 10 ml gedestilleerd water met een injectiespuit in de cel-kanaal via de inlaat poort. Sluit de uitlaatpoort als laatste hoeveelheid water wordt geïnjecteerd. Plaats een beker onder de uitlaatpoort om afval oplossing te verzamelen. Zorg ervoor dat de meetcel is vrij van luchtbellen en geen luchtbellen niet spuit in het systeem. Sluit de inlaatpoort onmiddellijk. </li><li> Voer de cel kwaliteitscontrole door te klikken op &quot;OK&quot;. De software zal de cel kwaliteit van de resultaten weer te geven na een paar seconden. </li><li> Eventuele deeltjes worden nog steeds zichtbaar in het scherm van de software voor live-view of als het resultaat van de kwaliteitscontrole is alleen goed of slecht is, herhaalt u stap 2.3, totdat de resterende deeltjes worden verwijderd uit de meetcel. Ook herhaal stap 2.3 na elke meting zich deeltjes voorkomen. Als het herhalen van het gedestilleerd water injectie en mobiele controle leidt niet tot een &quot;goed&quot; resultaat, gaat u verder met 2.9. </li><li> Bereid een controle suspensie die uniform 200 nm en kleinbedrijf polystyrene deeltjes worden gebruikt om de foci van de laser en microscoop lijn. Één druppel van de suspensie concentraat, door de fabrikant van het instrument 500 ml gedestilleerd water tot de gewenste concentratie zodanig dat 600 ± 100 deeltjes worden weergegeven per scherm in de live weergave te verkrijgen. </li><li> Injecteer de uitlijning schorsing in de NTA instrument zoals beschreven in stap 2.3. Druk op &quot;OK&quot; om de automatische uitlijning, een geautomatiseerde routine waarmee het systeem automatisch de optimale positie van de twee brandpunten vindt starten. </li><li> Wanneer u een waarschuwing waarin staat het systeem is nu klaar voor experimenten, klik op OK om de meting te starten. </li><li> Soms reinigen cel kanaal handmatig tussen experimenten door spoelen van de cel met een oplossing van ethanol 30%. Reinig het kanaal wanneer de software geeft een automatische foutmelding. </li></ol> 3. Meting van monster <ol><li> Spoel het kanaal met gedestilleerd water voorafgaand aan each monster meting (zoals beschreven in stap 2.3). </li><li> Injecteer de exosome suspensie (opgesteld in hoofdstuk 1) in om het kanaal, zoals beschreven in stap 2.3. </li><li> Pas de volgende belangrijkste parameters in de software zo nodig: <ol><li> Gevoeligheid. Om het optimale bereik gevoeligheid vinden, klik op de knop &quot;aantal deeltjes vs. Gevoeligheid&quot; om een ​​curve voor de gemeten deeltjes per scherm voor verschillende gevoeligheid niveaus weer te geven. Koos een gevoeligheid niveau van voor de maximale helling van de curve. Een hoger niveau gevoeligheid maakt visualisatie van meer kleine deeltjes, maar verhoogt ook de kwesties in verband met achtergrondgeluid. </li><li> Minimale helderheid. Koos voor een beginnend helderheid van 20 voor exosome meting om deze functie te gebruiken als een filter. Reguleren van deze parameter tot lege out sterk licht-verstrooiende deeltjes. Reguleren het neer te zwak versterken verstrooiing artefacten. Variëren helderheid indien nodig gedurende het experiment. OPMERKING: Deeltjes die licht-strooien te sterk overlappen en kan uit de analyse per ongeluk worden uitgesloten. </li><li> Min en Max Size. Stel een digitaal filter pixel ruis en ongewenste verstrooiing van grote deeltjes te elimineren door het reguleren van de minimale en maximale maat. Gebruik een bereik van 10 tot 500 pixels voor meting van exosomes. </li><li> Sluiter. Stel de tijd dat de camera is geopend tot 1/300 sec. </li></ol></li><li> Leef uitgelezen parameters: <ol><li> Schakelen tussen een digitale en een analoge weergave modus op elk punt door te klikken op de &quot;live-image&quot; knop. </li><li> Gedurende het experiment, het toezicht op de verstrooiing Intensity bar, die de verzadiging status van het monster als een kleurgecodeerde indicator geeft. Niet exosomen analyseren of de verstrooiing bar is rood. In een dergelijk geval het monster om dit fenomeen te voorkomen verder verdunnen. Indien de experimentele conditie verbiedt manipulatie van het monster suspensie, down-reguleren van de gevoeligheid of omhoog reguleren van de helderheid in de software-snstellingen de meetresultaten verbeteren. OPMERKING: Bij monsters met een zeer hoge concentratie van deeltjes worden geanalyseerd de scatter zal individuele deeltjes te smelten en ze worden geteld als één enkel deeltje. </li><li> Noteer het aantal deeltjes meegeteld in het gezichtsveld van het scherm. </li></ol></li><li> Klik op het tabblad &quot;Meten&quot;. </li><li> Kies instellingen in de &quot;run-opties&quot; array. <ol><li> Vóór elke acquisitie, selecteer &quot;check beweging &#39;voor een herhaalde controle deeltje drift test. De proef wordt ten minste eenmaal voordat de gehele analyse. Als de drift groter dan 20 um / sec wachten alvorens verder de meting zodat het monster stopt stroomt. </li><li> Selecteer het aantal experimenten (5) en de tijdvertraging tussen hen (0). </li><li> Voer een &quot;sample check &#39;indien nodig. Deze test is onderdeel van de automatische aanpassing van de opstartprocedure en kan daarna worden herhaald worden. </li&gt; </ol></li><li> Klik tot slot op de &quot;run video acquisitie&quot; knop. In het nieuwe venster definieert het aantal cycli (15) en het aantal meetposities (11). OPMERKING: De laserkop en de microscoop kan worden verplaatst om het deeltjesaantal te analyseren 11 verschillende posities. Afhankelijk van de experimentele demand besluiten of de proef worden uitgevoerd op een enkele plaats of op verschillende plaatsen. <ol><li> Bevestig de minimale tijdsduur een deeltje moet worden gevolgd om te worden geteld als een individueel deeltje door het instellen van de videoresolutie (laag). Een lagere resolutie heeft een kortere duur volgen. </li><li> Selecteer een bestandsnaam en klik op &quot;OK&quot; om de meting te starten. </li></ol></li></ol> 4. Interpretatie van de resultaten <ol><li> Bekijk de volgende resultaten en parameters weergegeven na de meting op het tabblad &quot;resultaten&quot;: (1) het totale aantal deeltjes getraceerd, (2) het gemiddelde aantal particles per positie, en (3) deeltjesconcentratie. <ol><li> Bekijk het resultaat gemiddelde tabel voor de numerieke verhouding van de deeltjesgrootte (diameter, oppervlak en volume) het percentage deeltjesaantallen, evenals waarden van gemiddelde en standaard differentiatie. </li><li> Gebruik de piek analyse tafel als er meer dan één piek bestaat in de grafische analyse. Deze tabel toont de verdeling van deeltjes die kleiner zijn dan de eerste respectievelijk tweede piek. </li></ol></li><li> Bekijk de grafiek berekend na de meting tot een verdeling van de deeltjes naar grootte te zien. Gebruik de pictogrammen in de weergavemodus en boven de grafiek om de instellingen te wijzigen. </li></ol>

<ol><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037(2012).</li>
<li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006(2012).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li>
<li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+surfaces.+B%2C+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li>
<li>Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview">http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview</a> (2015).</li>
<li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes%2C+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+J.+Phys.+Renal+Phys%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li>
<li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Company+profile%3A+NanoSight%3A+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li>
<li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22International+immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door de institutionele fondsen van de afdeling Cardiovasculaire Chirurgie, Medische Faculteit, HHU. De publicatiekosten van deze studie werden betaald door Particle MetrixGmbH.

We tonen een gedetailleerd protocol voor exosome isolatie van bloed en het heden nanodeeltjes volgen als een nieuwe en innovatieve methode om exosome omvang en concentratie te meten in een biologische vloeistof. In de gepresenteerde experimenten werd humaan perifeer bloed als de oorsprong van de exosomes. Echter, andere oorsprong, zoals urine, sputum, celkweeksupernatant, etc., kunnen ook worden gebruikt als testmateriaal. Op basis van de biologische variabiliteit van exosome concentratie bij mensen, kunnen analyses van verschillende individuen opvallend verschillende concentraties van exosomes kenmerken. Echter, de concentratie van deeltjes in de biologische test sonde invloed op de resultaten. Daarom is een betrouwbare en gestandaardiseerde procedure voor de verdunning van probes nodig. In de gepresenteerde methode exosome bevattende plasma gegenereerd uit 9 ml van perifeer volbloed. Met differentiële centrifugatie stappen een exosome pellet werd geïsoleerd uit1 ml plasma en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml gedestilleerd water om te resulteren in de werking monster gesuspendeerd exosomes. Deze voorgedefinieerde instelling heeft ons voorzien van een goede concentratie van deeltjes, dat wil zeggen, de juiste scatter intensiteit tijdens de NTA. Naast het aspect volume en verdunning, de samenstelling van de oplossingen die worden gebruikt ook van belang. We hebben gedestilleerd water gebruikt voor de uiteindelijke re-opschorting van exosomen. Natuurlijk verschillende media voor de laatste verdunningsstap kunnen ook worden gebruikt, volgens de eisen van de experimentele opstelling. In het geval van zeta potentiaal metingen van ionische oplossingen, vooral bij het testen monsters met een buffercapaciteit, een voorzichtige verdunning in turbulentievrije omstandigheden nuttig. Voor de directe vergelijking van meerdere monsters aanbeveling het dezelfde verdunning niveau voor alle monsters. Alle instellingen behalve de gevoeligheid en de videoresolutie kan achteraf worden gewijzigd met behulp van de ZetaView Analysis software. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Hoewel de auteurs zijn van mening dat de hier geïntroduceerde systeem is op dit moment het meest geschikte instrument, het is niet de enige beschikbare NTA systeem. Een aantal eerdere rapporten hebben andere systemen die dezelfde NTA principes toe te passen, maar bieden een ander instrument ontwerp dat gaat samen met een aantal verschillende functies 10 in dienst. Wij zijn van mening dat de praktische aspecten met betrekking tot het behandelen van het monster en de reproduceerbaarheid van de resultaten zijn van cruciaal belang bij het kiezen van de methodologische volgorde voor exosome evaluatie. We geloven ook dat een ideaal detectiesysteem user-afhankelijk factoren die kunnen interfereren met de resultaten van de metingen te elimineren. De exosome analyse aanpak die hier gepresenteerd voldoet aan het criterium van gebruiksgemak hoge mate. Als een verder voordeel wordt de semi-automatische analyse van de monsters uitgevoerd in een snel proces, genereren resulteert in een korte tijd. Een online visualisatie van exosomen helpt de analysator te GAin een oogwenk idee van de exosome kenmerken, bijvoorbeeld, bruto concentratie. Een zeer eenvoudige doch elegante aanvulling op de meettechniek hier gepresenteerde is het gebruik van gelabeld antilichaam exosomes en het vastleggen van de verstrooide laserbundel met een voorafgaand filter voor de detector. Zo kan exosome subpopulaties worden onderscheiden naar hun oppervlak antigenen en andere biologisch relevante kenmerken die technisch toegankelijke selectief fluorescerende kleuring zijn. Een nadeel van de huidige versie van onze deeltje volgen instrument is dat bij zeer hoge gevoeligheid niveaus artefacten zoals ruis aanwezig kan zijn, die is gebaseerd op de cel kanaalwand. Een technische oplossing en de verbetering van het huidige systeem beschikbaar kan komen in de nabije toekomst. Met deze werkwijze reflecties van de laser strooilicht op de kanaalwand wordt verminderd, waardoor de<html> de nauwkeurigheid van de gemeten signalen en verkregen gegevens en verlagen de detectiegrens. Hoewel de momenteel gebruikte protocol voor exosome isolatie is goed ingeburgerd en de toegepaste deeltjes volgen instrument heeft een opmerkelijk nauwkeurige resolutie lager grootteverdeling van 30 nm, is er geen garantie dat de gedetecteerde deeltjes inderdaad helemaal waar exosomes. Andere deeltjes, zoals dode cellen fragmenten of groter eiwit complexen kunnen ook in de exosoom suspensie en leiden tot vals positieve signalen. Een betrouwbare methode waarmee dergelijke &quot;vervuiling&quot; kunnen worden uitgesloten elektronenmicroscopie (EM), ofwel transmissie EM of scannen EM zijn. Helaas, geen algemene en specifieke marker voor exosomen tot dusver geïdentificeerd, hoewel een aantal van de eerder voorgestelde oppervlakte markers hebben opgedaan een toenemende hoeveelheid aandacht, waaronder tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, enz. 11. &quot;&gt; Ongeacht de toekomstige vooruitgang onderzoek naar exosome biologie, met name betreffende exosome specifieke markers, het protocol dat hier wordt voorgesteld een krachtige werkwijze voor de isolatie en detectie van exosomes verschaffen. Concentratie en grootte gemakkelijk bepaald worden in een software-ondersteunde ongecompliceerde mode. De toevoeging van selectieve fluorescerende markers of fluorfoor gekoppeld antilichamen zal waarschijnlijk verder verbeteren van de mogelijke toepassingen van de gepresenteerde aanpak van de NTA.

De exacte functie van circulerende exosomes bleef onbekend lange tijd. Zelfs nu het volledige pad mechanisme exosomes is niet volledig begrepen. Sinds exosomen dragen antigenen, eiwitten en RNA (mRNA en miRNA) die hen betrekking heeft op hun ouderlijke cel van herkomst, hun functie als cel-cel signalering zenders heeft vooral prioriteit gegeven. Vele verschillende werkwijzen in de literatuur beschreven voor de isolatie en kwantitatieve detectie van exosomes 1,2. Er is echter geen consensus over een &#39;gouden standaard&#39; is bereikt. Inmiddels is de meerderheid van de wetenschappers die actief zijn op het gebied van exosome onderzoek het erover eens dat een consistente methode van isolatie zeer gerechtvaardigd is om een ​​hogere mate van vergelijkbaarheid van de verschillende rapporten en studies te bereiken. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) is de meest voorkomende en voorkomende instrument exosome analyse 3. FACS heeft de BenEFIT dat via fluorescentie labeling cellen van verschillende oorsprong kunnen worden vergeleken in een stap. De belangrijkste nadelen van FACS zijn dat deze methode niet gevoelig genoeg om deeltjes kleiner dan 0,5 pm 4 identificeren, terwijl exosomes algemeen tussen 30-120 nm in diameter 5, nog minder om hun grootte te meten. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zijn andere instrumenten voor het analyseren van deeltjesgrootte en morfologie van exosomes. Zowel SEM en TEM hebben het nadeel dat monstervoorbereiding is tijdrovend, beide werkwijzen omvatten arbeidsintensieve stappen en elk enig risico artefact generatie. Noch methode is geschikt voor hoge sample throughput en karakterisering van verschillende duizenden enkele deeltjes van één monster. Bovendien is een kwantitatieve analyse van klinische dagelijkse routine waar monsters vaak gelijktijdig of tenminste geanalyseerd in een zeer korte periodemoeilijk uit te voeren. Nieuwe generatie technieken maken ons nu op exosomen analyseren zonder voorafgaande intensieve voorbereidende werkzaamheden (bijvoorbeeld milieu SEM). Deze moderne technieken zijn nog steeds vrij lastig voor het analyseren van grote hoeveelheden suspensies die exosomen om hun gemiddelde aantal en de grootte distributie 6 te bepalen. Een andere zeer gevoelige werkwijze voor visualisatie en analyse van exosomes is nanodeeltjes bijhouden analyse (NTA). Deze methode maakt gebruik van twee verschillende principes van de fysica. Eerst worden deeltjes gedetecteerd door het verstrooide licht wanneer ze worden bestraald met een laserbundel. Het tweede fenomeen is bekend als Brownse beweging, volgens welke de diffusie van verschillende deeltjes in een vloeibare suspensie is omgekeerd evenredig met hun omvang. In het laatste geval de beweging ook afhankelijk van de temperatuur en de viscositeit van de vloeistof. Toch wordt dit percentage direct gerelateerd aan de deeltjesgrootte en wordt gebruikt NTA. Met behulp van zachteware-gebaseerde analyse, digitale beelden van verstrooid licht van enkele deeltjes worden opgenomen. Percelen van verstrooid licht vlekken en hun snelheid van de beweging te verstrekken van de gegevens die de bepaling van de totale telling deeltje en grootteverdeling vergemakkelijken. Deze techniek is bijzonder krachtig voor het analyseren van deeltjes met een gemiddelde diameter van minder dan 100 nm. De omvang en concentratie metingen worden uitgevoerd met de ZetaView Brownse en Elektroforese Motion Video Analysis Microscoop. Dit is een halfautomatisch desk top nanodeeltjes analyseapparaat voor vloeistofmonsters (hierna het deeltje volgen instrument). Het bestaat uit het deeltje volgen analysator en een laptop met de software die voor de gegevensanalyse. Heterogene biologische monsters zijn geschikt voor deze werkwijze meer homogene suspensies van anorganische deeltjes. Een laser verstrooiing microscoop met een videocamera wordt gebruikt voor de detectie van partikels en de observation van hun beweging. Terwijl de microscoop as horizontaal en zich in de cel kanaal gevuld met een suspensie die exosomes, wordt de laserbundel verticaal georiënteerd. De deeltjes bestraald door de laser verstrooien het licht, dat is opgenomen onder 90 ° met een digitale camera via de microscoop (Figuur 1). De intensiteit van het verstrooide licht maakt waarneming van deeltjes groter 60 nm diameter. In een dergelijke omgeving de helderheid van een deeltje is niet het enige indicatie van deeltjesgrootte. Als er geen elektrisch veld wordt toegepast, deeltjesbeweging volgt alleen Brownse beweging en kan als een indicator voor het berekenen deeltjesgrootte dienen. Echter, het instrument kan ook het aanbrengen van een elektrisch veld over de cel kanaal. Bij blootstelling aan dit gebied, de mogelijke, polariteit en het niveau van de ionische lading van de zwevende exosomes worden verder determinanten van de richting van hun beweging. Snelheid en richting resulteren in een elektroforetische mobaarheid histogram. Terwijl vinden van een optimale methode geïsoleerde exosomes analyseren is één probleem, een ander ligt in de effectieve isolatie van exosomen uit verschillende media, zoals bloed, ascites, urine, melk, vruchtwater of celmedium. Verschillende werkwijzen zijn tot nu toe beschreven, die gebaseerd zijn op ultracentrifugatie 1, industrieel scheiding reagentia (zoals Exoquick) 7, magnetische partikels voor antigeen gebruik afscheiding 8 of ultrafiltratie stap 9. In dit protocol tonen we het gehele proces van exosome isolatie via ultracentrifugatie en tonen hoe de verkregen exosoom suspensie via het deeltje volgen instrument te analyseren. Specifieke overwegingen voor de analyse van menselijk plasma of celkweekmedium afgeleide exosomes voorzien.

<table><tbody><tr><td>Citraatbuis</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Falconbuis</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP Tube, Steril 15 ml</td></tr><tr><td>Ultracentrifugatiebuis</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>2.6% Solids-Latex Uitlijningsoplossing</td></tr><tr><td>Spuit (Filter)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Spuit (ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Naald</td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD Blunt Fill Naald</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Spuitfilter, hydrofiel, 450 &micro;m</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Type 101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotor: A-4-44</td></tr></tbody></table>

een innovatieve methode voor exosome kwantificering en size measurement

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Hoewel de biologische belangrijkheid van exosomen recentelijk steeds meer wetenschappelijke en klinische aandacht heeft gekregen, is er nog veel onbekend over hun complexe paden, hun biologische beschikbaarheid en hun diverse functies in gezondheid en ziekte. Huidig werk richt zich op de aanwezigheid en het gedrag van exosomen (in vitro evenals in vivo) in de context van verschillende menselijke aandoeningen, vooral op het gebied van oncologie, gynaecologie en cardiologie.
Helaas bestaat er noch een consensus over een gouden standaard voor exosome-isolatie, noch is er een overeenstemming over een dergelijke methode voor hun kwantitatieve analyse. Aangezien er veel methoden zijn voor de zuivering van exosomen en ook veel mogelijkheden zijn voor hun kwantitatieve en kwalitatieve analyse, is het moeilijk om een combinatie van methoden voor de ideale benadering te bepalen.
Hier demonstreren we nanoparticle tracking analyse (NTA), een semi-geautomatiseerde methode voor de karakterisering van exosomen na isolatie uit menselijk plasma door ultracentrifugering. De gepresenteerde resultaten laten zien dat deze benadering voor isolatie, evenals de bepaling van het gemiddelde aantal en de grootte van exosomen, reproduceerbare en geldige gegevens oplevert, zoals bevestigd door andere methoden, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM).

Het monster voor deze demonstratie toont een optimale instelling van de meting met een gevoeligheid van 85% voordat de maximale helling van de gevoeligheidscurve (figuur 2). De helderheid, de min / max waarden werden gekozen, zoals aanbevolen in het protocol. Een concentratie van 5,3 deeltjes / ml x 10 6 werd gemeten, terwijl de gemiddelde grootte van de deeltjes was 0,149 pm, de meeste van hen waren 0.137 urn. De ontvangen na meetwaarden kunnen worden opgeslagen in een rapport met een bestandsindeling van .pdf of als een .txt voor het exporteren in een database. De grafiek kan worden aangepast voorkeur zoals beschreven in het protocol (punt 4). De videoreeks wordt ook opgeslagen en kan worden gebruikt om later off-line heranalyse. In dergelijke off-line analyse, de pre-acquisitie instellingen van de camera niet achteraf gewijzigd. Om optimale parameterinstellingen vinden waar een meting hier beschreven the optimalisering van de instrumentinstellingen van het voorbeeld van een 100 nm polystyreen standaardmaat. De invloed van twee parameters, gevoeligheid en min / max grootte op videobeeld en deeltjesgrootteverdeling wordt besproken. Alle andere parameters zijn samengevat in tabel 1. Een visuele indruk van de invloed van gevoeligheid (van 50 tot 94) op analoge en digitale beelden wordt gevisualiseerd in figuur 3. De kwantitatieve informatie uit de afbeeldingen is weergegeven in figuur 4, op basis van de instellingen in tabel 1, Min Size = 5 en Max Size = 200. Een typische verhouding van het aantal gedetecteerde deeltjes versus gevoeligheid is getoond in Figuur 4A. Tussen 50 en 90, het aantal gedetecteerde deeltjes verhoogd met gevoeligheid en steeg dramatisch voor gevoeligheden&gt; 90. Een optimale gevoeligheidsbereik gevonden tussen 66 en 86 (A). Deeltjesgrootteverdelingen verkregen met diflende gevoeligheid instellingen worden weergegeven in figuur 4B. De deeltjesgrootteverdeling stellen het gemiddelde van drie afzonderlijke metingen. Voor een te lage gevoeligheid (ISO-waarde = 62, rode curve) slechts een paar deeltjes werden geanalyseerd wat resulteert in vrij slechte statistieken. Het aantal geanalyseerde deeltjes verhoogd met gevoeligheid en bereikte een optimum tussen 70 (gele lijn) en 86 (tan-curve). Een verdere verhoging van de gevoeligheid leiden tot een verslechtering van de deeltjesgrootteverdeling met het aantal deeltjes te laten vallen en grootteverdeling een verschuiving naar kleinere maten (gevoeligheid = 94, blauwe curve). Figuur 4C toont de trend van het aantal gebaseerde x50 diameter (50% van de partikels kleiner is dan deze diameter) als functie van de gevoeligheid. In de beige interval, de RSD deeltjesgrootte minder dan 8% en komt overeen met de optimale interval A. De rode gebieden duiden RSD&gt; 8% als gevolg van slechte statistieken (gevoeligheid te laag) of breed distrimies met verschuiving naar kleinere maten (gevoeligheid te hoog). De instellingen van Min Grootte en Max Size zijn filters toegepast op digitale beelden om deeltjes te verwijderen met spot maten kleiner dan de Min Size en groter dan Max Size. Vanwege het vermogen om licht te verstrooien, een deeltje een vlek van een bepaalde grootte op een digitaal beeld. De grootte van de vlek wordt gemeten als een aantal pixels (px). Als een deeltje verstrooit licht zeer goed (bv deeltjes&gt; 200 nm of aggregaten), ter plaatse grootte is vrij groot, bijvoorbeeld&gt; 500 px. De vlekgrootte is vrij klein (bijvoorbeeld &lt;10 px) voor kleine deeltjes (bijvoorbeeld &lt;20 nm) afhankelijk van het deeltjesmateriaal. Vlekgrootte (px) niet worden verwisseld met deeltjesgrootte (nm) als deze niet identiek zijn en er geen directe relatie tussen deze twee variabelen. Een optimalisatie van Min en Max Grootte kan de gebruiker om te filteren op ongewenste objecten zoals agglomeraten (Max Size) of kleinobjecten zoals achtergrondgeluid (Min Size). De invloed van de Min / Max Grootte op de deeltjesgrootteverdeling van 100 nm groottestandaard wordt getoond in figuur 4D (gevoeligheid = 82). Wanneer het interval is ingesteld op kleine vlek afmetingen (bijv min = 1, max = 52; oranje curve), het aantal geanalyseerde deeltjes wordt verminderd en het aantal gebaseerde x50 diameter enigszins verschoven naar kleinere afmetingen. Een instelling voor grotere spots (min = 40, max = 1000; red curve) in een brede deeltjesgrootteverdeling verschoven naar grotere afmetingen. Om een ​​gelijke totale aantal deeltjes te verkrijgen, werden de intervalgrenzen zowel oranje en rood distributies aangepast tot 80 deeltjes passen. De verdeling met optimale instellingen (min = 5, max = 200; tan curve) bestaat uit 360 deeltjes. Een reeks succesvolle experimenten werden uitgevoerd met exosomes geïsoleerd door ultracentrifugatie en gemeten met gebruikmaking van de NTA systeem. De verkregen gegevens zijn uiterstconsistente en bevestigde een hoge mate van reproduceerbaarheid. Andere isolatie methoden moeten vergelijkbare resultaten te tonen. Echter, de verdunning stap werd geïdentificeerd als een bijzonder belangrijke stap en de impact ervan op de berekende totale aantal deeltjes moet opnieuw worden geëvalueerd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van de opstelling van de NTA. De microscoop / video as en laserstraal zijn orthogonaal georiënteerd elkaar kruisen in het gedeelte cel kanaaldoorsnede. Licht dat door de deeltjes wordt weergegeven in het venster &quot;live view&quot; van de software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figuur 2. Aantal deeltjes versus gevoeligheidscurve. Het aantal deeltjes versus gevoeligheidscurve geeft de deeltjes in een positie op een moment wanneer automatisch gevoeligheid scan. Deze grafische weergave wordt gebruikt om de beste voorkeuren voor de initiële metingen bepalen. Een gevoeligheid waarde wordt voorafgaand aan de maximale helling van de grafiek gekozen. Het is belangrijk te onthouden dat artefacten niet worden geëlimineerd in deze test experiment en kan de grafiek van invloed zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figuur 3. Effect van de gevoeligheid van de analoge en digitale afbeelding. Visualisatie van deeltjes op het live view scherm wordt weergegeven voor gevoeligheden tussen 50 en 94 voor zowel analoge (bovenste rij) eend digitale (onderste rij) uitzicht. Als de gevoeligheid te laag is, worden slechts enkele deeltjes gedetecteerd (links). Bij optimale gevoeligheid weergegeven deeltjes als enkele stippen en geïsoleerd van elkaar (midden). Tegen een relatief hoge gevoeligheid deeltjes samen te voegen samen leidt tot een slechte beeldkwaliteit (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figuur 4. Invloed van de gevoeligheid min en grootte instellingen max voor een controle van 100 nm polystyreen deeltje monster (A) Perceel van sensitiviteit versus waargenomen aantal deeltjes.; het optimale interval 66-86 vóór de maximale helling van de curve. (B) Deeltjesgrootteverdelingen verkregen met verschillende gevoeligheid instellingen (62-94); grafieken voor te laag (62) of te hoog (94) gevoeligheid niet de deeltjesgrootteverdeling voor de 100 nm polystyreen controlemonster vangen. (C) Aantal gebaseerde x50 diameter versus gevoeligheid; de fout van x50 in het beige interval is minder dan 8%, optimale interval van 66 tot 86. (D) Gevolgen van Min en Max Grootte op de deeltjesgrootteverdeling; optimale parameters (min = 5 en max = 200) vastleggen van de juiste verdeling van de te controleren steekproef. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Pre-acquisitie parameters </td></tr><tr><td> Gevoeligheid </td><td> veranderlijk </td></tr><tr><td> Sluiter </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Frame rate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Resolutie </td><td> High </td></tr><tr><td> Cycli </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Meerdere Overnames </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Positie </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Post-acquisitie parameters </td></tr><tr><td> Min Helderheid </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Size </td><td> veranderlijk </td></tr><tr><td> Min Size </td><td> veranderlijk </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Samenvatting van pre- en post-acquisitie parameters voor het instellen van de deeltjes volgen instrument.

In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.

Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Het doel van deze procedure is om exosomen te analyseren op basis van hun grootte en ze te kwantificeren met behulp van een nanoparticle tracking analysis (NTA)-instrument via een semi-geautomatiseerde methode. Dit wordt bereikt door middel van differentiële centrifugatiestappen om een exosomenpellet uit menselijk bloed te verkrijgen. De exosomen worden geresuspendeerd in een concentratie die vooraf is bepaald op basis van de hoeveelheid startplasma om de juiste scatterintensiteit te verkrijgen.Tijdens de NTA wordt de suspensie vervolgens gefilterd om exosomen van grotere partikels te scheiden. Daarna wordt een kalibratie van het NTA-instrument uitgevoerd met behulp van een controlesuspensie die polystyreenpartikels van 200 nanometer bevat. De exosomenoplossing wordt vervolgens in het NTA-instrument geïnjecteerd en de ideale instelling van de NTA wordt bepaald door een pretest uit te voeren voorafgaand aan de definitieve test.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de kwantificering van alle gemeten deeltjes tonen en een overzicht van de deeltjes gesorteerd op grootte bieden. De demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de oplossing en de instellingen voor elke bereide exosoomoplossing individueel moeten worden uitgevoerd om de beste resultaten te behalen. De gemeten exosomen moeten een zodanige concentratie hebben dat de live-weergavemodus ongeveer 600 deeltjes per scherm toont.Daarnaast moet er een pretest worden uitgevoerd om het optimale gevoeligheidsbereik voor de meting te bepalen. Een hoge gevoeligheidsinstelling leidt tot de visualisatie van meer kleine deeltjes, maar verhoogt ook problemen met betrekking tot achtergrondruis. De procedure zal worden gedemonstreerd door Anto May, een promovendus uit ons laboratorium. Om te beginnen met de exosoompreparatie, verzamel whol blood in drie citraatbuizen via venapunctie voor een totaal van negen milliliter.Giet het bloed vervolgens in een Falcon-buis van 15 milliliter en centrifugeer het monster bij 1.500 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om de scheiding van cellen uit het plasma te initiëren. Overbreng het supernatant naar een nieuwe Falcon-buis van 15 milliliter. Centrifugeer het monster vervolgens opnieuw bij 2.800 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om alle cellen uit het plasma te verwijderen.Breng het celvrije plasma of CFP over naar ultracentrifugeebuizen in volumes van één milliliter per buis. Centrifugeer het CFP vervolgens bij 100 000 G gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius om exosomen te verwijderen. Verwijder 900 microliters supernatant en resuspendeer het pellet in de resterende 100 microliters in de ultracentrifugeebuis.Nadat 900 µL PBS is toegevoegd, centrifugeert u bij 100.000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder, zoals voorheen, 900 µL van het supernatant en resuspendeer de pellets in de resterende 100 µL. Breng vijf tot 20 µL van de resuspensie over in 40 mL gedestilleerd water.Filtreer de suspensie door een filter van 450 nanometer om exosomen van grotere deeltjes te scheiden. Gebruik deze uiteindelijke suspensie voor de deeltjesmeting met het instrument voor deeltjesmeting (particle tracking instrument). Start eerst het programma door dubbel te klikken op het software-icoon.Klik op de verschillende softwaretabbladen om gedurende het protocol tussen deze te schakelen. Volg de instructies op het scherm. Voor een geautomatiseerde uitvoering van de opstartprocedure selecteert u de vakjes voor zowel de celkwaliteitscontrole als de automatische uitlijning.Een van deze stappen kan indien nodig afzonderlijk worden herhaald door op knop A of B op het tabblad 'cell check' te drukken. Plaats een bekerglas onder de uitlaatpoort om de afvaloplossing op te vangen en zorg dat er geen luchtbellen in het systeem worden gespoten. Open de inlaat- en uitlaatpoort van het nanoparticle tracking analysis- of NTA-instrument en injecteer met een spuit 10 milliliters gedestilleerd water via de inlaatpoort in het celkanaal.Sluit de inlaat- en uitlaatpoort onmiddellijk zodra de laatste hoeveelheid water wordt geïnjecteerd. Zorg ervoor dat de meetcel vrij is van luchtbellen. Voer de kwaliteitscontrole van de cel uit door op Okay te klikken.De software toont na enkele seconden het resultaat van de celkwaliteit. Als er nog steeds partikels zichtbaar zijn in het live-viewscherm van de software, of als het resultaat van de kwaliteitscontrole slechts 'goed' of 'slecht' is, herhaal dan de distale waterinjectie totdat de resterende partikels uit de meetcel L zijn verwijderd. Herhaal deze stap bovendien na elke meting om ophoping van partikels te voorkomen. Bereid vervolgens een controlesuspensie voor die uniforme polystyreenpartikels van 200 nanometer groot bevat. Om de brandpunten van de laser en de microscoop uit te lijnen, voegt u één druppel van het door de instrumentfabrikant geleverde suspensieconcentraat toe aan 500 milliliters gedestilleerd water, wat resulteert in de vereiste concentratie zodanig dat 600 plus of minus 100 partikels per scherm in de live-view worden weergegeven.Injecteer de alignementsuspensie in het NTA-instrument, zoals is gedaan bij de gedestilleerde watermeting. Klik op okay om de alignment te starten; dit is een geautomatiseerde routine waarbij het systeem automatisch de optimale positie van de twee brandpunten vindt. Wanneer er een melding verschijnt waarin staat dat het systeem nu klaar is voor experimenten, klikt u op okay om de meting te starten.Reinig het celkanaal af en toe handmatig tussen experimenten door de cel door te spoelen met een 30% ethanoloplossing. Reinig het kanaal telkens wanneer de software een automatisch foutrapport weergeeft. Om een meting van het systeem uit te voeren.Spoel eerst het kanaal met gedestilleerd water voor elke monstermeting. Injecteer vervolgens de exosoomsuspensie in het kanaal. De volgende stap is het aanpassen van de belangrijkste parameters in de software om de gevoeligheid af te stellen.Bepaal het optimale gevoeligheidsbereik door op het aantal deeltjes versus de gevoeligheid te klikken om een curve weer te geven van de gemeten deeltjes per scherm voor verschillende gevoeligheidsniveaus. Kies een gevoeligheidsniveau vóór de maximale helling van de curve. Een hoger gevoeligheidsniveau maakt de visualisatie van meer kleine deeltjes mogelijk, maar vergroot ook problemen met betrekking tot achtergrondruis.Om de minimale helderheid aan te passen, kies dan een beginhelderheid van 20 voor de exosoommeting. Om deze functie als filter te gebruiken, kan deze parameter worden verhoogd om deeltjes met een sterke lichtverstrooiing weg te filteren. Verlaag de waarde om zwakke verstrooiingsartefacten te versterken; pas de helderheid gedurende het experiment aan naar behoefte.Stel vervolgens een digitaal filter in om pixelruis en ongewenste verstrooiing door oversized deeltjes te elimineren. Gebruik voor de meting van exosomen een bereik van 10 tot 500 pixels door de minimale en maximale grootte te reguleren. Pas de sluiter aan door de tijd dat de camera openstaat te wijzigen door de sluiter op 300 in te stellen, wat gelijk staat aan 3,3 milliseconden.Om de parameters van de live-uitlezing aan te passen, kunt u op elk gewenst moment schakelen tussen een digitale en analoge weergavemodus door op de knop voor het live-beeld te klikken. Controleer gedurende het experiment de balk voor de verstrooiingsintensiteit, die de verzadigingsstatus van het monster weergeeft als een kleurgecodeerde indicator.Analyseer geen exosomen als de scatter-balk rood is. Klik op het tabblad metingen om de meting te starten. Kies de instellingen in de array met run-opties.Select vóór elke acquisitie de optie 'check movement', voer een herhaalde 'check particle drift'-test uit, selecteer het aantal experimenten en de tijdvertraging daartussen. Voer indien nodig een monstercontrole uit. Klik ten slotte op de knop voor het starten van de videoacquisitie.Definieer in het nieuwe venster het aantal cycli en het aantal meetposities. Bevestig de minimale tijdsduur. Een partikel wordt gevolgd om als één individueel partikel te worden geteld.Door de videoresolutie in te stellen, resulteert een lagere resolutie in een kortere trackingduur. Selecteer tot slot een bestandsnaam en klik op oké om de meting te starten. De curve van het aantal deeltjes versus de gevoeligheid toont de deeltjes in één positie op één tijdstip.Tijdens een automatische sensitiviteitsscan wordt een sensitiviteitswaarde gekozen vóór de maximale helling van de grafiek. Artefacten worden in dit testexperiment niet geëlimineerd en kunnen de grafiek beïnvloeden. De visualisatie van deeltjes op het live-viewscherm is behulpzaam om de juiste sensitiviteitswaarde in te stellen.Een te lage waarde leidt tot de detectie van weinig deeltjes. Terwijl een te hoge waarde resulteert in een matig beeld, verschijnen kwalitatieve deeltjes bij het optimale gevoeligheidsniveau als enkele stippen die goed van elkaar geïsoleerd zijn. Het resultaattabblad na de meting maakt het mogelijk om parameters uit te lezen, waaronder het totaal aantal getraceerde deeltjes, het gemiddelde aantal deeltjes per positie en de deeltjesconcentratie, evenals de numerieke verhouding tussen de deeltjesgrootte en het percentage van het aantal deeltjes.De grafiek die na de meting wordt berekend, toont de verdeling van de deeltjes naar grootte. De iconen in de weergavemodus kunnen worden gebruikt om de instellingen van de grafiek te wijzigen. Daarnaast zijn er verschillende manieren om exosomen te analyseren.Deze methode toont een zeer eenvoudige en elegante manier om een soortgelijke methodeanalyse uit te voeren in een snel proces om in korte tijd resultaten te genereren. Om meerdere monsters te vergelijken, raden wij aan om voor alle monsters hetzelfde verdunningsniveau aan te houden. Alle instellingen accepteren de gevoeligheid, en de videoresolutie kan achteraf worden gewijzigd met behulp van een set analysesoftware.Op deze manier wordt een vergelijkende analyse van gegevens over exosoomhoeveelheid en -grootte, verkregen in verschillende experimenten, op semi-geautomatiseerde wijze mogelijk.

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the use of low-magnification, dark-field microscopy to quantify specific exosomes in small volume biofluidic samples. The exosomes thus identified can serve as potential cancer biomarkers.

Antibody Conjugated Nanoparticle-based Quantification Using Dark Field Microscopy: A Procedure to Capture and Quantify Specific Exosomes from Body Fluids

This video describes a density-based ultracentrifugation technique for isolating exosomes from conditioned media harvested from human embryonic kidney cell cultures using a 25% (w/w) sucrose cushion prepared in deuterium oxide. The isolated exosomes can be used for downstream applications.

Exosome Isolation: A Density-based Ultracentrifugation Technique Using Sucrose Cushion to Separate Exosomes from Conditioned Media of Cultured Cells

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.

Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Extracellulaire vesicles spelen een belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker of als potentiële therapeutische middelen bij geneesmiddelafgifte of regeneratieve geneeskunde. Dit protocol geeft methoden voor de kwantificering en de grootte karakterisering van geïsoleerde en niet-geïsoleerde extracellulaire blaasjes in verschillende vloeistoffen met behulp van instelbare weerstand puls detectie.

Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Exosomen zijn microvesiculaire structuren die in biovloeistoffen worden aangetroffen en mogelijk belangrijke, voor ziekten discriminerende biomarkers dragen. Hier wordt een nieuwe methode gebruikt om specifiek exosomen te extraheren en het exosomale geladene snel te testen op zowel RNA/eiwitdoelen na de verstoring van exosomen met behulp van niet-uniforme elektrische cyclische vierkante golven.

Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Dit protocol beschrijft de haalbaarheid om miRNA-profilering uit te voeren in exosomen, vrijgegeven in plasma van NSCLC-patiënten, door middel van een commerciële exosome-isolatiekit met Proteinase K en RNAse-behandelingen, om circulatie van miRNA-besmetting te voorkomen en hun biomerkerfuncties in NSCLC te evalueren.

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

De klinische vertaling van exosoom biomarkers voor zieke en kwaadaardige cellen wordt belemmerd door het ontbreken van snelle en accurate kwantificatie methoden. Dit rapport beschrijft het gebruik van low-vergroting Dark-Field Microscoop beelden te kwantificeren specifieke exosoom subtypen in kleine volume serum of plasma monsters.

Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

We demonstreren hoe we een nieuw nanodeeltjesvolganalyse-instrument kunnen gebruiken om de grootteverdeling en de totale deeltjesconcentratie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen en menselijk plasma te schatten.

Nanodeeltjes tracking analyse voor de kwantificering en groottebepaling van extracellulaire blaasjes

Leer exosoomisolatie en kwantificering uit menselijk bloed met nanoparticle tracking analysis. Deze semi-geautomatiseerde methode optimaliseert NTA-instellingen voor nauwkeurige deeltjesmeting in vloeistof.

Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Meer video's verkennen