Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement
17 januari 2015
In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.
Het doel van deze procedure is om exosomen te analyseren op hun grootte en ze te kwantificeren door gebruik te maken van een nanopartikel volganalyse of NTA-instrument via een semi-automatische methode. Dit wordt bereikt door differentiële centrifugatiestaps te gebruiken om een exosome pellet uit menselijk bloed te verkrijgen. De exosomen worden opnieuw opgehangen in een concentratie die vooraf is bepaald voor de hoeveelheid startplasma om de juiste verstrooiingsintensiteit te verkrijgen.
Tijdens NTA wordt de suspensie vervolgens gefilterd om exosomen van grotere deeltjes te scheiden. Vervolgens wordt een kalibratie van het NTA-instrument uitgevoerd met behulp van een controle-suspensie die 200 nanometer grote polystyreen deeltjes bevat. De exosome-oplossing wordt vervolgens in het NTA-instrument geïnjecteerd en de ideale instelling van de NTA wordt geselecteerd door een voortest uit te voeren voordat de definitieve test wordt uitgevoerd.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de kwantificering van alle gemeten deeltjes en een opsomming van de deeltjes naar hun grootte laten zien. De demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de oplossing en de instelling voor elke bereide exosome-oplossing afzonderlijk moeten worden uitgevoerd om de beste resultaten te behalen. De gemeten exosomen moeten in een I-concentratie zijn zodat de live view-modus ongeveer 600 deeltjes per scherm weergeeft.
Ook moet een voortest worden uitgevoerd om de optimale gevoeligheidsbereik voor de meting te vinden. Een hoge gevoeligheidsinstelling leidt tot visualisatie van meer kleine deeltjes, maar verhoogt ook problemen met betrekking tot achtergrondruis. De procedure zal worden gedemonstreerd door Anto May, een afgestudeerde student van ons laboratorium Om exosome-voorbereiding te beginnen, verzamel vol bloed in drie citraatbuizen via venepunctie voor een totaal van negen milliliter.
Giet vervolgens het bloed in een 15 milliliter Falcon-buis centrifuge de monster op 1.500 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om de scheiding van cellen uit plasma te initiëren. Breng de S-nascent over naar een nieuwe 15 milliliter Falcon-buis. Centrifugeer vervolgens het monster opnieuw bij 2.800 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om alle cellen uit het plasma te verwijderen.
Breng het celvrije plasma of CFP over naar ultracentrifugebuizen met een milliliter per buis. Centrifugeer vervolgens de CFP bij 100.000 G gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius om exosomen te verdunnen. Verwijder 900 microliters supernatant en suspendeer de pellet in de resterende 100 microliters in de ultracentrifugebuis.
Na het toevoegen van 900 microliters PBS centrifuge, verkrijgt u bij 100.000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder zoals eerder 900 microliters van de supine agent en suspendeer de pellets met de resterende 100 microliters. Breng vijf tot twintig microliters van de Resus-suspensie over naar 40 milliliter gedistilleerd water.
Filter de suspensie door een 450 nanometer filter om exosomen van grotere deeltjes te scheiden. Gebruik deze laatste suspensie voor deeltjesmeting om het deeltjesvolginstrument te gebruiken. Start het programma eerst door op het software-pictogram te dubbelklikken.
Klik op de verschillende software-tabs om doorheen het protocol tussen deze te schakelen. Volg de instructies op het scherm. Voor een geautomatiseerde implementatie van de opstartprocedure, selecteer de vakken voor zowel celkwaliteitscontrole als automatische uitlijning.
Elk van deze stappen kan indien nodig afzonderlijk worden herhaald door op knop A of B op het cell check-tab te drukken. Plaats een beker onder de outlook-poort om oplossingsafval te verzamelen en injecteer geen luchtbellen in het systeem. Open de inlaat- en outlook-poort van het nanopartikel volganalyse of NTA-instrument en injecteer 10 milliliter gedistilleerd water door de inlaatpoort in het cellkanaal met behulp van een spuit.
Sluit de inlaat- en uitlaatpoort onmiddellijk zodra de laatste hoeveelheid water wordt geïnjecteerd. Zorg ervoor dat de meetcel vrij is van luchtbellen. Voer de celkwaliteitscontrole uit door op Oké te klikken.
De software geeft het celkwaliteitsresultaat weer na een paar seconden, als er nog steeds deeltjes worden gevisualiseerd op het live view-scherm van de software, of als het resultaat van de kwaliteitscontrole slechts goed of slecht is, herhaal de distale waterinjectie totdat de resterende deeltjes uit de meetcel zijn verwijderd. Herhaal ook deze stap na elke meting om ophoping van deeltjes te voorkomen. Bereid vervolgens een controle-suspensie met uniforme, 200 nanometer grote polystyreen deeltjes voor. Om de foci van de laser en microscoop uit te lijnen, voegt u één druppel van de suspensieconcentraat toe die door de instrumentfabrikant wordt geleverd, toe aan 500 milliliter gedistilleerd water, wat resulteert in de vereiste concentratie zodat er 600 plus of min 100 deeltjes per scherm worden weergegeven in de live view.
Injecteer de uitlijningssuspensie in het NTA-instrument zoals gedaan voor het gedistilleerd water. Druk op Oké om ook de uitlijning te starten, wat een geautomatiseerde routine is waardoor het systeem automatisch de optimale positie van de twee foci zal vinden. Wanneer er een melding verschijnt die aangeeft dat het systeem nu klaar is voor experimenten, klikt u op oké om de meting te starten.
Reiniging van de cellkanaal handmatig tussen experimenten door het kanaal te spoelen met een 30%oplossing van ethanol. Reinig het kanaal wanneer de software een automatisch foutbericht weergeeft. Om de meting van het systeem uit te voeren.
Spoel eerst het kanaal met gedistilleerd water voorafgaand aan elke steekproefmeting. Injecteer vervolgens de exosome-suspensie in het kanaal. De volgende stap is om de belangrijkste parameters in de software aan te passen om de gevoeligheid aan te passen.
Zoek de optimale gevoeligheidsbereik door te klikken op het aantal deeltjes versus gevoeligheid om een curve voor gemeten deeltjes per scherm voor verschillende gevoeligheidsniveaus weer te geven. Kies een gevoeligheidsniveau voor de maximale helling van de curve. Een hoger gevoeligheidsniveau zorgt voor visualisatie van meer kleine deelt
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van exosomen uit volbloed en het analyseren hiervan met behulp van nanoparticle tracking analysis (NTA) met een semi-automatisch instrument. Deze technologie biedt een zeer gevoelige benadering voor het visualiseren en kwantificeren van deeltjes in een vloeibare suspensie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Exosoomanalyse
Achtergrond
- Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie.
- De isolatie en analyse van exosomen kunnen inzicht bieden in diverse biologische processen.
- Nanoparticle tracking analysis maakt het mogelijk om de partikelgrootte en -concentratie te meten.
- Standaardmethoden voor de isolatie van exosomen vereisen vaak complexe procedures.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van exosomen uit menselijk bloed.
- Het kwantificeren en analyseren van exosomen met behulp van NTA.
- Het optimaliseren van de NTA-instellingen voor nauwkeurige metingen.
Gebruikte methoden
- Afname van volbloed en centrifugatie om plasma te scheiden.
- Ultracentrifugatie om exosomen uit celvrij plasma te isoleren.
- Bereiding van controlesuspensies voor instrumentkalibratie.
- Gebruik van NTA om de partikelgrootte en concentratie te meten.
Belangrijkste resultaten
- De methode isoleert exosomen succesvol met een hoge zuiverheid.
- NTA biedt een gedetailleerde kwantificering van exosoompopulaties.
- Optimale gevoeligheidsinstellingen verbeteren de visualisatie van kleine deeltjes.
- De resultaten tonen de effectiviteit van de semi-geautomatiseerde aanpak aan.
Conclusies
- Deze methode biedt een gestroomlijnde aanpak voor exosoomanalyse.
- De methode kan worden aangepast voor diverse onderzoekstoepassingen in de neurowetenschap en biologie.
- Toekomstige studies kunnen de implicaties van de exosoominhoud bij ziekten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De kwantificering en groottemeting van exosomen zijn cruciaal voor targetvalidatie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor de oncologie, gynaecologie en cardiologie. Nanoparticle tracking analysis (NTA) levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens die bijdragen aan mechanistische risicoreductie en voorspellende betrouwbaarheid bij de vroegtijdige ontwikkeling van biomarkers. Deze semi-geautomatiseerde methode maakt een betrouwbare beoordeling van exosomenpopulaties mogelijk als ziekterelateerde systemen voor translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de exosoomconcentratie en grootteverdeling in menselijk plasma te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via reproduceerbare data voor partikeltracking, gevalideerd met scanning-elektronenmicroscopie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfoliotriage door kwantitatieve exosoommetrieken te leveren voor de beoordeling van het vertrouwen in het target.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde exosoomsuspensies voor voor de standaardisatie van downstream-assays en workflows voor compound-screening.
- Operationele waarde: Levert grootte-opgeloste partikelcounts en concentratiemetingen die essentieel zijn voor de reproduceerbaarheid van assays.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform over meerdere monsters mogelijk via gestandaardiseerde verdunnings- en instrumentkalibratieprotocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt exosoomanalyse in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door middel van consistente kwantificeringsmethoden.
- Ziekte-relevant Systeem: Ondersteunt onderzoek in de oncologie, gynaecologie en cardiologie door de meting van exosomen uit menselijk plasma mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Levert kwantitatieve resultaten die go/no-go-beslissingen in biomarker-gestuurde programma's onderbouwen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot lead-identificatie, door kwantitatieve exosoomgegevens te leveren voor mechanistisch inzicht en assay-gereedheid.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden via grootte-opgeloste exosoomkwantificering uit menselijk bloed.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door middel van reproduceerbare metingen van de partikelconcentratie en grootteverdeling.
- Analytics: Genereert outputs voor partikelconcentratie, gemiddeld aantal partikels per positie en de grootte-percentageverhouding voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via gestandaardiseerde exosoomisolatie en -meting die toepasbaar zijn op ziekteverschijningsmodellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor exosoomanalyse over meerdere projecten heen via gestandaardiseerde NTA-protocollen en kalibratiecontroles.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door kwantitatieve gegevens over de grootte en concentratie van exosomen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van exosomenmetingen tussen verschillende laboratoria.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium binnen biomarkerprogramma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van reproduceerbare exosomenkwantificering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in ultracentrifugatie, nanoparticle tracking analysis en exosoombiologie.
- Vereist een NTA-instrument met software voor de optimalisatie van gevoeligheid, helderheid en digitale filters.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de protocollen voor plasmablutname, centrifugatie en resuspensie.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende monstertypes en beginvolumes van plasma.
- Bevat praktische beperkingen zoals gevoeligheidsafhankelijke achtergrondruis en de noodzaak voor individuele optimalisatie per monster.
