Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

Het algemene doel van deze procedure is om lipidedruppels uit weefsel te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst placentawefsel te dissekeren en te scheiden. Vervolgens worden de cellen van de oleïne gehomogeniseerd.

Vervolgens worden de organellen gescheiden door middel van verschillende centrifugatiestappen. Ten slotte wordt de drijvende laag die de lipidedruppels bevat verzameld en worden de lipidedruppels gekarakteriseerd. Uiteindelijk worden fluorescentiemicroscopie en western blot-analyse gebruikt om de zuiverheid van de lipidedruppelfractie aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om lipiddruppels uit de meeste aortacellen te isoleren. Houd er rekening mee dat in bepaalde weefsels het aantal druppels lager kan zijn, waardoor de drijvende G-laag en het aantal druppels afnemen. Placenta's werden verzameld bij gezonde vrouwen met een enkelingszwangerschap die een electieve keizersneden ondergingen voorafgaand aan het begin van de spontane arbeid op termijn; de proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor de afname van hun placenta.

De verzameling en het daaropvolgende gebruik van placenta's werd uitgevoerd met goedkeuring van de University of Tennessee en de University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville. Institutionele toetsingscommissie in de biologische veiligheidskap, breng de placenta over naar een steriele autoclaveerbare container en was voorzichtig het bloed van de placenta en membranen met steriele zoutoplossing. Gooi de bloederige zoutoplossing in een bekerglas van één liter weg als vloeibaar biologisch afval.

Plaats de placenta op een steriel veld met het gladde oppervlak waar de navelstreng aan vastzit naar boven, gebruikmakend van scherpe, fijne scharen en pincetten. Verwijder de navelstreng en de foetale membranen. Draai vervolgens de placenta om, zodat het maternale oppervlak naar boven is gericht.

Verwijder vervolgens het overliggende weefsel van de basale plaat tot ongeveer drie millimeter vanaf het oppervlak. Disseceer één COTA-lead-in per keer, waarbij de chorio-plate wordt vermeden, en verzamel het villusweefsel in een bekerglas van 250 milliliter met zoutoplossing. Gebruik vervolgens 0,9% steriele zoutoplossing en een pincet om het weefsel meerdere keren te spoelen in een apart bekerglas door te wervelen, waarbij het bekerglas van één liter wordt gebruikt voor het vloeibare afval.

Breng één codi leadin per keer over naar een Petrieschaal van 150 millimeter. Houd deze vast met een pincet en gebruik een scheermesje om het weefsel van de vaten af te schrapen op een Petrieschaal. Plaats het afgeschraapte weefsel in een apart bekerglas met 0.9% steriele zoutoplossing.

Herhaal dit voor alle weefselstukjes. Nadat het geschraapte weefsel is gespoeld in cel-dissociatiebuffer, wordt het overtollige vloeistof afgegoten en het placentawefsel gewogen voor digestie. Verdeel het weefsel na het bereiden van het digestiemengsel door 60 gram van het in totaal verzamelde weefsel over te brengen naar een steriele Helen Meyer-fles van 500 milliliter.

Voeg het mengsel voor weefseldigestie toe aan de kolf met het weefsel en incubeer dit 45 minuten bij 37 °C in een schudapparaat. Bij 150 RPM. Verzamel na de incubatie de gedissocieerde cellen door de kolf te kantelen zodat het weefsel kan bezinken. Verzamel het supernatant.

Zorg ervoor dat er geen ongedissocieerd UND-weefsel wordt verzameld. Voeg een gelijke hoeveelheid HBSS toe aan het supernatant voordat dit wordt overgebracht naar steriele centrifugebuizen van 15 milliliter. Herhaal de dissociatie en het verzamelen van het supernatant met de overige delen van het UND-geassocieerde weefsel voor elke batch na centrifugatie bij 1000 ×g.

Laat het mengsel 15 minuten bezinken door zwaartekracht bij vier graden Celsius en aspireer het supernatant zonder de pellet te verstoren. De placentavillaire cellen bevinden zich voornamelijk in het witte gedeelte van de pellet bovenop de rode bloedcellen. Breng de villaire cellen in het witte gedeelte van de pellet over naar een steriele conische centrifugebuis van 50 milliliter en bewaar deze op ijs.

Nadat de cellen uit alle drie de digestiefasen zijn verzameld, wordt de suspensie gefiltreerd met een nylon celzeef van 100 micron die in de bovenkant van een steriele conische centrifugebuis van 50 milliliter is geplaatst. Als de filtratie van de celsuspensie vertraagt, til de filter dan omhoog om een vacuüm in de buis te creëren. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C en 1000 ×g. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Om de placentavilluscellen te homogeniseren in een biologische veiligheidskast, voegt u een volume ijskoud hypotone lysismedium (HLM) toe dat vier keer zo groot is als het volume van de celpellet.

Gebruik een pipet van 10 milliliter om de cellen voorzichtig en grondig te resuspenderen. Suspendeer de cellen door ze herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Nadat de cellen 10 minuten op ijs zijn geïncubeerd, brengt u ze over naar een ijskoude homogenisator en homogeniseert u de cellen langzaam met de ruim passende stamper door 20 tot 25 voorzichtig slagen toe te passen.

Centrifugeer het lysaat bij 3000 ×g en 4 °C gedurende 10 minuten om ongebroken cellen te verwijderen. Verzamel vervolgens de supernatant in een nieuwe buis voordat u opnieuw centrifugeert bij 25.000 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten. Om de mitochondriën te verwijderen en de lipidedruppels via ultracentrifugatie te isoleren, verzamelt u de supernatant in een centrifugebuis van 50 mL.

Stel de concentratie in op 20% sucrose en breng dit over naar de bodem van een ultracentrifugebuis voor een S SW 28-rotor of gelijkwaardig; bedek het supernatant met aangepaste dichtheid met ongeveer 10 milliliter ijskoud, 100 millimolair natriumcarbonaatbuffer en 0,5 tot 1 milliliter ijskoud HLM om de buis te vullen. Centrifugeer met een S SW 28 swing-out rotor centrifuge bij 130.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Verzamel vervolgens de drijvende laag, stel deze in op 10% sucrose en breng deze over naar de bodem van een 13,2 milliliter ultracentrifugebuis voor een SW 41 TI-rotor of gelijkwaardig; bedek het supernatant met aangepaste dichtheid met ongeveer vijf milliliter ijskoud, 100 millimolair natriumcarbonaatbuffer en 0,5 milliliter ijskoud HLM. Centrifugeer vervolgens bij 274.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 60 minuten. Gebruik in een SW 41 TI-rotor een pipet van één milliliter om voorzichtig de bovenste drijvende laag met lipidedruppels te verzamelen.

Stel het volume bij naar 10%sucrose en breng dit opnieuw over naar een ultracentrifugebuis van 13,2 milliliter voordat er een laag van vijf milliliter ijskoude, 100 millimolaire natriumcarbonaatbuffer en 0,5 milliliter ijskoude HLM wordt aangebracht. Na centrifugatie gedurende 30 minuten wordt met een gebogen PE-pipet voorzichtig de bovenste witte drijvende laag, die de lipidedruppels bevat, verzameld in drie buisjes van 1,5 milliliter met 100 microliters HLM. Karakteriseer de lipidedruppels volgens het tekstprotocol zoals weergegeven in deze figuur; de aanwezigheid van lipidedruppels geïsoleerd uit menselijke placentaire villuscellen werd geverifieerd door kleuring met een neutraal lipidespecifieke fluorescentiekleurstof boda P 4 93 5 0 3 en gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Hier is de zuiverheid van de geïsoleerde fracties van lipidedruppels geëvalueerd middels western blotting met marker-eiwitten voor lipidedruppels, waaronder perilipine 2, calnexine voor het ER (de Golgi-marker), GM130, COX IV voor mitochondriën en plasmamembraan, en MEK1. Na delipidatie van de lipidedruppels met koud aceton werden de eiwitten geëxtraheerd. De fracties werden vervolgens onderworpen aan Western blotting voor perilipine.

Ten tweede werd het lipiddruppelprotein aangetroffen in het post-nucleaire supernatant en in de geïsoleerde witte drijflaag die lipiddruppels bevat. Proteïnen die specifiek zijn voor plasmamembranen, zoals MK 1 en GM 130, werden niet gedetecteerd in de lipiddruppelfracties in beide lagen onder de drijflaag voor spin 4 en spin 5. Zoals eerder gerapporteerd, zijn het proteïne calnexin en een zwakke kleuring van het mitochondriale membraanproteïne COX 4 elders in de lipiddruppelfractie aangetroffen.

Deze resultaten zijn consistent met eerdere rapporten die aantonen dat lipiddruppels interageren met mitochondria in zoogdiercellen en met het ER r. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals proteomische en lipidomische methoden, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te bestuderen, zoals welke factoren aan de druppels gebonden zijn.