Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta
1 april 2014
Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.
Het algemene doel van deze procedure is om lipidedruppels te isoleren uit weefsel. Dit wordt bereikt door eerst placentaweefsel te dissecteren en te scheiden. Vervolgens worden de cellen van de oleïne gehomogeniseerd.
Vervolgens worden de organellen gescheiden door verschillende centrifugatie stappen. Uiteindelijk wordt de zwevende laag met de lipidedruppels verzameld en worden de lipidedruppels gekarakteriseerd. Uiteindelijk worden fluorescentiemicroscopie en westerse bloedanalyse gebruikt om de zuiverheid van de lipidedruppelfractie te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om lipidedruppels te isoleren uit de meeste aortacellen. Merk op dat in bepaalde weefsels het aantal druppels kan onder de grens ligt die de zwevende G-laag vermindert en het aantal druppels. Placenta's werden verzameld van gezonde vrouwen met eenlingzwangerschappen die een geplande keizersnede ondergingen vóór het begin van spontane bevalling bij termsubjecten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het verzamelen van hun placenta.
De verzameling en daaropvolgende gebruik van placenta's werd uitgevoerd met goedkeuring van de Universiteit van Tennessee en de Graduate School of Medicine van de Universiteit van Tennessee in Knoxville. Institutioneel review board in de biologische veiligheidskamer, breng de placenta over naar een steriele autoclaveerbare container en was zorgvuldig bloed van placenta en membranen af met steriele zoutoplossing. Gooi de bloederige zoutoplossing weg in een liter beker als vloeibaar biologisch afval.
Plaats de placenta op een steriele werkplek met deze gladde oppervlakte met de navelstreng naar boven met scherpe, fijne schaar en tang. Verwijder de navelstreng en foetale membranen. Draai vervolgens de placenta om zodat de maternale oppervlakte naar boven gericht is.
Verwijder vervolgens het overliggende basale plaatweefsel ongeveer drie millimeter van het oppervlak. Dissekteer een COTA-leiding tegelijk, vermijd de chorionplaat en verzamel het villoze weefsel in een 250 milliliter beker met zoutoplossing. Gebruik vervolgens 0,9% steriele zoutoplossing en tang om het weefsel meerdere keren in een aparte beker te spoelen door te schudden met behulp van de ene liter beker voor vloeibaar afval.
Breng één codei-leiding tegelijk over naar een 150 millimeter petrischaal. Houd met tang vast en gebruik een scheermes om het weefsel van de vaten te schrapen op een petrischaal. Plaats het geschraapte weefsel in een aparte beker met 0,9% steriele zoutoplossing.
Herhaal dit voor alle weefselstukken. Na het spoelen van het geschraapte weefsel in celdissociatie cve, giet het overtollige vocht af en weeg om het placentaweefsel te verteren. Na het bereiden van het weefselverteringsmengsel, verdeel het weefsel en breng 60 gram van het verzamelde weefsel over naar een 500 milliliter steriele Helen Meyer fles.
Voeg het weefselverteringsmengsel toe aan de fles met het weefsel en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius in een shaker. Bij 150 RPM om de gedissocieerde cellen na de incubatie te verzamelen en de fles te kantelen om het weefsel te laten bezinken. Verzamel de super natin.
Zorg ervoor dat u GEEN gedissocieerd weefsel verzamelt. Voeg een gelijke hoeveelheid HBSS toe aan het supernatant voordat u het overbrengt naar steriele 15 milliliter centrifugebuizen. Herhaal de dissociatie en supernatantverzameling met de resterende porties van UND geassocieerd weefsel voor elke batch na centrifugatie bij 1000 keer.
Zwaartekracht gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius aspireer het supernatant zonder de pellet te verstoren. De placenta villuscellen bevinden zich voornamelijk in het witte deel van de pellet boven de rode bloedcellen. Breng de villuscellen in het witte deel van de pellet over naar een steriele 50 milliliter conische centrifugebuis en bewaar op ijs.
Na het verzamelen van de cellen uit alle drie de spijsverteringsstadia, gebruikt u een 100 micron nylon celstrainer die in de bovenkant van een steriele 50 milliliter conische centrifugebuis is ingebracht om de suspensie te filteren. Als de filtratie van de celsuspensie vertraagt, tilt u omhoog op de filter om een vacuüm in de buis te creëren centrifuge bij vier graden Celsius en 1000 keer zwaartekracht gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren om placenta villuscellen te homogeniseren met vers bereid hypotonisch lysemedium of HLM in een biologische veiligheidskamer, voeg vier keer het volume van de celpellet van ijskoud HLM toe aan de cellen.
Gebruik een 10 milliliter pipet om voorzichtig en grondig te hersus. Suspensie de cellen door ze op en neer te pipetten. Na incubatie van de cellen op ijs gedurende 10 minuten, brengt u ze over naar een ijskoude homogenisator en homogeniseert u de cellen langzaam met de loszittende stamper door 20 tot 25 zachte slagen toe te passen.
Centrifugeer het lysaal bij 3000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om ongebroken cellen te verwijderen. Verzamel vervolgens het supernatant in een nieuwe buis voordat u opnieuw centrifugeert bij 25.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Om de mitochondriën te verwijderen om de lipidedruppels te isoleren door ultracentrifugering, verzamel de super natin in een 50 milliliter centrifugebuis.
Pas aan naar 20% sucrose en breng over naar de bodem van een ultracentrifugebuis voor een S SW 28 rotor of equivalent. Bedek de dichtheidsaanpassing super natin met ongeveer 10 milliliter ijskoud, 100 millimolair natriumcarbonaatbuffer en 0,5 tot een milliliter ijskoud HLM om de buis te vullen met behulp van een S SW 28 zwevende emmer rotor centrifuge bij 130.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Verzamel vervolgens de zwevende laag, pas aan naar 10% sucrose en breng over naar de bodem van een 13,2 milliliter ultracentrifugebuis voor een SW 41 TI rotor of equivalent. Bedek de dichtheidsaanpassing supernatant met ongeveer vijf milliliter ijskoud, 100 millimolair natriumcarbonaatbuffer en 0,5
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken voor het isoleren van cellulaire lipidedruppels uit gistcellen en menselijke placenta's met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugering. De resulterende drijvende laag die de druppels bevat, is gemakkelijk te visualiseren, te extraheren en te kwantificeren door middel van Western Blot-analyse voor zuiverheid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Biochemie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Lipide druppels zijn belangrijke organellen die betrokken zijn bij lipidenopslag en metabolisme.
- Isolatietechnieken zijn cruciaal voor het bestuderen van lipidedruppelfunctie en samenstelling.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugering is een veelgebruikte methode voor het scheiden van cellulaire componenten.
- Fluorescentiemicroscopie en Western Blot-analyse worden gebruikt om de zuiverheid te beoordelen.
Doel van de studie
- Om lipidedruppels te isoleren uit placentaweefsel en gistcellen.
- Om de geïsoleerde lipidedruppels te karakteriseren voor verder onderzoek.
- Om de effectiviteit van dichtheidsgradiëntcentrifugering in dit proces aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Dissectie en scheiding van placentaweefsel.
- Homogenisatie van oliëncellen.
- Scheiding van organellen door middel van meerdere centrifugeringsstappen.
- Verzameling en karakterisering van de drijvende lipidedruppellaag.
Belangrijkste resultaten
- Lipide druppels werden met succes geïsoleerd uit zowel gist- als menselijk placentaweefsel.
- De zuiverheid van de lipidedruppelfractie werd bevestigd met behulp van Western Blot-analyse.
- Fluorescentiemicroscopie leverde visuele bevestiging van de lipidedruppels op.
- De methoden toonden reproduceerbaarheid en effectiviteit in lipidedruppelisolatie.
Conclusies
- De gepresenteerde technieken zijn effectief voor het isoleren van lipidedruppels uit verschillende weefsels.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugering is een betrouwbare methode voor dit doel.
- Verdere studies kunnen deze geïsoleerde lipidedruppels gebruiken voor metabolisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of lipid droplets enables mechanistic de-risking in target validation by providing purified organelles for proteomic and lipidomic analysis. This supports predictive confidence in early discovery by clarifying lipid metabolism pathways and associated protein interactions. The technique offers translational continuity from yeast models to human placental systems, facilitating cross-species target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet-associated proteins to clarify functional roles in lipid storage and metabolism pathways.
- Operational Value: Provides purified lipid droplet fractions suitable for downstream proteomic and lipidomic profiling.
- Strategic Value: Supports target de-risking by isolating organelles for hypothesis testing in metabolic disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lipid droplet preparations for consistent assay readouts in compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible isolation across yeast and human cell systems, enabling platform transfer.
- Strategic Value: Supports assay standardization for lipid-modulating compound evaluation in metabolic disease programs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by enabling lipid droplet analysis in disease-relevant human placental models.
- Operational Value: Provides continuity from yeast-based mechanistic studies to human tissue validation.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in lipid-targeted therapeutic development through cross-system validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by supplying purified lipid droplets for functional analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid droplet proteome composition and lipid-protein interactions.
- Screening: Enables assay-ready lipid droplet preparations for evaluating compound effects on lipid storage.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs via Western Blot and fluorescence microscopy for purity assessment and comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast model findings to human placental systems for metabolic pathway validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol applicable across diverse eukaryotic systems for metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in lipid droplet-associated protein identification.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through density gradient centrifugation across model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in lipid metabolism programs by providing reliable organelle isolation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated lipid droplet proteomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell fractionation, density gradient centrifugation, and organelle isolation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation equipment and compatible rotors (SW 28, SW 41 TI) for sucrose or Ficoll gradient separation.
- Necessitates standardization of homogenization and centrifugation parameters across yeast and human tissue preparations.
- Involves adaptation considerations for different cell types based on lipid droplet abundance and organelle contamination profiles.
- Relies on Western Blot and fluorescence microscopy for purity validation, requiring antibody availability and imaging infrastructure.
