Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om biomateriaal-vaccinepartikels in lymfeklieren te deposeren met behulp van een directe injectietechniek. Synthetiseer eerst de lipidestabiliseerde polymeerpartikels middels een dubbele emulsiemethode. Was vervolgens de partikels en meet de materiaaleigenschappen, zoals grootte, cargo, belading of stabiliteit.

Dien vervolgens een tracerkleurstof toe bij de staartaanzet van de muis om visualisatie mogelijk te maken nadat de kleurstof naar de lymfeklier is afgevoerd. De laatste stap is het identificeren van de met D gelabelde lymfeklier en het injecteren van een klein volume polymeerpartikels op deze locatie. Histologie, immunofluorescentie en confocale microscopie kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid en distributie van partikels in de inguinale lymfeklieren te bevestigen.

Het combineren van directe injectie in lymfeklieren met biomaterialen voor vaccinatie maakt een nauwkeurige controle mogelijk over de combinaties en doses van vaccinvormcomponenten in de micro-omgeving van de lymfeklier, en staat een gecontroleerde afgifte van vracht in deze weefsels toe. Alle vaccins moeten de lymfeklieren bereiken om effectief te zijn. Het definiëren van hoe biomaterialen en geïncorporeerde immuunsignalen de lokale signalering in de lymfeklieren beïnvloeden, is daarom essentieel om deze gebeurtenissen te koppelen aan de systemische immuunrespons.

Deze kennis zal ons helpen beter te begrijpen hoe biomateriaalvaccins die via traditionele routes worden toegediend, functioneren. Hoewel toediening van biomaterialen in de lymfeklieren dient als instrument om de effecten van biomaterialen op de organisatie van lymfeklieren te bestuderen, biedt dit platform ook een praktische mogelijkheid om nieuwe therapeutische vaccins en immunotherapieën te ontwikkelen die gericht zijn op kanker en auto-immuunziekten. Soniceer voor micropartikels de organische fase die het polymeerlipide en andere wateronoplosbare vracht bevat op ijs bij 12 watt.

Voeg voor het maken van de water-olie-emulsie 500 µL gedestilleerd H2O of H2O met één mg peptide-eiwit of andere wateroplosbare lading toe. Ga gedurende 30 seconden door met mengen. Schud het vial voorzichtig op en neer en van zij naar zij rond de tip van de agitator om volledige emulsificatie te garanderen.

Bereid nu de water-in-olie-emulsie voor door de water-olie-emulsie in 40 milliliter H2O te gieten en drie minuten lang te homogeniseren bij 16.000 RPM. Voeg vervolgens een magnetische roerstaaftje toe en roer de water-in-olie-emulsie gedurende de nacht om het overtollige oplosmiddel te verwijderen na de nachtelijke verwijdering van het oplosmiddel. Giet de emulsie door een nylonmazige cellenzeef van 40 micron in een conische centrifugebuis van 50 milliliter gedurende vijf minuten, decanteer het supernatant, resuspendeer de pellet van deeltjes in één milliliter water en breng de gesuspendeerde deeltjes over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Verzamel de deeltjes door een centrifugatie van vijf minuten. Meet de deeltjesgrootte via laserdiffractie of lichtverstrooiing. Controleer of het volume water dat aan de fractiecel is toegevoegd voldoende is voor uitlijning en nulmeting. Pipetteer 10 µL van de deeltjessuspensie in de fractiecel.

Sluit de deur van het compartiment van de deeltjesgrootte-analyser. Meet vervolgens de deeltjesgrootte voor PLGA. Gebruik een brekingsindex van 1,60.

Gebruik de softwareinterface om de partikeldiameter op basis van het aantal te berekenen één dag voorafgaand aan de injectie. Anestheseer de muis volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol. Evalueer de diepte van de anesthesie met een teenreflex.

Voer een knijpreflex-test uit en monitor de ademhaling om een ademhalingsfrequentie van 100 tot 120 ademhalingen per minuut te garanderen. Scheer het haar aan de basis van de staart en het achterkwartier. Verwijder het haar aan de ventrale zijde van het dier en lateraal rondom naar de dorsale zijde net boven het gewricht van het achterbeen.

Gebruik voor elke kleurstofinjectie een micropipet om 10 µL kleurstofoplossing over te brengen naar een microcentrifugebuisje en zuig de volledige 10 µL via een naald van maat 31 op in een insulinespuit van 1 ml. Injecteer nu 10 µL kleurstofoplossing subcutaan aan weerszijden van de staartbasis voor belading tussen de injecties door. Breng een milde ontharingscrème aan om het resterende haar te verwijderen.

Zorg ervoor dat het gebied tussen het achterbeen en de buik wordt ingesmeerd. Gebruik na drie minuten een vochtige, gehandschoende hand met warm H₂O en wrijf de ontharingscrème voorzichtig in de huid. Herhaal dit onmiddellijk om het overtollige ontharingsmiddel te verwijderen.

Bevocht vervolgens een zachte doek of papieren handdoek met warm water en veeg in één beweging het onderste gedeelte van de muis schoon. Plaats de muis onder een warmtelamp ter recovery en breng deze daarna voor minimaal 12 uur terug in de houder. Onderzoek de geanestheseerde muis om te bevestigen dat de tracer of kleurstof is afgevoerd naar elke inguinale lymfeknoop.

De lymfeknoop moet zichtbaar zijn als een donkere vlek nabij het achterbeen en het abdomen. Resuspendeer nu de partikels in gedestilleerd water tegen de gewenste injectieconcentratie voor elke injectie. Gebruik een micropipet om 10 µL van de partikeloplossing over te brengen naar een microcentrifugebuisje.

Zuig de volledige 10 µL op in een insulinenald 31 gauge die is bevestigd aan een spuit van 1 ml. Trek de huid rond de gekleurde lymfeklier strak terwijl de naald in een hoek van 90 graden ten opzichte van de huid wordt gehouden. Penetreer de huid tot een diepte van 1 mm.

Injecteer het volledige volume langzaam terwijl u controleert op zichtbare vergroting van de lymfeklieren. Laat de muis herstellen onder een warmtelamp en plaats deze vervolgens terug in de kooi of voer aanvullende tests uit. Bevestig eerst de synthese van de partikels en de grootteverdeling.

Het syntheseprotocol voor emulsie-oplosmiddelevaporatie kan kwalitatief worden beoordeeld door visuele inspectie van de uiteindelijke emulsies. Emulsies moeten een homogene suspensie zijn, vrij van zichtbare aggregaten. De deeltjesgrootteverdeling kan worden bevestigd via laser diffractie of dynamische lichtverstrooiing; deeltjesmonsters moeten een monomodale verdeling vertonen.

Verdere kwalitatieve beoordeling van de particlesynthese kan worden bereikt door het protocol aan te passen om één of meer fluorescerende ladingen te integreren, zoals een fluorescerend peptide of een lipofiele kleurstof. Kleurstof kan worden gebruikt om de lymfeknoop voor particle-injectie te lokaliseren en te targeten. Tijdens de training kunnen muizen worden geëuthanaseerd en kan er een necropsie worden uitgevoerd na de kleurstofinjectie om vertrouwd te raken met de locaties van de lymfeklieren. De distributie van particles binnen de t- en b-celzones van de geïnfecteerde lymfeknoop wordt bevestigd via confocale microscopie van gesneden en gekleurde lymfeklieren.

Verschillen in partikeleigenschappen, zoals grootte, kunnen worden waargenomen in lymfeklieren na injectie en beeldvorming via fluorescentiemicroscopie. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze binnen twee dagen worden voltooid. De synthese van partikels en de voorbereiding van de dieren vinden plaats op de eerste dag. Het wassen van partikels, de karakterisering en de injectie in de lymfeklier worden op de tweede dag uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een tracer of kleurstof kan worden gebruikt om de inguinale lymfeklieren van muizen te visualiseren en te injecteren. Deze techniek maakt een niet-chirurgische toediening van biomateriaal-vaccindragers direct in de lymfeklier mogelijk, met een mate van controle die voorheen niet mogelijk was. Directe toediening van biomaterialen aan de lymfeklier stelt wetenschappers en ingenieurs in de immunologie en vaccinontwikkeling in staat om de fundamentele interacties van biomateriaal-vaccins en immuunsignalen met de lymfeklier te onderzoeken, waardoor nieuw licht wordt geworpen op de mechanismen waarmee deze materialen immuniteit stimuleren en vormgeven.