Name: Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes voor vaccinontwikkeling en immunotherapie. Deze methode biedt nauwkeurige controle over vaccincomponenten in het lymfeklier-microklimaat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de PhRMA foundation en een Research and Scholar Award van de University of Maryland, College Park. We danken prof. Darrell Irvine voor de ondersteuning van het eerste werk dat is uitgevoerd bij de voltooiing van "In situ engineering van de micromilieu van de lymfeklier via intranodale injectie van adjuvans-releasing polymeerdeeltjes." 5

Alle dierstudies in dit protocol werden voltooid in overeenstemming met federale, staats- en lokale richtlijnen en met behulp van protocollen die werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Maryland.
1. Synthese van lipide gestabiliseerde micro- en nanodeeltjes
<ol><li>Combineer dopc-, DSPE-PEG- en DOTAP-lipiden in een ml glazen flacon(en) in een molaire verhouding van 60:20:20 om een master lipidenmix te bereiden.<ol>
<li>Om een enkel monster te synthetiseren: Breng respectievelijk 242,9 μl, 287,4 μl en 71,9 μl DOPC, DSPE-PEG en DOTAP over in de flacon met behulp van 2 ml glazen serologische pipetten.</li>
		<li>Om meerdere monsters te synthetiseren: Vermenigvuldig elk lipidenvolume hierboven met het aantal monsters en combineer in een enkele flacon en breng vervolgens gelijke aliquots van dit lipidenmengsel over in flacons die overeenkomen met elk te bereiden monster.</li>
		<li>Droog lipiden gedurende 10 minuten onder een zachte stroom stikstofgas of plaats ze 's nachts in een vacuümoven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los in een enkele, lege glazen flacon van 20 ml 80 mg PLGA op in 5 ml dichloormethaan voor elk deeltjesmonster om een polymeervoorraadoplossing van 16 mg/ml te genereren.</li>
	<li>Voeg 5 ml polymeeroplossing toe aan de flacon(s) met de gedroogde lipiden, dop en vortex gedurende 30 sec.</li>
	<li>Om microdeeltjes te synthetiseren:<ol>
<li>Begin met het soniceren van de organische fase die het polymeer, lipide en andere wateroplosbare lading op ijs met behulp van een sonicator bevat.</li>
		<li>Maak de water-in-olie (m/o) emulsie door een pipet te gebruiken om 500 μl gedestilleerde H2O toe te voegen, of H2O met 1 mg peptide, eiwit of andere in water oplosbare lading.</li>
		<li>Blijf 30 sec soniceren bij 12 W op ijs, schommel de flacon zachtjes op en neer en zij aan zij rond de sonicatortip om volledige emulgering te garanderen.</li>
		<li>Maak de water-in-olie-in-water (w/o/w) emulsie door de w/o emulsie in 40 ml H2O in een bekerglas van 150 ml te gieten.</li>
		<li>Homogeniseer gedurende 3 minuten bij 16.000 tpm met behulp van een digitale homogenisator.</li>
		<li>Voeg een magnetische roerstaaf toe, breng het bekerglas over op een roerplaat en laat de w/o/w emulsie een nacht roeren om het overtollige oplosmiddel te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nanodeeltjes synthetiseren:<ol>
<li>Begin met het soniceren van de organische fase die de polymeer-, lipide- en andere wateroplosbare lading op ijs met 14 W bevat.</li>
		<li>Maak de w/o-emulsie door een pipet te gebruiken om 500 μl gedestilleerde H2O toe te voegen, of H2O met 1 mg peptide, eiwit of andere in water oplosbare lading.</li>
		<li>Blijf soniceren gedurende 30 sec bij 14 W op ijs.</li>
		<li>Maak de w/o/w emulsie door de w/o emulsie in een bekerglas van 150 ml op 40 ml H2O te gieten en gedurende 5 min bij 16 W op ijs te soniceren. Schommel de flacon voorzichtig op en neer en van links naar rechts rond de sonicatortip om volledige emulgering te garanderen.</li>
		<li>Voeg een magneetroerstaaf toe, breng de kolf over op een roerplaat en laat de w/o/w emulsie een nacht roeren om het overtollige oplosmiddel te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was en verzamel de volgende ochtend deeltjes:<ol>
<li>Giet emulsie door 40 μm Nylon mesh celzeef in een conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Centrifugeer deeltjes gedurende 5 min bij 5.000 x g voor microdeeltjes of 5 min bij 24.000 x g voor nanodeeltjes.</li>
		<li>Decanteer supernatant en was deeltjes door resuspending in 1 ml H2O.</li>
		<li>Breng gesuspendeerde deeltjes over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 5 min bij 5.000 x g voor microdeeltjes of 5 min bij 24.500 x g voor nanodeeltjes.</li>
		<li>Was de deeltjes nog twee keer door supernatant te verwijderen, te resuspenden in 1 ml H2O en te centrifugeren zoals in stap 1.6.5. Schors na het wassen deeltjes in 1 ml H2O voor onmiddellijk gebruik of lyofiel voor uitgebreide opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Meting van de syntheseopbrengst
<ol><li>Preweigh een lege 20 ml glazen flacon. Voeg 100 μl deeltjessuspensie toe aan de voorgewege flacon na pipetten op en neer met een micropipet om te mengen.</li>
	<li>Lyophiliseer de deeltjes of droog onder een zachte stroom stikstof.</li>
	<li>Weeg de flacon met het gedroogde polymeer af. Bepaal de deeltjesopbrengst in de flacon door het oorspronkelijke gewicht van de flacon af te trekken van de massa van de flacon die de gedroogde deeltjes bevat.</li>
	<li>Bepaal de totale deeltjesopbrengst door de deeltjesmassa in de flacon te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. Om de procentuele opbrengst te bepalen, deelt u de deeltjesmassa door de maximale theoretische ingangsmassa en vermenigvuldigt u zich met 100%.</li>
</ol>3. Bepaling van deeltjesgrootte
<ol><li>Reinig de meegeleverde cuvette-achtige glasfractiecel door te vullen met gedeioneerd water en af te vegen met wattenstaafje. Breng 10 ml gedestilleerde H2O over naar de gereinigde factiecel, voeg magnetische microroerstaaf toe en laad de fractiecel in de celhouder van de deeltjesgrootteanalysator.</li>
	<li>Pas de magnetische roersnelheid in de deeltjesanalysator aan om een volledige menging in de fractiecel te bereiken en sluit de deur van het compartiment.</li>
	<li>Lijn de lasers uit op de breukcel met behulp van de instrumentsoftware-interface.</li>
	<li>Gebruik de instrumentsoftware-interface om een basislijnmeting op te nemen met de breukcel die alleen gedestilleerde H2O bevat.</li>
	<li>Pipetteer de originele deeltjessuspensie op en neer met een micropipet om te mengen.</li>
	<li>Pipet 10 μl deeltjessuspensie (meestal ongeveer 0,5 mg) in de fractiecel. Zorg ervoor dat het volume van het deeltjesmonster dat aan de cel wordt toegevoegd voldoende is om signaalsterkte te genereren in het juiste bereik zoals aangegeven op de software-interface van het instrument. De werkelijke massa van de deeltjes die nodig zijn, is afhankelijk van de procentuele opbrengst en de optische eigenschappen van het deeltjesmonster.</li>
	<li>Sluit de deur van het deeltjesgrootteanalysatorcompartiment en meet de deeltjesgrootte met behulp van een brekingsindex van 1,60 voor PLGA.</li>
	<li>Gebruik de software-interface om de deeltjesdiameter te berekenen met behulp van een getalbasis.</li>
</ol>4. Visualisatie van deeltjes
<ol><li>Pipetdeeltjessuspensie op en neer met micropipet om te mengen. Verdun deeltjessuspensie tot 1 mg/ml in gedeioneerd water.</li>
	<li>Bereid een microscoopschuif voor door 3 μl verdunde deeltjesophanging toe te voegen en een afdeklip onder een hoek van 45° te monteren om bellenvorming te voorkomen. Plaats de dia op het microscoopstadium en het beeld met behulp van de juiste filtersets voor elke fluorescerende lading.</li>
</ol>5. Voorbereiding van muizen voor i.LN. injectie
<ol><li>Bereid tracerkleurstofoplossing voor:<ol>
<li>Bereid een 0,1% (m/v) oplossing van tracerkleurstof door 10 mg kleurstofpoeder op te lossen met 10 ml gedestilleerde H2O.</li>
		<li>Steriliseer de kleurstofoplossing in een glazen flacon met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdoof de muis een dag voor de injectie met isofluraan volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol. Om de diepte van de anesthesie te evalueren, voert u een teenknijpreflextest uit en controleert u de ademhalingsfrequentie om een ademhalingsfrequentie van ongeveer 100-140 ademhalingen per minuut te garanderen.</li>
	<li>Scheer haar aan de basis van staart en achterhand met behulp van tondeuses terwijl de muis wordt verdoofd. Verwijder haar van de ventrale kant van het dier en lateraal rond de rugzijde net boven het gewricht van het achterbeen (heup).</li>
	<li>Injecteer tracer kleurstof.<ol>
<li>Gebruik voor elke kleurstofinjectie een micropipet om 10 μl kleurstofoplossing in een microcentrifugebuis over te brengen en aspireer de volledige 10 μl in een 31G-naald die aan een spuit van 1 ml is bevestigd.</li>
		<li>Injecteer 10 μl kleurstofoplossing subcutaan aan elke kant van de staartbasis waar het haar werd geknipt en herlaad tussen de injecties door.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder het resterende haar door een milde ontharingscrème aan te brengen via wattenstaafjes. Zorg ervoor dat u het gebied tussen de achterdij en de buik bedekt.</li>
	<li>Laat ontharingscrème 3 minuten op de huid incuberen. Na incubatie, natte gehandschoende hand met warme H2O en wrijf voorzichtig ontharingscrème in de huid.</li>
	<li>Verwijder onmiddellijk ontharingscrème door de gehandschoende hand nat te maken met warme H2O en de staartbasis en de achterhand te wrijven. Herhaal dit totdat het overtollige ontharingsgerei is verwijderd en zorg ervoor dat u de hand nat houdt om irritatie te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het resterende ontharingsvocht van de muis door een zachte doek of keukenpapier met warme H2O nat te maken en in één beweging een onderste deel van de muis af te vegen. Vermijd een wrijvende beweging om slijtage of huidbeschadiging aan de muis te voorkomen.</li>
	<li>Laat de muis zich herstellen onder een warmtelamp en weer vasthouden.</li>
</ol>6. i.LN. Injectie van deeltjes
<ol><li>Verdoof de muis de volgende dag met isofluraan volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol.</li>
	<li>Onderzoek de muis om de drainage van tracerkleurstof in elke liesklier te bevestigen. De lymfeklier moet zichtbaar zijn als een donkere vlek in de buurt van de achterdij en buik.</li>
	<li>Bereid deeltjesinjectieoplossing voor:<ol>
<li>Resuspend deeltjes in gedestilleerde H2O bij gewenste injectieconcentratie. Gebruik voor elke injectie een micropipet om 10 μl deeltjesoplossing in een microcentrifugebuis over te brengen.</li>
		<li>Aspireer de volledige 10 μl in een 31G insulinenaald bevestigd aan een spuit van 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteer deeltjesdosis:<ol>
<li>Nadat u LN hebt gevisualiseerd, trekt u de huid rond LN aan met duim, wijsvinger en middelvinger om de huid te bespotten en een gecontroleerde plaatsing van het injectievolume mogelijk te maken.</li>
		<li>Benader de LN met de naald onder een hoek van 90° ten opzichte van de huid en penetreer de huid over de geverfde LN tot een diepte van 1 mm.</li>
		<li>Injecteer langzaam het hele volume. Observeer tijdens de injectie het LN-volume door de huid om de injectie te bevestigen door zichtbare LN-vergroting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de muis zich herstellen onder een warmtelamp en keer terug naar het vasthouden of uitvoeren van aanvullende tests.</li>
</ol>Voor relevante analysetechnieken (bijv. histologie, flowcytometrie ) zie JoVE-artikelen 265, 1743 en 3054 en Current Protocols in Immunology, hoofdstukken 5 en 2115-22.

<ol><li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Approaches+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Adamina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranodal+immunization+with+a+vaccinia+virus+encoding+multiple+antigenic+epitopes+and+costimulatory+molecules+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma.</a> Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).</li>
<li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma%3A+Results+of+a+Phase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Trial.+Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li>
<li>Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+engineering+of+the+lymph+node+microenvironment+via+intranodal+injection+of+adjuvant-releasing+polymer+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Irvine, D. J., Jewell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+132%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ch. 132.</a> Comprehensive Biomaterials. Ducheyne, P., et al. , (2011).</li>
<li>Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Nano-+and+Microparticles+to+Tune+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity.</a> Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).</li>
<li>Reddy, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+lymphatic+transport+and+complement+activation+in+nanoparticle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines.</a> Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).</li>
<li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-supported+lipid+shells%2C+onions%2C+and+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li>
<li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses%3A+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li>
<li>He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometry+Analyses+of+Cellular+Immune+Response+in+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques.</a> J. Vis. Exp. , 1743(2010).</li>
<li>Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+2-Photon+Imaging+of+Peripheral+Lymph+Nodes+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+e265%22%5BJournal%5D)">Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice.</a> J. Vis. Exp. e265. , 265(2007).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Imaging+of+T+Cells+in+Murine+Lymph+Node+Slices+with+Widefield+and+Confocal+Microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes.</a> J. Vis. Exp. , 3054(2011).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDonaldson%2C+JG+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Immunofluorescence+Staining%22">in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hofman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHofman%2C+F+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Immunohistochemistry%22">in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmes%2C+K+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Preparation+of+Cells+and+Reagents+for+Flow+Cytometry%22">in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Overview+of+Flow+Cytometry%22">in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Analysis+of+Flow+Cytometry+Data%22">in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+an+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).</li>
</ol>

Productiekosten en toegangsprijzen voor deze artikelen werden gedeeltelijk gesponsord door HORIBA, Ltd.

De in dit protocol beschreven techniek maakt gecontroleerde toediening van vaccins aan LAN's en aan in LN-ingezeten antigeen presenterende cellen mogelijk. Biomateriaal ingekapselde lading kan worden gelokaliseerd binnen de LN, waardoor manipulatie van de doses van een of meer soorten lading geleverd aan de LN micro-omgeving. Het is aangetoond dat de lokalisatie en gecontroleerde afgifte van polymeerdeeltjes een krachtige cellulaire en humorale immuunrespons genereert bij aanzienlijk lagere doses dan conventionele benaderingen. Verder kan door de manipulatie van de grootte van de biomaterialendrager de primaire modus van cellulaire verwerking worden gemoduleerd tussen directe opname van nanodeeltjes of extracellulaire ladingafgifte uit grotere microdeeltjes5. Deze resultaten bepalen de haalbaarheid van i.LN. biomateriaallevering als platform voor therapeutische vaccinafgifte.
De synthese van PLGA-deeltjes door emulsie/oplosmiddelverdamping is op grote schaal toegepast in toepassingen voor de levering van geneesmiddelen23,24. Potentiële uitdagingen in verband met deze techniek hebben dus vooral betrekking op succesvolle identificatie en depositie van vaccins op de LN-doellocatie. Hoewel het gebruik van tracerkleurstof de visualisatie van de beoogde inguinale LAN's vergemakkelijkt, zijn de doelgrootte en diepte onder de huid klein. Daarom raden de auteurs aan om tijd en muizen toe te wijzen voor het oefenen van de voorbereiding en injecties van muizen. Tijdens de voorbereiding van het dier(d.w.z. scheren en aanbrengen van ontharing) moet ervoor worden gezorgd dat de muizen aan de ventrale kant van het dier niet worden gesneden, waarbij de hoek van het been met de buik de huid vatbaarder maakt voor letsel door tondeuses. Bovendien moet al het ontharen worden verwijderd met warm water om te voorkomen dat dieren de crème binnenkrijgen tijdens normaal verzorgingsgedrag. Om LN-injecties te oefenen, kan een hogere tracerkleurstofconcentratie worden toegediend en kunnen oefendieren worden geëuthanaseerd en vervolgens meerdere keren worden geïnjecteerd. Na injectie kunnen muizen worden necropsie ondergaan en de grootte van LAN's van geïnjecteerde dieren kan worden vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle-LN. Een beperking van deze techniek is de fysieke limiet van het injectievolume dat in de LN-structuur kan worden geladen. Ons protocol suggereert een injectievolume van 10 μl bij muizen, hoewel andere studies grotere injectievolumes hebben gemeld die minstens zo hoog zijn als 20 μl.13 De directe toediening van vaccins via i.LN. injectie maakt echter dramatische dosissparen mogelijk, zodat de functie van deze vaccins over het algemeen niet mag worden beperkt door volumebeperkingen.
Zoals opgemerkt, is het veranderen van de fysische eigenschap van de deeltjes(d.w.z. grootte) een effectief mechanisme om de route of resultaten te veranderen die worden geïnduceerd door biomaterialen en ingekapselde ladingen in LN-weefsel. Het emulsie-/oplosmiddelverdampingsprotocol kan eenvoudig worden gewijzigd om fysische of chemische eigenschappen zoals oppervlaktelading of functionaliteit en de snelheid van biologische afbraak/ladingafgifte te wijzigen23,24. De afgiftekinetiek kan bijvoorbeeld worden afgestemd door middel van alternatieve polymeersamenstellingen en de oppervlaktefunctie kan worden gewijzigd met behulp van gemodificeerde lipidesamenstellingen of poly (vinylalcohol). De lading geladen in deeltjes kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om verschillende antigenen of hulpstoffen voor doelpathogenen te bevatten. Het voordeel van deze aanpak wordt bereikt door de combinatie van i.LN. levering met lokale, gecontroleerde vrijgave van lading uit biomaterialen. Deze synergie creëert een platform dat kan worden benut om efficiënt adaptieve immuunresponsen te genereren met behulp van minieme doses en met verminderde niet-specifieke / systemische bijwerkingen.

De lymfeklieren (LN's) zijn de commandocentra van het immuunsysteem. Op deze immunologische site presenteert antigeen cellen prime naïeve lymfocyten tegen specifieke vreemde antigenen om cellulaire en humorale immuunresponsen te activeren. LN's zijn daarmee een aantrekkelijk doelwit geworden voor de levering van vaccins en immunotherapieën. Helaas resulteren de meeste vaccinstrategieën in inefficiënte, voorbijgaande toediening van antigeen en hulpstoffen aan het lymfoïde weefsel1. Benaderingen die de targeting en het behoud van vaccincomponenten in LAN's verbeteren, kunnen daarom een aanzienlijke impact hebben op de potentie en efficiëntie van nieuwe vaccins.
Een strategie om de uitdaging van LN-targeting te omzeilen die grote belangstelling heeft getoond voor nieuwe klinische proeven is directe , intra-LN (i.LN.) injectie2-4. Deze onderzoeken maakten gebruik van ultrasone begeleiding om vaccins aan LN's te leveren als een eenvoudige poliklinische procedure. In vergelijking met traditionele perifere injectieroutes resulteerde deze aanpak in aanzienlijke dosissparende en verbeterde werkzaamheid in therapeutische contexten, waaronder allergieën en kanker2-4. Deze studies maakten gebruik van i.LN. injectie van oplosbare vaccins(d.w.z. biomateriaalvrij) die snel werden gewist door lymfedrainage. Daarom werden meerdere injecties- of cycli van meerdere injecties - toegediend om deze indrukwekkende therapeutische effecten te bereiken. Verbeterde retentie in de LN kan de interactie tussen antigeen en/of adjuvans en immuuncellen verbeteren, waardoor de potentie van immuuncelpriming verder wordt verbeterd. Dit potentieel wordt ondersteund door recente studies die aantonen dat kinetiek van antigeen en adjuvante toediening een cruciale rol spelen bij het bepalen van de specifieke immuunrespons gegenereerd5-7. Verder kan het lokaliseren en minimaliseren van medicijn- en vaccindoses systemische effecten, zoals chronische ontstekingen, verminderen of elimineren.
Biomaterialen zijn uitgebreid bestudeerd om de potentie en efficiëntie van vaccins te verbeteren1,8,9. Inkapseling of adsorptie op biomateriaaldragers kan lading fysiek beschermen tegen afbraak en oplosbaarheidsbeperkingen overwinnen. Een ander opmerkelijk kenmerk van biomaterialendragers, zoals polymere micro- of nanodeeltjes, is de mogelijkheid om verschillende klassen lading te coloaden en vervolgens deze ladingen over gecontroleerde intervallen vrij te geven. Een significante beperking die biomateriaalvaccins en immunotherapieën in vivo blijft belemmeren, is echter inefficiënte targeting van immuuncellen en beperkte handel naar lymfeklieren. Perifere injectie van biomateriaalvaccins via conventionele routes(bijv. intradermaal, intramusculair) vertoont bijvoorbeeld meestal een slechte LN-targeting, waarbij tot 99% van het geïnjecteerde materiaal op de injectieplaats overblijft4,10. Meer recentelijk is de omvang van de dragers van biomaterialenvaccins afgestemd op het verbeteren van de preferentiële handel of drainage van deze vaccins naar LN's via interstitiële stroom8,10. Deze vooruitgang heeft geleid tot verbeterde cellulaire en humoristische immuunresponsen, wat het belang onderstreept van het richten en ontwerpen van de LN-omgeving voor nieuwe vaccins.
Dit artikel presenteert een vaccinatieprotocol dat lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes en i.LN. levering combineert om vaccindepots met gereguleerde afgifte te genereren5,11. Voortbouwend op recente studies met chirurgische technieken voor i.LN. bij muizen6,7,12,13ontwikkelden we een snelle, niet-chirurgische strategie voor het injecteren van biomateriaalvaccins bij kleine dieren5. Combinatie van i.LN. toediening met biomateriaal vaccindragers krachtig verbeterde CD8 T celrespons binnen 7 dagen na een enkele injectie van gecontroleerde afgifte vaccin depots5. Er werd ook een sterke humoristische respons(d.w.z. antilichaamtiters) gegenereerd; beide verbeteringen werden gekoppeld aan een verhoogde retentie van vaccincomponenten in lymfeklieren die werd gemedieerd door gecontroleerde afgifte van de biomateriaaldragers. Interessant is dat de grootte van vaccindeeltjes het lot van deze materialen ooit in de LAN's veranderde: nanoschaaldeeltjes vertoonden verhoogde directe opname door cellen, terwijl grotere microdeeltjes in de extracellulaire LN-omgeving bleven en lading vrijkwamen(bijv. adjuvans) die werd opgenomen door LN-ingezeten antigeen dat cellenpresenteerde 5. Deze gegevens suggereren twee trajecten die kunnen worden benut voor nieuwe vaccins door de grootte van de geïnjecteerde biomaterialen i.LN te controleren.
In dit artikel worden biologisch afbreekbare lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes (micro- en nanoschaal) gesynthetiseerd met behulp van een gemodificeerde dubbele emulsiestrategie5,11. Deeltjeseigenschappen worden gekenmerkt door laserdiffractie en microscopie. Deze deeltjes worden vervolgens rechtstreeks in de inguinale LN's geïnjecteerd die niet-assurgisch zijn geïdentificeerd met behulp van een gemeenschappelijke, niet-toxische tracerkleurstof14. Post-injectie analyse van LN's door histologie of flow cytometrie kan worden gebruikt om de verdeling van deeltjes binnen de LN-omgeving te verifiëren, evenals om de cellulaire opname en retentie van deeltjes in de loop van de tijd te controleren. Voor protocollen met histologische verwerking en flowcytometrie worden lezers verwezen naar recente JoVE-artikelen en tijdschriftrapporten15-22. Typische resultaten tonen lokale LN-targeting van deze depots aan die kunnen worden misbruikt om krachtige, efficiënte immuunresponsen te bereiken of om immuniteit op maat te maken voor doelpathogenen.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>10 mg/ml stock in chloroform</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td>10 mg/ml stock in chloroform</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890</td><td>10 mg/ml stock in chloroform</td></tr><tr><td>Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td>Lactide:Glycolide (50:50). MW 30.000-60.000</td></tr><tr><td>Dichloromethane (DCM)</td><td>VWR</td><td>BDH1113</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evans blue tracer dye</td><td>VWR</td><td>AAA16774-09</td><td></td></tr><tr><td>U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td><td>VWR</td><td>BD328418</td><td></td></tr><tr><td>Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td><td>VWR</td><td>BD305167</td><td></td></tr><tr><td>Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &micro;m</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td><td>Invitrogen</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &micro;m</td><td>Polysciences</td><td>17149</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &micro;m</td><td>Polysciences</td><td>17156</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin, Purified</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003056</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>1/8 in diameter microtip probe</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td><td>IKA</td><td>YO-04739-22</td><td>10 G dispersing element</td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td><td>Horiba</td><td>LA-950</td><td>Including provided cuvette-style glass fraction cell</td></tr><tr><td>Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Het genereren van adaptieve immuunrespons is afhankelijk van efficiënte drainage of handel in antigeen naar lymfeklieren voor de verwerking en presentatie van deze vreemde moleculen naar T- en B-lymfocyten. Lymfeklieren zijn dus kritische doelwitten geworden voor nieuwe vaccins en immunotherapieën. Een recente strategie voor het richten van deze weefsels is directe lymfeklierinjectie van oplosbare vaccincomponenten, en klinische proeven met deze techniek zijn veelbelovend. Verschillende biomaterialenstrategieën zijn ook onderzocht om de lymfekliertargeting te verbeteren, bijvoorbeeld het afstemmen van deeltjesgrootte voor optimale drainage van biomateriaalvaccindeeltjes. In dit artikel presenteren we een nieuwe methode die directe lymfeklierinjectie combineert met biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes die kunnen worden beladen met antigeen, adjuvans of andere vaccincomponenten. In deze methode worden polymere microdeeltjes of nanodeeltjes gesynthetiseerd door een gemodificeerd dubbel emulsieprotocol met lipidenstabilisatoren. Deeltjeseigenschappen(bijv. grootte, ladinglading) worden bevestigd door respectievelijk laserdiffractie en fluorescerende microscopie. Muislymfeklieren worden vervolgens geïdentificeerd door perifere injectie van een niet-toxische tracerkleurstof die visualisatie van de doelinjectieplaats en daaropvolgende afzetting van polymeerdeeltjes in lymfeklieren mogelijk maakt. Deze techniek maakt directe controle mogelijk over de doses en combinaties van biomaterialen en vaccincomponenten die aan lymfeklieren worden geleverd en kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe vaccins op basis van biomaterialen.

De verwachte resultaten voor de protocollen in dit manuscript kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën: deeltjessynthese, dierlijke voorbereiding en deeltjesinjectie.
Figuur 1 toont de synthese en karakterisering van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes, gestabiliseerd door amfifiele lipiden. De resultaten van het emulsie/oplosmiddelverdampingssyntheseprotocol (figuur 1A) kunnen kwalitatief worden beoordeeld door visuele inspectie van de uiteindelijke emulsies die worden gegenereerd; deeltjesbatches moeten homogene, stabiele emulsies zijn met een ondoorzichtig uiterlijk. Complicaties omvatten emulsies die crème of flocculate, vaak als gevolg van onjuiste opslag van lipidenstabilisatoren. Om deze instabiliteit te voorkomen, moeten lipiden bij -80 °C worden bewaard in een gedehydrateerde toestand of in een verzegelde flacon gezuiverd met stikstof. Kwantitatieve beoordeling van deeltjessynthese kan worden uitgevoerd met behulp van laserdiffractie of dynamische lichtverstrooiing om de grootteverdeling te analyseren (Figuur 1B). De verwachte resultaten omvatten strak verdeelde, monomodale deeltjesgrootten, wat wijst op een uniforme populatie deeltjes. De in dit manuscript beschreven syntheseparameters genereren een gemiddeld aantal distributies gecentreerd op ongeveer 100 nm of 3 μm voor respectievelijk nanodeeltjes en microdeeltjes. Verdere kwalitatieve beoordeling van deeltjessynthese kan worden bereikt door wijziging van het bovenstaande protocol om meerdere klassen fluorescerende lading op te nemen. In figuur 1Cbevestigen microscopiebeelden van microdeeltjes geladen met een fluorescerend peptide (FITC, groen), een lipofiele kleurstof (DiD, rood) en een overlayafbeelding (geel) de creatie van deeltjes binnen het gewenste groottebereik en inkapseling van peptide in het volume van het deeltje.
De eerste twee panelen van figuur 2 vatten de verwachte resultaten van de dierlijke voorbereiding voor de i.LN.-injectiestrategie samen die in dit document worden beschreven. De methode omvat het markeren van inguinale LN 's door perifere injectie van een niet-toxische tracer om de locatie te bepalen voor daaropvolgende i.LN.-injectie van deeltjes (Figuur 2A)5. Zoals opgemerkt, zal drainage van de tracerkleurstof na subcutane injectie aan de staartbasis visualisatie van de inguinale LN's mogelijk maken (Figuur 2B)5. Inname van goedgekeurde ontharingscrèmes kan gevaren opleveren voor de muizen. Er moet dus voor worden gezorgd dat alle aangebrachte crème grondig wordt verwijderd, met bijzondere aandacht voor poten en de ventrale kant van de muizen. Het ontharen moet worden verwijderd met een natte, zachte doek of natte papieren handdoek in een enkele, vloeiende beweging. Vermijd wrijven om crème te verwijderen, omdat dit kan leiden tot schaafwonden op de blootgestelde huid van de muizen.
Bevestiging van lokale levering aan het inguinale LN kan worden geëvalueerd door observatie of histologie. Het LN-volume kan tijdens de injectie visueel worden gecontroleerd als indicator voor een succesvolle injectie. Verwachte resultaten omvatten een efficiënte ladingverdeling door de LN-structuur, zonder significante lekkage naar aangrenzende weefsels of cellen. Verder, aangezien geïnjecteerde vloeistof de tracer in de LN verplaatst/verdunt, moet de kleurstofconcentratie/kleurstof na injectie minder intens worden. Observatie van het weefsel moet een intacte, maar vergrote LN onthullen als gevolg van vloeistofinjectie. Mogelijke uitdagingen zijn het te snel injecteren of het missen van het LN, die beide elutie van het volume in het omliggende onderhuidse weefsel kunnen veroorzaken. Deze ongewenste uitkomsten kunnen worden bevestigd door obductie of histologie, waarbij de deeltjessuspensie wordt waargenomen die zich verspreidt naar cellen en weefsel op afstand van knooppunten die zijn gericht op injectie. Een verwacht resultaat zou daarentegen de identificatie van een vergrote inguinale LN zijn als gevolg van insluiting van deeltjes in de LN-structuur. Histologische verwerking van accijns-LAN's kan de levering van lading aan het lymfoïde weefsel definitief bevestigen, zoals blijkt uit de figuren 2C en 2D. Merk op dat de deeltjes in figuur 2 fluorescerende lading bevatten om visualisatie van lading mogelijk te maken tijdens injectie, evenals tijdens histologische verwerking en fluorescerende microscopie.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Figuur 1. Synthese en karakterisering van lipide gestabiliseerde deeltjes. A) Schematisch schema dat de synthese beschrijft van lipide-gestabiliseerde deeltjes bereid door emulsie/oplosmiddelverdamping. B) Grootteverdelingen van microdeeltjes (vaste lijn, diameter = 2,8 μm) en nanodeeltjes (onderbroken lijn, diameter = 113 nm). C) Fluorescerende microscopiebeelden van deeltjes geladen met fluorescerend gelabeld peptide en een fluorescerende deeltjeskleurstof. Labels: peptide (groen) en deeltje (rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Figuur 2. i.LN. Injectie en distributie van biologisch afbreekbare deeltjes binnen LN. A) Methodologie voor i.LN. injectie. B) Visualisatie van LAN's in een muis door de huid (bovenste afbeelding) en na obductie (onderste afbeelding)5. C) Histologische kleuring van een LN ter bevestiging van depositie en distributie van fluorescerend gelabelde polymeermicrodeeltjes (deeltjes, groen; T-cellen, rood; B-cellen, blauw). D) Fluorescerend gelabelde nanodeeltjes (50 nm, linkerafbeelding) en microdeeltjes (6 μm, rechterafbeelding) in LN's 24 uur na injectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>

Lymfeklieren zijn de immunologische weefsels die de immuunrespons orkestreren en een cruciaal doelwit zijn voor vaccins. Biomaterialen zijn gebruikt om lymfeklieren beter te richten en de levering van antigenen of hulpstoffen te controleren. Dit artikel beschrijft een techniek die deze ideeën combineert om biocompatibele polymeerdeeltjes in lymfeklieren te injecteren.

Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

Het algemene doel van deze procedure is om biomateriaal-vaccinepartikels in lymfeklieren te deposeren met behulp van een directe injectietechniek. Synthetiseer eerst de lipidestabiliseerde polymeerpartikels middels een dubbele emulsiemethode. Was vervolgens de partikels en meet de materiaaleigenschappen, zoals grootte, cargo, belading of stabiliteit.Dien vervolgens een tracerkleurstof toe bij de staartaanzet van de muis om visualisatie mogelijk te maken nadat de kleurstof naar de lymfeklier is afgevoerd. De laatste stap is het identificeren van de met D gelabelde lymfeklier en het injecteren van een klein volume polymeerpartikels op deze locatie. Histologie, immunofluorescentie en confocale microscopie kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid en distributie van partikels in de inguinale lymfeklieren te bevestigen.Het combineren van directe injectie in lymfeklieren met biomaterialen voor vaccinatie maakt een nauwkeurige controle mogelijk over de combinaties en doses van vaccinvormcomponenten in de micro-omgeving van de lymfeklier, en staat een gecontroleerde afgifte van vracht in deze weefsels toe. Alle vaccins moeten de lymfeklieren bereiken om effectief te zijn. Het definiëren van hoe biomaterialen en geïncorporeerde immuunsignalen de lokale signalering in de lymfeklieren beïnvloeden, is daarom essentieel om deze gebeurtenissen te koppelen aan de systemische immuunrespons.Deze kennis zal ons helpen beter te begrijpen hoe biomateriaalvaccins die via traditionele routes worden toegediend, functioneren. Hoewel toediening van biomaterialen in de lymfeklieren dient als instrument om de effecten van biomaterialen op de organisatie van lymfeklieren te bestuderen, biedt dit platform ook een praktische mogelijkheid om nieuwe therapeutische vaccins en immunotherapieën te ontwikkelen die gericht zijn op kanker en auto-immuunziekten. Soniceer voor micropartikels de organische fase die het polymeerlipide en andere wateronoplosbare vracht bevat op ijs bij 12 watt.Voeg voor het maken van de water-olie-emulsie 500 µL gedestilleerd H2O of H2O met één mg peptide-eiwit of andere wateroplosbare lading toe. Ga gedurende 30 seconden door met mengen. Schud het vial voorzichtig op en neer en van zij naar zij rond de tip van de agitator om volledige emulsificatie te garanderen.Bereid nu de water-in-olie-emulsie voor door de water-olie-emulsie in 40 milliliter H2O te gieten en drie minuten lang te homogeniseren bij 16.000 RPM. Voeg vervolgens een magnetische roerstaaftje toe en roer de water-in-olie-emulsie gedurende de nacht om het overtollige oplosmiddel te verwijderen na de nachtelijke verwijdering van het oplosmiddel. Giet de emulsie door een nylonmazige cellenzeef van 40 micron in een conische centrifugebuis van 50 milliliter gedurende vijf minuten, decanteer het supernatant, resuspendeer de pellet van deeltjes in één milliliter water en breng de gesuspendeerde deeltjes over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.Verzamel de deeltjes door een centrifugatie van vijf minuten. Meet de deeltjesgrootte via laserdiffractie of lichtverstrooiing. Controleer of het volume water dat aan de fractiecel is toegevoegd voldoende is voor uitlijning en nulmeting. Pipetteer 10 µL van de deeltjessuspensie in de fractiecel.Sluit de deur van het compartiment van de deeltjesgrootte-analyser. Meet vervolgens de deeltjesgrootte voor PLGA. Gebruik een brekingsindex van 1,60.Gebruik de softwareinterface om de partikeldiameter op basis van het aantal te berekenen één dag voorafgaand aan de injectie. Anestheseer de muis volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol. Evalueer de diepte van de anesthesie met een teenreflex.Voer een knijpreflex-test uit en monitor de ademhaling om een ademhalingsfrequentie van 100 tot 120 ademhalingen per minuut te garanderen. Scheer het haar aan de basis van de staart en het achterkwartier. Verwijder het haar aan de ventrale zijde van het dier en lateraal rondom naar de dorsale zijde net boven het gewricht van het achterbeen.Gebruik voor elke kleurstofinjectie een micropipet om 10 µL kleurstofoplossing over te brengen naar een microcentrifugebuisje en zuig de volledige 10 µL via een naald van maat 31 op in een insulinespuit van 1 ml. Injecteer nu 10 µL kleurstofoplossing subcutaan aan weerszijden van de staartbasis voor belading tussen de injecties door. Breng een milde ontharingscrème aan om het resterende haar te verwijderen.Zorg ervoor dat het gebied tussen het achterbeen en de buik wordt ingesmeerd. Gebruik na drie minuten een vochtige, gehandschoende hand met warm H₂O en wrijf de ontharingscrème voorzichtig in de huid. Herhaal dit onmiddellijk om het overtollige ontharingsmiddel te verwijderen.Bevocht vervolgens een zachte doek of papieren handdoek met warm water en veeg in één beweging het onderste gedeelte van de muis schoon. Plaats de muis onder een warmtelamp ter recovery en breng deze daarna voor minimaal 12 uur terug in de houder. Onderzoek de geanestheseerde muis om te bevestigen dat de tracer of kleurstof is afgevoerd naar elke inguinale lymfeknoop.De lymfeknoop moet zichtbaar zijn als een donkere vlek nabij het achterbeen en het abdomen. Resuspendeer nu de partikels in gedestilleerd water tegen de gewenste injectieconcentratie voor elke injectie. Gebruik een micropipet om 10 µL van de partikeloplossing over te brengen naar een microcentrifugebuisje.Zuig de volledige 10 µL op in een insulinenald 31 gauge die is bevestigd aan een spuit van 1 ml. Trek de huid rond de gekleurde lymfeklier strak terwijl de naald in een hoek van 90 graden ten opzichte van de huid wordt gehouden. Penetreer de huid tot een diepte van 1 mm.Injecteer het volledige volume langzaam terwijl u controleert op zichtbare vergroting van de lymfeklieren. Laat de muis herstellen onder een warmtelamp en plaats deze vervolgens terug in de kooi of voer aanvullende tests uit. Bevestig eerst de synthese van de partikels en de grootteverdeling.Het syntheseprotocol voor emulsie-oplosmiddelevaporatie kan kwalitatief worden beoordeeld door visuele inspectie van de uiteindelijke emulsies. Emulsies moeten een homogene suspensie zijn, vrij van zichtbare aggregaten. De deeltjesgrootteverdeling kan worden bevestigd via laser diffractie of dynamische lichtverstrooiing; deeltjesmonsters moeten een monomodale verdeling vertonen.Verdere kwalitatieve beoordeling van de particlesynthese kan worden bereikt door het protocol aan te passen om één of meer fluorescerende ladingen te integreren, zoals een fluorescerend peptide of een lipofiele kleurstof. Kleurstof kan worden gebruikt om de lymfeknoop voor particle-injectie te lokaliseren en te targeten. Tijdens de training kunnen muizen worden geëuthanaseerd en kan er een necropsie worden uitgevoerd na de kleurstofinjectie om vertrouwd te raken met de locaties van de lymfeklieren. De distributie van particles binnen de t- en b-celzones van de geïnfecteerde lymfeknoop wordt bevestigd via confocale microscopie van gesneden en gekleurde lymfeklieren.Verschillen in partikeleigenschappen, zoals grootte, kunnen worden waargenomen in lymfeklieren na injectie en beeldvorming via fluorescentiemicroscopie. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze binnen twee dagen worden voltooid. De synthese van partikels en de voorbereiding van de dieren vinden plaats op de eerste dag. Het wassen van partikels, de karakterisering en de injectie in de lymfeklier worden op de tweede dag uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een tracer of kleurstof kan worden gebruikt om de inguinale lymfeklieren van muizen te visualiseren en te injecteren. Deze techniek maakt een niet-chirurgische toediening van biomateriaal-vaccindragers direct in de lymfeklier mogelijk, met een mate van controle die voorheen niet mogelijk was. Directe toediening van biomaterialen aan de lymfeklier stelt wetenschappers en ingenieurs in de immunologie en vaccinontwikkeling in staat om de fundamentele interacties van biomateriaal-vaccins en immuunsignalen met de lymfeklier te onderzoeken, waardoor nieuw licht wordt geworpen op de mechanismen waarmee deze materialen immuniteit stimuleren en vormgeven.

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

We beschrijven de productie en karakterisering van nanodeeltjes en microdeeltjes samengesteld uit poly(melkzuur-co-glycolzuur) met behulp van vitamine E-TPGS als emulgator. Door formuleringsparameters zoals de concentratie van emulgator te variëren, is het mogelijk om nanodeeltjes te produceren met gemiddelde diameters variërend van 220 nm tot 1,98 µm.

PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS

Profylactische en therapeutische vaccinatie vaak niet sterke immuunrespons stimuleren door week afvoer van het vaccin knooppunten en daardoor slechte medewerking van immuuncellen lymfe. Door directe injectie van vaccin lymfeklieren, zogenaamde intralymfatische injectie vaccindoeltreffendheid sterk worden verbeterd en vaccindoses worden verminderd.

Intralymfatische Immunotherapie en Vaccinatie in Muizen

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Lokale drug levering aan de submandibulaire klieren is van belang in begrip speekselklier biologie en voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. We presenteren een bijgewerkte en gedetailleerde retroductal injectie protocol, ter verbetering van de nauwkeurigheid van de levering en experimentele reproduceerbaarheid. De hier vermelde toepassing is de levering van polymere nanodeeltjes.

Retroductal Nanoparticle injectie aan de lymfkliertest submandibulaire klier

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Leer intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes voor vaccinontwikkeling en immunotherapie. Deze methode biedt nauwkeurige controle over vaccincomponenten in het lymfeklier-microklimaat.

Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Meer video's verkennen