Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om biomateriaalvaccindeeltjes in lymfeklieren af te zetten met behulp van een directe injectietechniek. Eerst synthetiseer je de lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes met behulp van een dubbele emulsiemethode. Was vervolgens de deeltjes en meet de materiaaleigenschappen zoals grootte, lading, belasting of stabiliteit.

Vervolgens geeft u een traceerkleurstof toe aan de staartbasis van de muis om visualisatie mogelijk te maken na drainage van de kleurstof naar de lymfeklieren. De laatste stap is het identificeren van de D-gelabelde lymfeklier en het injecteren van een klein volume polymeerdeeltjes op deze locatie. Histologie, immunofluorescentie en confocale microscopie kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid en verdeling van deeltjes in de inguinale lymfeklieren te bevestigen.

Het combineren van de directe injectie van lymfeklieren met biomaterialen voor vaccinatie maakt een nauwkeurige controle mogelijk over de combinaties en doses van vaccincomponenten in de lymfeklierontwikkeling, en maakt een gecontroleerde afgifte van lading in deze weefsels mogelijk. Alle vaccins moeten lymfeklieren bereiken om effectief te zijn. Daarom is het belangrijk om te definiëren hoe biomaterialen en ingebouwde immuunsignalen de lokale lymfeklierende signalering beïnvloeden om deze gebeurtenissen te koppelen aan systemische immuunrespons.

Deze kennis zal ons helpen beter te begrijpen hoe biomateriaalvaccins die langs traditionele routes worden toegediend, functioneren. Hoewel intra-lymfekliere aflevering van biomaterialen dient als een hulpmiddel om de effecten van biomaterialen op de organisatie van lymfeklieren te bestuderen, biedt dit platform ook een toegepaste mogelijkheid om nieuwe therapeutische vaccins en immunotherapieën te ontwikkelen die gericht zijn op kanker en auto-immuunstoornissen. Voor microdeeltjes soniqueer, de organische fase die het polymeerlipide en andere in water onoplosbare lading bevat, op ijs bij 12 watt.

Om de water- en olie-emulsie te maken, voeg je 500 microliter gedistilleerd H2O of H2O toe met één milligram peptide-eiwit of andere in water oplosbare lading. Blijf 30 seconden doorgaan met roeren. Schud voorzichtig de fles op en neer, zijdelings rond de ator-tip om volledige emulgering te garanderen.

Bereid nu de water- en olie-in-wateremulsie voor door de water-olie-emulsie in 40 milliliter H2O te gieten, gehomogeniseerd gedurende drie minuten bij 16.000 tpm. Voeg vervolgens een magnetische roerbar toe en roer de water- en olie-in-wateremulsie een nacht lang om het overtollige oplosmiddel te verwijderen na overnachte verwijdering van oplosmiddel. Giet de emulsie door een 40 micron nylon gaascellenzaif in een 50 milliliter kegelbuiscentrifugeerbuis gedurende vijf minuten, decant de supernatant, resuspendeer het pellet deeltjes in één milliliter water en breng de gesuspendeerde deeltjes over in een 1,5 milliliter microcentrifugeerbuis.

Verzamel de deeltjes door vijf minuten te centrifugeren. Meet de deeltjesgrootte door laserdiffractie of lichtverstrooiing. Zorg ervoor dat het volume water dat aan de fractiecel is toegevoegd, op een voldoende niveau staat voor uitlijning en blanking Pipetteer 10 microliter deeltjessuspensie in de fractiecel.

Sluit de compartimentdeur van de deeltjesgrootte-analysator. Meet vervolgens de deeltjesgrootte voor PLGA. Gebruik een brekingsindex van 1,60.

Gebruik de software-interface om de deeltjesdiameter te berekenen op basis van één dag vóór injectie. Verdoof de muis volgens een door het iacuc goedgekeurd dierprotocol. Evalueer de diepte van de anesthesie met een teen.

Pinch reflextesten en bewaak de ademhaling om een ademhalingssnelheid van 100 tot 120 ademhalingen per minuut te garanderen. Scheer het haar bij de staartbasis en de achterste kwart. Verwijder het haar van de ventrale zijde van het dier en lateraal rond naar de dorsale zijde net boven de gewrichtsverbinding van de achterpoot.

Gebruik voor elke kleurstofinjectie een micropipet om 10 microliter kleurstofoplossing over te brengen naar een microcenter fugebuis en aspireer de volledige 10 microliter door een naald van 31 gauge in een insulinesyringe van één milliliter. Injecteer nu 10 microliter kleurstofoplossing subcutaan aan elke kant van de staartbasis voor lading tussen injecties. Breng een milde ontharingscrème aan om de resterende haren te verwijderen.

Zorg ervoor dat u het gebied tussen de achterpoot en de buik bedekt. Na drie minuten gebruikt u een natte, behandschoende hand met warm H twee oh en wrijft u voorzichtig de ontharingscrème in de huid. Herhaal onmiddellijk om overtollige ontharing te verwijderen.

Bevochtig vervolgens een zachte doek of papieren handdoek met warm water en veeg in één beweging de onderste helft van de muis. Plaats de muis onder een verwarmingslamp om te herstellen en keer dan terug naar het houden gedurende ten minste 12 uur. Onderzoek de verdoofde muis om de drainage van spoor of kleurstof in elke inguinale lymfeklieren te bevestigen.

De lymfeklieren moeten zichtbaar zijn als een donkere vlek nabij de achterste dij en de buik. Resuspenseer nu de deeltjes in gedistilleerd water op de gewenste injectieconcentratie voor elke injectie. Gebruik een micropipet om 10 microliter deeltjesoplossing over te brengen naar een microcentrifugeerbuis.

Aspireer de volledige 10 microliter in een insulinenaald van 31 gauge die is bevestigd aan een spuit van één milliliter. Trek de huid strak rond de gekleurde lymfeklieren met de naald in een hoek van 90 graden ten opzichte van de huid. Dring de huid door tot een diepte van één millimeter.

Injecteer langzaam het volledige volume en bewaak het voor zichtbare lymfeklierenvergroting. Laat de muis herstellen onder een verwarmingslamp en keer dan terug naar het houden of voer aanvullende tests uit. Bevestig eerst de deeltjessynthese en de grootteverdeling.

Het emulsieoplosmiddelevaporatiesyntheseprotocol kan kwalitatief worden beoordeeld door visuele inspectie van de uiteindelijke emulsies. De emulsies moeten een