Name: Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Leer de visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen in gekweekte cellen met behulp van confocale microscopie en fluorescentieherstel na fotobleking. Deze methode onthult eiwitmobiliteit en ER-architectuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar Fondazione Filarete voor zijn hulp en steun bij de publicatie van dit artikel. We willen ook graag Centro Europeo di Nanomedicina bedanken voor het gebruik van de Tecnai G2 transmissie-elektronenmicroscoop.

1. Plasmide, Cultuur van de Cel, en transfectie met ER fluorescerende eiwitten <ol><li> De plasmide die in deze studie bestaat uit een verbeterde versie van GFP gefuseerd aan zijn C-terminus aan de staart gebied van de ER isovorm van ratten cytochroom b (5) (hier afgekort als b (5)) via een linkersequentie. De staart gebied bevat de hele reeks (Pro94-Asp134) dat membraangeassocieerde na de trypsine splitsing van inheemse b (5), met inbegrip van de 17-residu TMD (Transmembrane domein), geflankeerd door upstream en downstream polaire sequenties (UPS en DPS) blijft . De linker bevat de myc epitoop gevolgd door [(Gly) 4Ser] 3, en de volledige cDNA wordt in de Hind3-Xba1 plaatsen van de zoogdierlijke expressievector pCDNA3 ingevoegd. De details van de constructie van dit plasmide is beschreven in een eerdere publicatie waarin wordt verwezen als GFP-ER 16. </li><li> Kweek COS-7 cellen in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% fetal runderserum, 2 mM L-glutamine, 1% penicilline / streptomycine in een incubator bij 37 ° C en 10% CO2. </li><li> Transfectie. Plaat 3 x 10 5 cellen in een ronde glazen dekglaasje op een plaat met 6 putjes en de volgende dag transfecteren het jetPEI zoals beschreven door de fabrikant. Merk op dat de optimale jetPEI / DNA verhouding werd getest om de maximale transfectie-efficiëntie afhankelijk van het plasmide en gebruikte cellijn vastgesteld: in ons geval een jetPEI: DNA verhouding van 2:1 tot 70-80% transfectie efficiëntie. </li></ol> 2. Levende fluorescentie confocale microscopie <ol><li> Live-cell imaging. Plaats het dekglaasje waarop de getransfecteerde cellen geënt in een stalen kweek celkamer 24 mm dekglaasjes gevuld met DMEM w / o fenolrood, aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1% pen / strep, 25 mM HEPES , 50 ug / ml cycloheximide en 1:100 OxyFluor te voorkomen dat de monsters van fotobleken. Een SP5 confocale microscoope uitgerust met een temperatuurgestuurde CO2 incubator (37 ° C en 5% CO2) wordt gebruikt voor live cell imaging experimenten met d GFP-ER gevisualiseerd met een 488 nm laser en een 525/50 band pass emissiefilter. </li><li> Fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP). Teken een gebied van belang (ROI), overeenkomend met een OSER structuur en ontkleuren met 20 iteraties en een combinatie van 488 nm (100% van een 30 mW Argon laser, overeenkomend met 5,5-6 μW bij het monster) en 405 nm (60% van een 30 mW 405 Diode laser, wat overeenkomt met 11,6 μW bij de steekproef) lasers die, in onze ervaring, leidt tot een efficiënte en snelle fotobleking. </li><li> Noteer het herstel van fluorescentie in het gebleekte ROI door het nemen van een enkel frame elke 10 seconden gedurende 10 minuten (pixel tijd = 1,61 usee / px). </li><li> Fluorescentie verlies in photobleaching (FLIP). Teken een ROI overeenkomt met een OSER structuur en bleek zoals hierboven beschreven. Het bleken wordt herhaald om de 30 sec,en post-bleken beelden worden opgenomen na elke 10 seconden gedurende 30 minuten (pixel tijd = 1,61 usee / px). </li><li> FRAP en FLIP analyse. Alle beelden worden geanalyseerd met behulp van ImageJ software ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). In de FRAP experimenten wordt de fluorescentie herstel van de gebleekte ROI tijd gemeten en genormaliseerd naar het totale fluorescentie van gebleekt cel, die altijd gecontroleerd tijd constant zijn. </li><li> Voor de FLIP experimenten, trekken een ROI buiten de gebleekte OSER en die de hele cel. Meet de fluorescentie-intensiteit in de tijd en normaliseren de fluorescentie niveaus van een ROI opgesteld op ongebleekte cel om te corrigeren voor eventuele afname in fluorescentie veroorzaakt door de beeldvormende zelf. </li><li> In alle experimenten, afgetrokken het achtergrondsignaal (bepaald in een gebied buiten de cellen) van de fluorescentie-intensiteiten van de ROI. Tot slot, de resultaten worden met behulp van GraphPad Prism software. </li></ol> 3. Ultrastructurele Analyse door middel van Transmissie Elektronen Microscopie Gegeven de toxiciteit van vele reagentia dienen alle procedures uitgevoerd dragen passende lab. jas en handschoenen onder een afzuigkap. <ol><li> Na het verwijderen van het dekglaasje van de petrischaal, bevestig de overige cellen gekweekt op de bodem van de schaal als een monolaag met gefiltreerde 2% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer, pH 7,4, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Schraap de cellen met behulp van een Teflon schraper en breng ze in 1,5 ml Eppendorf buizen. Pellet de cellen door middel van centrifugatie bij 9.000 g gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, voeg verse fixatief, en laat het een nacht bij 4 ° C. </li><li> Was de korrels met bufferoplossing en vervolgens na vast met een oplossing van 1% osmiumtetroxide in cacodylaatbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Spoelen met MilliQ water en en bloc vlek met1% uranylacetaat met gedestilleerd water gedurende 20-60 minuten. </li><li> Dehydrateer de monsters in toenemende ethanolreeks (70%, 80%, 90%, 100% en 100% gedurende 10 min. elk), en was tweemaal kort propyleenoxide (15 minuten elk). </li><li> Infiltreren de monsters in een mengsel van propyleenoxide + Epon (01:01) (vanaf 2 uur tot overnacht). </li><li> Embed in Epon epoxyhars uitgehard bij 60 ° C gedurende ten minste 24 uur. </li><li> Sectie het handmatig geknipt hars blokken met behulp van een ultramicrotoom LEICA UC6 uitgerust met een 45 ° diamant mes om secties te verkrijgen met een dikte van 60-70 nm. Verzamel de hoofdstukken over 300 mesh koperen roosters. </li><li> Vlekken op de secties op de grid met een verzadigde oplossing van uranylacetaat (20 min) en loodcitraat (7 min), de roosters grondig door ze onder te dompelen in bi-gedistilleerd gefilterd water, en laat ze drogen op kamertemperatuur. </li><li> De gebrandschilderde roosters worden waargenomen met behulp van een Tecnai G2 transmissie-elektronenmicroscoop, en de beelden worden vastgelegd met behulp van een bottom-gemonteerde CCD-camera op verschillende uiteindelijke vergrotingen (doorgaans variërend van 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De protocollen en beeldvormingsbenaderingen beschreven in dit document zijn gebruikt om de verdeling en mobiliteit van getransfecteerde TA fluorescente eiwitten in het ER van levende cellen resident onderzoeken. We hebben ook onderzocht het effect van overexpressie van deze eiwitten op de architecturale subcellulair compartiment via ultrastructurele analyse. De combinatie van levende cellen confocale beeldvorming en elektronenmicroscopie staat is een zeer krachtig middel van onderzoek naar d...

De ontdekking van groen fluorescerend eiwit (GFP) en de spectrale varianten en de parallelle ontwikkeling van fluorescentiemicroscopie, zijn volledig nieuwe wegen voor het onderzoek van proteïne gedrag in cellen geopend. Technieken zoals fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) en fluorescentie verlies fotobleken (FLIP), die mogelijk zijn door de intrinsieke capaciteit van fluoroforen hun fluorescentie blussen onder intense belichting, gebaseerd op confocale live cell imaging en het gebruik van getransfecteerde fluorescente fusie-eiwitten 1-3. Zij worden wijd gebruikt om niet alleen de lokalisatie van eiwitten, maar ook hun mobiliteit en vesiculair transport, die belangrijk aanwijzingen betreffende hun functie 4 kan onthullen beoordelen. De unieke eigenschap van eukaryote cellen is de aanwezigheid van intracellulaire compartimenten die specifieke lipiden en eiwitten samenstellingen. Hoewel organellen zijn fysiek isolated., moeten ze communiceren met elkaar en delen moleculaire componenten om cellulaire homeostase. De secretieroute garandeert dat de gesynthetiseerd in het ER eiwitten en lipiden bereikt de juiste eindbestemming in waarin zij hun functie uitoefenen. Intracellulaire organellen kan ook worden aangesloten door middel van dynamische contact sites die moleculen (lipiden) rechtstreeks worden uitgewisseld tussen de compartimenten. Bovendien hebben veel eiwitten geassembleerd in grote heteromere complexen of geassocieerd met specifieke soorten lipiden (lipide rafts / microdomeinen) teneinde functioneel actief of hun eindbestemming worden vervoerd. Al deze biologische aspecten grote invloed op de kinetische eigenschappen van eiwitten, en derhalve passend worden onderzocht door middel van de hieronder beschreven technieken. Onze fractie heeft veel gebruikt FRAP en Flip combinatie met elektronenmicroscopie om de architectuur van de ER en de verschillende subsystemen bestuderendomeinen. De ER is het eerste station van de secretieroute en speelt een sleutelrol bij eiwit en lipide sorteren 5. Het is een zeer dynamische organel waarvan verschillende subdomeinen weerspiegelen de vele verschillende functies (dwz eiwitten en lipiden biosynthese en mensenhandel, het vouwen van eiwitten, Ca 2 + opslag en afgifte, en lichaamsvreemde metabolisme). Hoewel ze morfologisch, ruimtelijk en functioneel verschillende, deze domeinen continu met elkaar en hun relatieve abundantie kunnen in cellen worden gemodificeerd onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De bekendste en meestal ruimtelijk gescheiden domeinen van de ER zijn de nucleaire envelop, en de gladde en ruwe ER; echter, hebben wij en anderen aangetoond dat er ER structuren met een meer uitgebreide architectuur en drie-dimensionale organisatie gewerkt in diverse celtypen en weefsels onder fysiologische omstandigheden die ook kan worden geïnduceerd door middel van stressvolle stimuli zoals hypoxie, drugadministratie, of de over-expressie van ER-ingezeten transmembraaneiwitten 2,6 (en referenties daarin). We hebben onlangs aangetoond dat de aanwezigheid van dergelijke structuren celmodellen van menselijke ziekten 1,7. Afkomstig uit de gestapelde cisternae van gladde ER kregen ze de verzamelnaam georganiseerde gladde endoplasmatisch reticulum (OSER) 2003 6 weliswaar ook bekend als karmellae, lamellen en kristalloïde ER op basis van de architectuur die evenals de grootte, kan variëren. Nadat de cellen getransfecteerd met GFP gefuseerd aan de cytosolische regio-tail verankerd (TA) ER-resident eiwitten (d EGFP-ER), de zwak dimeriseren neiging van GFP in trans drastisch verandert de organisatie en structuur van de ER. FRAP en FLIP experimenten toonden aan dat d EGFP-ER vrij diffunderen in OSERs, en dat het zich van de reticulaire ER naar de OSER en vice versa &lt;/ Em&gt; geeft aan dat de aggregaten zijn continu met de omringende reticulaire ER. Ultrastructurele analyse heeft ons toegestaan ​​om de fluorescentie gegevens correleren met een gedetailleerde beschrijving van OSER architectuur en organisatie op nanoschaal niveau: OSERs zijn altijd opgebouwd uit stapels gepaarde cisternae van gladde ER, maar kan verschillende vormen van ruimtelijke organisatie, zoals regelmatig gerangschikte sinusvormige hebben arrays of kransen, of zeshoekige &quot;kristalachtige&quot; tubulaire arrays. Deze herschikkingen tot kubische morfologie 8 die, zoals ze gevonden in cellen onder fysiologische omstandigheden 9 en na stress zoals hypoxie 10, medicamenteuze behandeling 11 en kanker 9, kan aanzienlijk potentieel als ultrastructurele markers. Na deze eerste demonstratie met GFP-fusie-eiwitten, gebruikten we imaging experimenten om de proliferatie van ER domeinen analyseren reactie op farmacologische behandelingen 12, assess de neiging van fluorescente proteïnen oligomerise van cellen 13 en de rol van een mutant ALS-TA gebonden eiwit bij de vorming van intracellulaire aggregaten van ER oorsprong die zijn pathogeniciteit 1,8 relevant zijn onderzoeken. Er is gesuggereerd dat de vorming van intracellulaire aggregaten (dat voorkomt in vele neurodegeneratieve ziekten 14) een beschermend mechanisme om de interacties tussen toxische mutant eiwitten en de omringende celbestanddelen 15 voorkomen kan worden. Wat volgt is een beschrijving van een combinatie van optische en elektronenmicroscopie methoden voor onderzoek constructen waarvan de C-terminale hydrofobe domeinen in het membraan van het ER geplaatst, en een analyse van hun dynamisch gedrag en de effecten van hun over-expressie op ER- architectuur in gekweekte cellen (zie Figuur 1 een stroomdiagram van het experimentele protocol).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM) zonder fenol rood</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 4% oplossing</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td>licht radioactief</td></tr><tr><td>Propylene Oxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON inbeddingsmedium kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate </td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Spectral Confocal Microscoop </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Microscoopkooi Incubatie Systeem </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotoom </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmes </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie Elektronenmicroscoop </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stalen kweekcel kamer voor 24 mm dekglas</td><td>Bioscience Tools</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmicroscoop rasters</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

De lipiden en eiwitten in eukaryote cellen worden continu uitgewisseld tussen celcompartimenten, hoewel deze behouden hun karakteristieke samenstelling en functies, ondanks de intense interorganelle moleculaire verkeer. De in dit document beschreven technieken zijn krachtig middel van het bestuderen van eiwitten en lipiden mobiliteit en handel in vivo en in hun fysiologische omgeving. Fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) en fluorescentie verlies fotobleken (FLIP) worden veel gebruikt levende cellen beeldvormende technieken voor het bestuderen van intracellulair verkeer door de exo-endocytische route, de continuïteit tussen organellen of subcompartimenten, de vorming van eiwitcomplexen en eiwit lokalisatie in lipide microdomains, die kan worden waargenomen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De beperkingen van deze benaderingen vooral door het gebruik van fluorescente fusieproteïnen en hun potentiële nadelen zijn kunstmatig overexpressieionen in cellen en de mogelijkheid van verschillen in de vouwen en lokalisatie van merktekens en natieve eiwitten. Ten slotte de oplosgrens optische microscopie (ongeveer 200 nm) niet onderzoek naar de fijnstructuur van het ER of de specifieke subcompartimenten die kan ontstaan ​​in cellen onder stress staan ​​(bijvoorbeeld hypoxie, geneesmiddeltoediening, de over-expressie van transmembraan ER resident eiwitten) of onder pathologische omstandigheden, combineren we live-cell imaging gekweekte getransfecteerde cellen met ultrastructurele analyse op basis van transmissie elektronenmicroscopie.

Figuur 2 toont een voorbeeld FRAP studie mobiliteit eiwit. De mobiliteit van d EGFP-ER eiwit blijkt uit de snelle fluorescentie herstel na fotobleken in gebleekt OSERs. Voor de kwantitatieve analyse, de rust en de mobiele fractie werden afgeleid uit experimenteel gemeten gegevens door het aanbrengen van de volgende mono-exponentiële vergelijking: F (t) = F bericht + (F rec-F post) (1-e-t / τ) waa...

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te onderzoeken hoe getransfecteerde fluorescerende eiwitten verdeeld zijn en zich bewegen in het endoplasmatisch reticulum, en om het effect van expressie op de ultrastructurele architectuur te beoordelen. Hiervoor worden gecultiveerde cellen transient getransfecteerd met GFP-gelabelde, staartverankerde ER-residente eiwitten. Na transfectie wordt live-cell confocale imaging uitgevoerd om fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) en fluorescence loss te beoordelen.Bij fotobleken of flip wordt ultrastructurele analyse uitgevoerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. De resulterende gegevens tonen aan dat de expressie van het GFP-getagde B5-construct de organisatie en structuur van het endoplasmatisch reticulum drastisch verandert, wat leidt tot de vorming van aggregaten. De methode die we hier demonstreren, kan inzicht bieden in fundamentele celbiologische processen, zoals de mobiliteit en het transport van eiwitten en lipiden.Het kan ook worden gebruikt om reacties op farmacologische behandelingen te bestuderen, om fluorescent eiwit- of oligo-modernisering te evalueren, of om de rol van pathogene mutante eiwitten te bestuderen bij de vorming van intracellulaire aggregaten van de oorsprong die relevant kunnen zijn voor hun pathogeniteit, zoals bij atrofische laterale sclerose. Het in deze studie gebruikte plasmide bestaat uit een verbeterde versie van GFP die aan het C-terminus gefuseerd is met de staartregio van de er-isoform van rat cytochrome B5 via een linkersequentie. De staartregio van B5 bevat de volledige sequentie die membraangeassocieerd blijft na splitsing door trypsine.Dit omvat het transmembraandomein van 17 residuen, geflankeerd door upstream en downstream polaire sequenties. De linker bestaat uit het M-epitoop gevolgd door GLY vier S3. De volledige cDNA wordt ingebracht in de HindIII- en XhoI-sites van de mammaliaanse expressievector pcDNA3. Ter voorbereiding op de transfectie worden COS-7-cellen gekweekt in aangevuld DMEM bij 37 °C en 5% CO2; de dag voor de transfectie worden 3 × 10⁵ cellen geplaatst op ronde glazen dekglasjes van 24 mm in een zes-well plaat voor de volgende dag.Transfecteer de cellen met het jet PEI-systeem zoals hier beschreven door de fabrikant, waarbij een jet PEI-tot-DNA-ratio van twee op één wordt gebruikt. Dit leidt doorgaans tot een transfectie-efficiëntie van 70 tot 80%. Houd de cellen gedurende 24 uur vóór de beeldvorming op 37 °C en 5% CO2. Gebruik vervolgens een pincet om een dekglas met getransfecteerde cellen over te brengen naar de beeldvormingskamer.Plaats de weefkweekschaal terug in de incubator om de resterende cellen te bewaren. Voor ultrastructurele analyse via elektronenmicroscopie. Voor live-cell imaging voegt u twee milliliters imaging-medium toe aan een stalen celkweekkamer.Xi Fluor wordt toegevoegd aan het beeldmedium om fotobleken van de monsters te voorkomen. Experimenten moeten worden uitgevoerd in aanwezigheid van smide, een translatieremmer, om elke toename van het A-fluorescentiesignaal en bijgevolg de totale fluorescentie als gevolg van eiwitbiosynthese te vermijden. Plaats de beeldkamer op de tafel van een confocale microscoop, uitgerust met een temperatuurgecontroleerde CO2-incubator en geschikte lasers met passende instellingen van de fotomultiplicators om fluorescentieherstel uit te voeren.Breng na het fotobleken of fracken de cellen in focus en stel de acquisitieparameters in om verzadiging van de pixels te voorkomen. Zorg er daarnaast voor dat het laservermogen zo laag mogelijk is ingesteld om fotobleken als gevolg van de beeldacquisitie te vermijden. Zodra de beeldvormingsparameters zijn ingesteld, gaat u naar een nieuw gezichtsveld met twee of meer cellen.Eén cel in elk acquisitieveld moet ongebleekt blijven, zodat deze gebruikt kan worden om het fluorescentiesignaal van de gebleekte cel of cellen te normaliseren. Voor het bleken: teken een region of interest of ROI die overeenkomt met een georganiseerd glad endoplasmatisch reticulum of OSER.Stel het beeldvormingsprogramma in op bleken met een adequaat aantal iteraties voor efficiënt en snel fotobleken. Indien nodig kan een combinatie van 488 nanometer en 405 nanometer lasers worden gebruikt. Instrueer de software om gedurende de gehele loop van het experiment elke 10 seconden één frame vast te leggen gedurende 10 minuten. Dit omvat de perioden voor het bleken, het bleken zelf en het herstel.Zodra alles is ingesteld, start u het bleken en de acquisitie. Wanneer de acquisitie is voltooid, gaat u naar een nieuw gezichtsveld en herhaalt u dit proces. Leg vier tot vijf gezichtsvelden vast voor elk dekglas.Kies vervolgens voor het meten van fluorescentieverlies bij fotobleken of flip. Instrueer het programma om een sequentie van bleken en imaging na het bleken uit te voeren gedurende 10 seconden elke 30 seconden gedurende 10 minuten, en verplaats dit vervolgens naar een nieuw gezichtsveld. Teken een ROI die overeenkomt met een OSER-structuur en start het bleken en vastleggen zoals voorheen voor analyse.Importeer de FRAP- en FLIP-afbeeldingen in de software ImageJ. Beoordeel eerst voor de FRAP-experimenten het herstel van de fluorescentie van de gebleekte ROI in de loop van de tijd, en bepaal vervolgens de achtergrondfluorescentie door een gebied buiten de cellen te selecteren en de gemiddelde intensiteit daarvan in de loop van de tijd te meten. Trek daarna het achtergrondsignaal af van de fluorescentie-intensiteiten van de ROI's.Normaliseer de gegevens ten opzichte van de totale fluorescentie van de gebleekte cel, welke in de loop van de tijd constant zou moeten blijven. Pas vervolgens de hier getoonde mono-exponentiële vergelijking toe, waarbij F post het fluorescentiesignaal na fotobleken is. F rec is de maximale waarde van het fluorescentieherstel die na het bleken is bereikt, T is het eindtijdstip van de registratie, en tau is het middelste tijdstip van de registratie.Trek voor de analyse van de flip-experimenten een ROI buiten de gebleekte OSER die de gehele cel beslaat en meet de fluorescentie-intensiteit in de tijd. Net als bij de frack-experimenten moet de achtergrond worden afgetrokken door een gebied buiten de cellen te gebruiken. Normaliseer de gegevens ten opzichte van de fluorescentieniveaus van een ROI getrokken op een niet-gebleekte cel om te corrigeren voor elke afname in fluorescentie die wordt veroorzaakt door de beeldvorming zelf.Zet tenslotte de resultaten uit met GraphPad Prism of vergelijkbare software. Veel van de reagentia die worden gebruikt bij de preparatie van de monsters voor elektronenmicroscopie zijn toxisch. Daarom moeten de volgende stappen worden uitgevoerd met een laboratoriumjas en handschoenen, terwijl er onder een zuurkast wordt gewerkt.Nadat het dekglas uit de Petrischaal voor optische microscopie is verwijderd, worden de overgebleven cellen die als monolaag op de bodem van de schaal zijn gegroeid, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd. Los vervolgens de cellen los met een Teflon-schraper en breng ze over naar 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes; pellet de cellen door centrifugatie bij 9.000 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant, voeg vers fixatief toe en laat dit een nacht bij 4 °C staan.Was de pellets door het fixatiemiddel voorzichtig af te zuigen met een Pasteurpipet en cate-buffer toe te voegen. Om te voorkomen dat het pellet wordt verstoord, dient de buffer langs de zijwand van de buis naar beneden te lopen tijdens het toevoegen. Zuig de wasoplossing af en voer de na-fixatie uit door de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in een oplossing van 1% Osmiumtetroxide in cate-buffer te plaatsen.Spoel vervolgens met Milli Q-water en voeg 1% urinaalacetaat in gedestilleerd water direct toe aan de microcentrifugebuis. Ontblok de kleuring gedurende 20 minuten tot een uur, dehydrateer de monsters in een oplopende ethanolserie van 70%, 80%, 90%, 100% en opnieuw 100%, telkens gedurende 10 minuten. Was de pellets daarna twee keer in propylenoxide, telkens gedurende 15 minuten.Infiltreer de monsters door het propyleenoxide te vervangen door een mengsel van propyleenoxide en Epon in een verhouding van één-op-één en incubeer dit gedurende ten minste twee uur, maar eventueel tot een nacht. Plaats vervolgens de fragmenten van de celpellet in inbeddingsvormen die vooraf zijn gevuld met Epon-epoxyhars om de monsters in te bedden en laat dit uitharden bij 60 °C gedurende ten minste 24 uur. Monteer de volgende dag het harsblok op een ultramicrotoom die is uitgerust met een diamanten mes van 45 graden.Trim de harsblokjes handmatig met een trimmes om de delen van het harsblokje waarin het ingebedde monster zich niet bevindt te verwijderen. Maak vervolgens met de ultramicrotoom coupes van 60 tot 70 nanometer. Verzamel de coupes op koperen grids met een mesh-grootte van 300 om de coupes te kleuren.Plaats de roosters op druppels van 30 µL van een verzadigde oplossing van uranylacetaat en incubeer gedurende 20 minuten. Spoel vervolgens drie keer met Milli-Q water en incubeer de roosters opnieuw op kleine druppels loodcitraat gedurende zeven minuten. Was de roosters na de incubatie grondig door ze onder te dompelen in Milli-Q water en laat ze drogen bij kamertemperatuur.Observeer de gekleurde grids met een transmissie-elektronenmicroscoop en leg beelden vast met een aan de onderzijde gemonteerde CCD-camera bij de uiteindelijke vergroting, variërend van 6, 000 tot 39, 000 x, om de laterale diffusie van D-E-G-F-P ER in georganiseerd, glad endoplasmatisch reticulum te onderzoeken. Zeven transient getransfecteerde cellen van drie dekglasjes werden geanalyseerd via FRAP zoals beschreven in deze video; zoals getoond in deze time-lapse sequentie werden twee OSER-structuren gebleekt en werd het herstel van fluorescentie in de loop van de tijd geregistreerd. Duidelijk herstel van fluorescentie werd gedetecteerd één minuut na het bleken, met een verdere toename van het signaal vier minuten later, om de hersteltijd (halveringstijd) te bepalen en de mobiele fractie van D-E-G-F-P-E-R te kwantificeren.De vastgelegde beelden werden geanalyseerd zoals beschreven in deze video, zoals hier te zien is. De fluorescentie-intensiteit van het gebleekte gebied nam na verloop van tijd toe, wat aantoont dat het fluorescerende eiwit zeer mobiel is binnen de aggregaten. Om de continuïteit tussen verschillende subdomeinen van het endoplasmatisch reticulum te bestuderen, werden flip-experimenten uitgevoerd, zoals getoond in deze time-lapse sequentie.Het continue bleken van een OSER, hier aangegeven door de gele pijl, veroorzaakt een progressieve afname van de fluorescentie in de rest van het ER en in andere OSER-structuren binnen dezelfde cel. De rode pijl geeft een deel van een niet-gebleekte cel aan waarin het fluorescentiesignaal constant is over de tijd. Kwantitatieve analyse van deze gegevens onthulde een progressieve en snelle lediging van het reticulaire ER, wat aantoont dat de aggregaten fysiek verbonden zijn met de rest van het ER. Om de fijne architectuur van deze aggregaten te onderzoeken, werden cellen die hoge niveaus van D-E-G-F-P ER tot expressie brachten, geobserveerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.Deze micrografie toont een overzicht bij lage vergroting van het celcytoplasma met een aggregaat van membranen. Het aggregaat bestaat uit gestapelde cyi en golvende sinusvormige membranen, zoals hier te zien is.Mitochondriën zijn te zien geclusterd rond de OSER-structuren, terwijl ribosomen, aangegeven door de pijlpuntjes, enkel de membranen van de buitenste cyi sieren. Let op dat de 11 nanometer dikke elektronendichte ruimte tussen de membranen in verbinding staat met het cytoplasma. Een OS ER kan gevormd worden door lamellair er, wat stapels afgeplatte er cyi zijn die in dunne coupes continu of gefragmenteerd kunnen voorkomen; blaasjes die uitknopben uit de buitenste cisterna van de stapel kunnen af en toe worden waargenomen, zoals hier is getoond.Samen tonen deze gegevens aan dat de fluorescerende aggregaten waargenomen in gecultiveerde cellen getransfecteerd met D-E-G-F-P ER plekken van gladde en afgeplatte er steri vertegenwoordigen die zich ruimtelijk organiseren in duidelijk gedefinieerde 3D-geometrieën. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle beelden zonder verzadigde pixels moeten worden vastgelegd, aangezien deze de fluorescentieherstel kunnen beïnvloeden en bijgevolg de analyse van de eiwitmobiliteit. Zorg er altijd voor dat het fluorescerende signaal in het gebleekte gebied van interesse wordt genormaliseerd ten opzichte van de totale fluorescentie van dezelfde cel, om rekening te houden met variaties in fluorescentie-intensiteit door bleaching tijdens de beeldacquisitie of kleine veranderingen in het focusvlak.

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Bepalen van het aantal cellen in cultuur is belangrijk in standaardisatie van kweekomstandigheden en in het uitvoeren van nauwkeurige kwantificatie experimenten. In deze video laten we zien hoe cellen worden geteld met behulp van een hemacytometer.

Tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

Leer de visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen in gekweekte cellen met behulp van confocale microscopie en fluorescentieherstel na fotobleking. Deze methode onthult eiwitmobiliteit en ER-architectuur.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Meer video's verkennen