Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie

Het algemene doel van deze procedure is het transfecteren van primaire postnatale neuroblasten van knaagdieren om het effect van doeleiwitten op hun migratie te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst neuroblasten te dissekeren uit de rostrale migratiestroom (rostral migratory stream) van de knaagdierpopulatie. De tweede stap is om deze te dissociëren en te transfecteren via nuclefectie met DNA of shRNA.

Vervolgens worden de neuroblasten opnieuw geaggregeerd in hangende druppels en daarna gedurende een passende tijd in suspensie gekweekt. De laatste stap is om de opnieuw geaggregeerde neuroblastcluster in een driedimensionale matrix in te bedden en ze te laten migreren. Ten slotte wordt immunofluorescentie of time-lapse imaging microscopie gebruikt om de migratie van de neuroblasten te analyseren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag binnen het veld van de neurogenese, zoals de aansturing van de migratie van uit stamcellen afgeleide neuroblasten in het postnatale brein. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze relatief eenvoudig en snel is in vergelijking met het gebruik van virale vectoren, wat uitdagend en tijdrovend kan zijn. Maak na het opofferen van een P6 tot P7 rattennest bij elke rat met een scalpelblad een posteriore incisie in de huid langs de midsagittale naad van de neus tot het cerebellum.

Pel vervolgens de huid af. Herhaal dezelfde incisie langs de schedel. Verwijder daarna voorzichtig de schedelflappen met een pincet en neem de hersenen samen met de bulbi olfactorii zorgvuldig weg met een spatel.

Snijd daarna het meest caudale derde deel van de hersenen af en gooi dit weg. Hak vervolgens het hersenweefsel met een weefselhakker in coronale coupes met een dikte van 1,4 millimeter. Breng de coupes over naar een schaal met koud dissectiemedium.

Bekijk vervolgens de coupes onder de dissectiemicroscoop. Scheid deze zorgvuldig met een naald. De rostrale migratiestroom is zichtbaar als een driehoekig doorschijnend gebied in het centrum van de OB-coupes en als een klein cirkelvormig gebied.

Snijd in meer hersensecties de RMS uit elke sectie met een microsurgisch mes, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen omliggend weefsel wordt meegenomen. Verzamel vervolgens de RMS-fragmenten met een plastic Pasteurpipet en plaats deze in een klein schaaltje met koud dissectiemedium op ijs. Draai vervolgens het schaaltje voorzichtig om de RMS-fragmenten in het midden van het schaaltje te verzamelen.

Verzamel de fragmenten met een plastic pipet en breng ze over naar een buis van 15 milliliter. Laat de fragmenten bezinken op de bodem van de buis. Vervang het dissectiemedium door twee milliliters dissociatiemedium T tri.

Homogeniseer de RMS-fragmenten door de fragmentensuspensie vervolgens ongeveer 10 keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een P 1000 pipet. Plaats de buis met de weefselfragmenten gedurende twee minuten in een waterbad van 37 °C. Pipetteer de oplossing daarna opnieuw 10 keer en controleer of de fragmenten zijn gedissocieerd.

Inactiveer vervolgens de trypsine door vijf milliliter voorverwarmd DMEM plus 10% FCS toe te voegen en centrifugeer de celсусpensie bij 433 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het overtollige medium en resuspendeer de celpellet door deze voorzichtig te pipetteren in één milliliter voorverwarmd DMEM plus 10% FCS, en voeg vervolgens nog eens vier milliliter van hetzelfde medium toe.

Voer vervolgens een celtelling uit. Voor elke nucleofectie is een minimum van 2,5 × 10⁶ cellen vereist, terwijl optimale resultaten worden behaald bij het gebruik van 3 tot 4 × 10⁶ cellen per nucleofectie.

Centrifugeer de celsuspensie bij 433 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder daarna in deze procedure zoveel mogelijk medium. Resuspendeer het celpellet onmiddellijk in de eerder geïncubeerde nucleo-affectie-oplossing voor ratneuronen.

Breng bij kamertemperatuur 100 µL van de celsuspensie over naar elke EOR-buis die SI R-N-A-D-N-A bevat. Meng dit vervolgens voorzichtig door twee tot drie keer te pipetteren met een P 200 pipette. Voeg daarna de monsterinhoud toe aan de bodem van de nucle affection vete, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan.

Gebruik voor nucleofectie programma G-013 voor ratcellen of O-005 voor muiscellen. Voeg daarna snel 1 ml voorverwarmd DMEM plus 10% FCS toe aan het genucleofecteerde monster. Overbreng het monster met de plastic pipet uit de nucleofectiekit naar een buis van 15 ml met 5 ml voorverwarmd DMEM plus 10% FCS.

Centrifugeer het monster vervolgens 5 minuten bij 433 ×g. Verwijder voorzichtig al het overtollige medium en resuspendeer de pellet in 25 tot 30 µL voorverwarmd DMEM plus 10% FCS met een P 20 pipet. Gebruik niet meer dan 30 µL medium.

Pipetteer vervolgens de suspensie als een druppel op de binnenkant van een P 35 schoteldeksel. Keer het deksel daarna om boven de P 35 schotel die twee milliliter compleet medium bevat. Laat dit gedurende ten minste vijf uur in de incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide staan.

Breng na vijf uur de hangende druppels van het deksel over naar het complete medium in de schaal. Gebruik hiervoor een P 1000 pipette met een afgeknipt tipje. Incubeer de monsters vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2 voor DNA NU nucleaire infecties, of 48 uur voor SI A HRA nucleaire infecties.

Bereid nu 25 milliliter compleet medium en laat dit enkele uren pre-equilibreren bij 37 °C met 5% CO2. Haal ondertussen de bevroren aliquoten van de basement membraan matrix uit de vriezer van -80 °C en laat deze op ijs ontdooien in de koude kamer. Bereid voor elke nucleare affectie een schaal van zes centimeter met daarin maximaal acht steriele dekglasjes van 13 millimeter.

Plaats de schalen op een koelbox die is afgedekt met vershoudfolie. Om de vochtigheid te behouden, plaatst u een strip vochtig keukenpapier in een schaal van 15 centimeter die gebruikt zal worden om maximaal drie schalen van zes centimeter met daarin in knie-embedded oblasts vast te houden. Voeg vervolgens het complete medium toe aan de haw-matrix in een verhouding van één op drie, overbreng de geheraggregeerde celclusters naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze 433 ×g gedurende vijf minuten.

Verwijder daarna het overtollige medium en resuspendeer de pellet in 10 µL compleet medium. Plaats vervolgens twee µL van de celaggregaatsuspensie op elk steriel dekglas. Voeg 18 µL van het matrix-compleet mediummengsel toe en gebruik de pipetpunt om de matrix over het gehele dekglas te verspreiden.

Plaats onmiddellijk na het plaatsen van de zes centimeter schaal met de dekglasjes in de 15 centimeter schaal. Verplaats de schaal naar de incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor 15 tot 20 minuten. Nadat de matrix is gestold, voegt u voorzichtig vijf milliliter compleet medium toe aan elke zes centimeter schaal en drukt u eventuele drijvende dekglasjes met de pipetpunt naar beneden; incubeer vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% carbogen om de neuroblasten uit de celaggregaten te laten migreren.

In deze figuur is te zien dat de geïsoleerde rat RMS-cellen immunopositief zijn voor de migratiemarkers voor neuroblasten DCX en bèta-tubuline III. En deze figuur laat zien dat de migratiemarkers voor neuroblasten DCX en PSA-NCAM tot expressie komen in de cellen die migreren uit de muis RMS. Voor de nucleaire affectie van muisneuroblasten werden gedissocieerde muis RMS-neuroblasten genucleffecteerd met GFP, opnieuw geaggregeerd, ingebed in een driedimensionale matrix en zes uur de tijd gegeven om te migreren.

De neuroblasten die migreren vanuit een geaggregeerde celcluster vertonen een hoge transfectie-efficiëntie. Hier werden ratten-neuroblasten getransfecteerd met twee verschillende plasmiden die GFP coderen, opnieuw geaggregeerd en ingebed in een matrix, waarna ze 24 uur lang mochten migreren. De cellen werden vervolgens gefixeerd en immunogekleurd voor GFP en bèta-III-tubuline om de migratieafstand te meten.

De geaggregeerde celcluster wordt verdeeld in zes gelijke sectoren en de afstand tussen de rand van de cluster en de verste gemigreerde cel wordt voor elke sector gemeten. Deze figuur toont de kwantificering van de relatieve migratieafstand van de GFP-positieve NUCLE-beïnvloede cellen en de controle GFP-negatieve niet-nucle-beïnvloede cellen om de migratie van neuroblasten te monitoren. Na S-H-R-N-A Nucle-beïnvloeding werden ratten-neuroblasten beïnvloed met een controle S-H-R-N-A-vector of dezelfde vector met een HRNA-target voor een fasten- en actin-bundelend eiwit; de cellen werden gedurende 48 uur opnieuw geaggregeerd, ingebed in matrix en gedurende 24 uur gelaten om te migreren.

Aggregaten werden vervolgens gefixeerd en immunogeel gekleurd voor GFP en bèta-tubuline III. Effectieve depletie van Fascin kan 50 uur na S-H-R-N-A-nucleïnjectie worden aangetoond via Western blot-analyse, waarbij Actine hier is weergegeven als ladingscontrole. Hier volgt de kwantitatieve analyse van de relatieve migratieafstand, waaruit blijkt dat Fascin-depletie de migratie van neuroblasten significant belemmert.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals postnatale electroporatie, worden uitgevoerd om de in vivo resultaten die met de NU Nuclear Affection migratie-assay zijn verkregen, te valideren.