Identificatie van een Muriene erytroblast subpopulatie verrijkt in Enucleating Events door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om de identificatie van enucleatiegebeurtenissen met een aurn Erythroblast-subpopulatie te vergemakkelijken. De eerste stap is om een populatie te creëren die verrijkt is met nucleerende gebeurtenissen. Dit wordt bereikt door in vitro erytropoëse-cultuur, hetzij langdurig, beginnend met lagedichtheidsbeenmergcellen die zijn geïsoleerd uit de femurs, tibia en bekkenbeenderen van een niet-gestresste muis, of kortdurige cultuur.

Begin met plecyten uit de milt van een muis die eerder aan flebotomie is onderworpen om stresserytropoëse op te wekken. De gekweekte cellen in de laatste stap van de cultuur worden gefixeerd, gepermeeerd en gekleurd met de fluorescerende markers van belang. Deze cellen worden op een flow cytometer met beeldvorming gelopen en vervolgens geanalyseerd om de cellen te identificeren die enucleatie ondergaan in de populatie van nucleerende cellen. Signaal- en cytoskeletcomponenten die het proces van enucleatie reguleren en mediëren, kunnen worden geïdentificeerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals fluorescerende microscopie, is dat het aanzienlijk grotere aantal nucleerende cellen in een korte tijd kan worden waargenomen en geanalyseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het erytropoëse-gebied, zoals welke moleculaire mechanismen betrokken zijn bij erytroblast-nucleatie. Om erytroïde cellen te onderscheiden van lagedichtheidsbeenmergcellen begin je met het toevoegen van één milliliter kweekmedium aan een steriele flowcytometriebuis.

Bevestig vervolgens een 25 gauge door vijf achtste inch naald aan een tuberculine-spuit en spoel voorzichtig vers kweekmedium door de geoogste femurs en tibia een paar keer in de flowcytometriebuis. Na het aanpassen van het celsuspensievolume tot vijf milliliter met IMDM, plaats je voorzichtig een laag op vijf milliliter van 1,083 gram per milliliter dichtheidsgradiëntcelscheidingsmedium in een 15 milliliterbuis. Breng alles naar beneden tot de tweede millilitermarkering over in een nieuwe 15 milliliterbuis en was de verzamelde buffycoat met vers kweekmedium rood bloedcellen in drie milliliter rode bloedcellysebuffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van cellen in kweekmedium en het resuspenderen van het pellet in dezelfde plaat, worden de cellen in een zes-putjescelkweekplaat geplaatst met een concentratie van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per putje tot een eindvolume van 2,5 milliliter in groeimedium en worden de cellen geïncubeerd bij 37 graden Celsius vijf dagen na het plateren van de cultuur.

Tel het aantal erytroblasten in elk putje van de oorspronkelijke kweekplaat en plaats vervolgens elk putje in overeenkomstige individuele 15 milliliter kegelbuisjes. Na het centrifugeren van de cellen, aspireer de supernatanten en resuspendeer de pellets in vers groeimedium met alleen erytropoëtine tot een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Aspireer vervolgens het supernatant van een plaat van MS vijf cellen en voeg de erytroïde cellen toe aan de putjes.

Twee dagen later, vervang je het supernatant met vers groeimedium zonder cytokinen om erytroblasten van lagedichtheid PLEcytes te verkrijgen. Gebruik de plunjer van een vijf milliliterspuit om de milt te vermalen door een 40 micron zeef in een 50 milliliterbuis. Was de celzeef met groeimedium en pas het eindvolume van de celsuspensie aan tot vijf milliliter.

Nadat je de cellagen hebt gescheiden door middel van een dichtheidsgradiënt, zoals zojuist is gedemonstreerd, lyse je de rode bloedcellen en was je de cyten in zeven milliliter kweekmedium. Resuspendeer vervolgens het pellet in groeimedium aangevuld met cytokinen en incubeer de cellen bij een tot vijf keer 10 tot de zesde cellen in een eindvolume van één milliliter per putje van een 24-putjescelkweekplaat overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag.

Breng cellen over naar putjes met geadhereerde MS vijf cellen zoals eerder beschreven en analyseer na zes tot acht uur, verzamel de erytroblasten uit de kweekputjes en fixeer ze in 500 microliters 3,7% formaldehyde in PBS. Resuspendeer het pellet voorzichtig met zachte pipetting. Na 15 minuten, centrifugeer de cellen bij 2000 GS gedurende 20 seconden in een microcentrifuge, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in 500 microliters PBS. Na het centrifugeren van de cellen in de microcentrifuge, aspireer opnieuw het supernatant en plaats de cellen gedurende ten minste 15 minuten op ijs.

Plaats minus 20 graden Celsius, opgeslagen acetonoplossingen op ijs. Resuspendeer vervolgens snel en centrifugeer de cellen neer in een reeks acetonwasbeurten zoals aangegeven na de faxbufferwas, incubeer de celpellets in 100 microliters van de geschikte antilichaamcocktail gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van de cellen in faxbuffer opnieuw, resuspendeer de gehandhaafde pellets in 60 microliters faxbuffer met drac vijf en voer de monsters uit op een flow cytometer met beeldvorming en verzamel minimaal 10.000 gebeurtenissen per experimenteel monster.

Begin vervolgens met de analyse door cellen te selecteren op basis van hun brightfield aspectverhouding, de verhouding van de lengte van hun kleine as tegen hun grote as en hun brightfield oppervlakte, wat indicatief is voor hun grootte. Gebeurtenissen met een brightfield oppervlaktewaarde lager dan 20 en hoger dan 200 zijn meestal puin en celaggregeren respectievelijk en worden uitgesloten van de analyse. De analyse van de enkele cellen wordt vervolgens gebaseerd op hun waarde voor de gradiënt RMS-parameter, die de scherpte van de afbeelding aangeeft. Maak een tweede poort met de cellen met een gradiënt RMS-waarde groter dan de 50e percentiel om de afbeeldingen te selecteren die goed in focus zijn genomen.

Volgende poort, de cellen op basis van hun grootte zoals gemeten door hun brightfield oppervlakte en hun positiviteit voor de erytroïde marker TER één 19 zoals gemeten door de TER één 19 fluorescerende kleurmiddelgemiddelde pixelparameter cellen zeer laag of zeer hoog voor TER één 19 zijn respectievelijk niet-erytroïde of resterende celaggregeren en worden uitgesloten van de analyse in de volgende stap