Name: Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer een mechanische micropreparatietechniek om levensvatbare klieren te isoleren uit Nepenthes-weefsel. Deze methode maakt gedetailleerde moleculaire en biochemische analyse van deze gespecialiseerde structuren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het kasteam van het MPI-CE in de Botanische Tuin van de Friedrich Schiller Universiteit, Jena, voor het kweken van planten en Wilhelm Boland en de Max Planck Society voor hun steun.

1. Plant Material Preparation
<ol>
	<li>Alle Nepenthes-soorten werden gekweekt in de kassen van het MPI voor Chemical Ecology of in de Botanische Tuin in Jena, Duitsland.</li>
	<li>Voor de voorbereiding van het secreterende weefsel oogst u een kelk en verwijdert u het bovenste derde gedeelte inclusief deksel, peristomium en gladde zone. De kelk kan vers worden gebruikt of ingeslagen in vloeibaar stikstof en bewaard op -80 °C.</li>
</ol>
2. Microdissectie van Kelkweefsel
<ol>
	<li>Het microsampling platform bestaat uit een stereomicroscoop en een micromanipulator, die rechtstreeks is bevestigd aan de microscoop en wordt bediend door een 3D joystick. Hier werd een vroege prototype van aureka gebruikt zoals gedocumenteerd (Figuur 2A).</li>
	<li>Gebruik voor het dissekeren van secretoire klieren uit Nepenthes kelken een microtang en bevestig deze aan de manipulator (Figuur 2A en 2B).</li>
	<li>Voor RNA-extractie behandelen alle instrumenten (scheermessen, pincetten, micromanipulator, microtang, objectslide) met RNaseZAP.</li>
	<li>Bereid de opvangbuisjes voor door 9 μl nuclease-vrij water en 1 μl RNase-remmer toe te voegen in een PCR-buisje voor RNA-extractie. Voor directe PCR van weefselmonsters gebruikt u alleen nuclease-vrij water (10 μl).
	<ol>
		<li>Neem de verse of ingevroren kelk en verwijder een stukje weefsel van 1-2 cm2 dat de secretoire klieren bevat, door een scheermes en pincetten te gebruiken. Was het weefsel met water; voeg 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) toe als RNA zal worden geëxtraheerd.</li>
		<li>Fixeer het plantmateriaal met dubbelzijdig plakband op een objectslide (de klierbedekte oppervlakte moet naar boven gericht zijn, Figuur 2C en 2D) en zet de slide vast met plakband op een universele tafel, die moet worden toegepast met een beweegbare tafel.</li>
		<li>Voor het extracteren van nucleïnezuren moet de voorbereiding op ijs worden gedaan. Neem daarom een vlakke schuimrubberen doos, plaats de universele tafel met het monster erin en vul de doos met ijs. Plaats daarna de doos onder de microscoop.</li>
		<li>Voor de voorbereiding is de positionering van de klieren erg belangrijk. De secretoire klieren zijn gedeeltelijk bedekt door een beschermende kap (Figuur 3) en alleen toegankelijk voor de pincetten vanaf één kant. Verder moet de hoek van het monster ten opzichte van de pincetten worden aangepast door de tafel van de universele tafel ongeveer 135° te kantelen, afhankelijk van de Nepenthes-soort.</li>
		<li>De microdissectie gebeurt onder visuele controle. Gebruik voor het isoleren van de klieren een niet-UV-filter om de degradatie van DNA en RNA te beperken.</li>
		<li>Verplaats de micromanipulator en de pincetten via het bedieningspaneel naar de geselecteerde klier. Wanneer de klier is bereikt, plaatst u elke arm van de pincetten aan weerszijden van de klier. Verwijder de klier van het overgebleven weefsel door de pincetten te sluiten (Figuur 4A).</li>
		<li>Leidt de klier die aan de pincetten is bevestigd, weg van het object en naar de opvangbuis. Breng de uiteinden van de pincetten in contact met de oplossing in de buis (Figuur 4B). Het loslaten van de klier door de pincetten te openen moet goed worden waargenomen, omdat de klieren de neiging hebben om op de punt van het gereedschap te plakken. Het weefsel kan worden bewaard bij -80 ° C tot PCR of RNA-extractie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Directe PCR-amplificatie van Nepenthes-weefsel
<ol>
	<li>Om de efficiëntie van de voorbereidingsmethode te bewijzen, kan een PCR-aanpak rechtstreeks vanuit het klierweefsel zonder een DNA-extractiestap worden uitgevoerd.</li>
	<li>Gebruik voor de PCR-amplificatie genspecifieke primers; hier coderend voor de sequentie van een thaumatine-achtig eiwit (TLP) (forward: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', reverse: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>Verzamel 1-5 klieren in een PCR-buisje dat 10 μl nuclease-vrij water bevat. Voeg voor een 50 μl reactie 5 μl van 10x Taq buffer, 1 μl 10 mM deoxynucleosidetrifosfaten (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) Taq DNA-polymerase, 1 μl (100 pmol) van elke primer en 28,6 μl nuclease-vrij water toe.</li>
		<li>Voer PCR-reacties uit in een thermocycler met het volgende programma: initiële denaturatie 94 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van denaturatie (94 ° C gedurende 30 sec), annealing (59 ° C gedurende 30 sec) en extensie (72 ° C gedurende 1 min); en een laatste extensie van 10 min bij 72 ° C.</li>
		<li>Bewijs de amplificatie van het PCR-product door middel van agarosegelelektroforese. Gebruik daarvoor 1,5% (w/v) agarose en los het op in 1x TAE (40 mM Tris-base, 20 mM glazuur azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 8) buffer. Verwarm de oplossing in een magnetron totdat de agarose is opgelost. Voeg 100 ml agarose-oplossing toe aan 1 μl etidiumbromide (10 μg/μl) voor downstream-visualisatie. Laat de gel draaien in 1x TAE-buffer bij 300 V, 115 mA gedurende ongeveer 20 min in een elektroforesekamer. De juiste

<ol><li>Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glands+of+carnivorous+plants+as+a+model+system+in+cell+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Bot.+Gall%22%5BJournal%5D)">Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research.</a> Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).</li>
<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22Insectivorous+plants%22">Insectivorous plants</a>. , John Murray. London. (1875).</li>
<li>Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnivorous+pitcher+plants%3A+Insights+in+an+old+topic%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic.</a> Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).</li>
<li>Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+nutrient+transport+in+the+pitchers+of+the+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nepenthes+alata+Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant.</a> Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).</li>
<li>Brandt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+gene+expression+analysis+at+the+tissue-specific+and+single-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels.</a> J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).</li>
<li>Hölscher, D., Schneider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+laser-assisted+microdissection+for+tissue+and+cell-specific+analysis+of+RNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Bot%22%5BJournal%5D)">Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites.</a> Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).</li>
<li>Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropreparation+of+single+secretory+glands+from+the+carnivorous+plant+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes.</a> Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).</li>
<li>Liu, W. H., Saint, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+quantitative+method+of+real+time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+based+on+simulation+of+polymerase+chain+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics.</a> Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).</li>
<li>Werker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichome+diversity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Trichome diversity and development.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).</li>
<li>Fahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+secretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of secretory cells.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).</li>
<li>Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuniper%2C+BE+%22The+carnivorous+plants%22">The carnivorous plants</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory-cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic-studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products.</a> Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).</li>
<li>Rontein, D., Onillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP725A4+from+yew+catalyzes+complex+structural+rearrangement+of+taxa-4%285%29%2C11%2812%29-diene+into+the+cyclic+ether+5%2812%29-oxa-3%2811%29-cyclotaxane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane.</a> J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).</li>
<li>Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+science%3F+Engineering+of+terpenoid+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants.</a> Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plant+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of plant-insect interactions.</a> Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).</li>
<li>Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+pests%2C+parasitoids%2C+and+predators%3A+Tritrophic+interactions+involving+the+genus+Lycopersicon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon.</a> Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defense+against+herbivores%3A+Chemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant defense against herbivores: Chemical aspects.</a> Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).</li>
<li>Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+class+III+acid+endochitinase+from+the+traps+of+the+carnivorous+pitcher+plant+genus%2C+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes.</a> J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Lange tijd zijn studies van secretoire structuren van planten, met name trichomen, in wezen anatomisch uitgevoerd en puur beschrijvend geweest. Er is een grote hoeveelheid publicaties van dit type, zoals samengevat in reviews door9-11. Onze biochemische en moleculaire kennis van secretoire structuren van planten is nog steeds beperkt ondanks enkele vroege opmerkelijke werken bijv. over klierenharen van munt die aantonen dat klierharen de plaats zijn van biosynthese van monoterpenoïden die in de subcut...

Planten produceren een enorme verscheidenheid aan verbindingen met verschillende industriële en farmaceutische toepassingen, variërend van moleculen met een laag molecuulgewicht tot polymeren. Dergelijke verbindingen worden vaak geproduceerd en uitgescheiden door zeer gespecialiseerde structuren, waarvan er veel aan het oppervlak van de planten gelokaliseerd zijn, zoals kliertrichomen of nectariën, of intern, zoals respectievelijk idioblasten of latex- en harskanalen. Er is echter relatief weinig bekend over de biologie van deze gespecialiseerde secretorische structuren, hoewel alle typen van deze klieren kenmerken vertonen die wijzen op een actief metabolisme. In het bijzonder kunnen klieren van vleesetende planten zoals Nepenthes worden beschouwd als modelsystemen in de plantencelbiologie1.
Vleesetende planten zijn het onderwerp van verschillende studies sinds 1875, toen het werk 'Insectivorous Plants' van Charles Darwin werd gepubliceerd2. Echter is onderzoek op moleculair niveau pas in de afgelopen jaren uitgevoerd en onze kennis is nog steeds beperkt. Zo is bijvoorbeeld de eiwitsamenstelling van het spijsverteringssap in de kannenplanten van het geslacht Nepenthes nog steeds niet volledig bekend. Pas onlangs zijn verschillende hydrolytische eiwitten en een aantal van de bijbehorende genen geïdentificeerd3. In de valkuilen van Nepenthes (Figuur 1), bevinden zich meercellige klieren aan de binnenzijde van de bodem van de kannen. Deze klieren verzorgen zowel de productie en secretie van de spijsverteringsenzymen in het kannenvloeistof als de absorptie van opgeloste voedingsstoffen uit deze vloeistof4. Bijgevolg vormen deze bifunctionele klieren een uniek microweefsel met een centrale positie en functie in de carnivorie van Nepenthes dat nadere bestudering verdient.
<img alt="Anatomie van vleesetende planten, detail van een Nepenthes-beker, botanische studie, valmechanisme, adaptatie." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Nepenthes alata beker. Het onderste deel van de beker bevat de verteringsvloeistof en klieren aan de binnenzijde.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
In de plantwetenschappen zijn veel experimentele benaderingen afhankelijk van 'bulkmateriaal' omdat er geen specifiek weefsel wordt onderzocht, maar volledige organen. Bijgevolg kunnen hun homogenisatie en analyse alleen resultaten opleveren die verdund zijn en proportioneel staan tot individuele weefsels en cellen5. Om dit probleem op te lossen, zijn micropreparatietechnieken ontwikkeld, zoals de zogenaamde laser capture microdissectie (LCM), die succesvol worden gebruikt om specifieke plantenweefsels te oogsten en hun individuele inhoud te analyseren6. LCM is echter vaak beperkt wanneer onstabiele en/of snel degraderende celcomponenten, zoals RNA, het doel zijn. In dergelijke gevallen is de noodzaak van voorafgaande weefselfixatie, wat tijdrovend is en vaak gepaard gaat met degradatie van biomoleculen, een nadeel. Bovendien faalde LCM vaak bij preparatie direct vanuit vers weefsel vanwege het hoge watergehalte van veel plantenweefsels en de stevigheid van de celwanden7. Elke benadering om cellulaire componenten te onderzoeken die aanwezig zijn in secretorische klieren — van genen, mRNA en eiwitten tot secundaire verbindingen en hun biosynthese — vereist alternatieve technieken voor de specifieke preparatie. Daarom zijn specifieke technieken noodzakelijk om individuele cellen of zelfs meercellige klieren te isoleren die na preparatie intact blijven.
Hier wordt een methode gepresenteerd die gebruikmaakt van een gemechaniseerd microsampling-platform met directe microscopische visualisatie. Deze techniek is zowel snel als efficiënt bij de preparatie van individuele klieren uit de kannen van Nepenthes-soorten. Deze meercellige klieren zijn bifunctioneel, i.e. ze zijn betrokken bij zowel secretie- als opnameprocessen, ze zijn sessiel, en niet-blootgestelde cellagen zijn geïmpregneerd om een endodermis te vormen. Volledige klieren kunnen worden geïsoleerd zonder omliggend weefsel en op een gedefinieerde manier in een PCR-buis worden geplaatst. Deze techniek wordt toegepast om specifieke genen en genexpressie in de weefsels van de klieren te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>AM1931</td><td>Isolation van totaal RNA, 50 samples</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis System</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>18080-200</td><td>25 reacties</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>10777-019</td><td>Rnase remmer, 5.000 eenheden</td></tr><tr><td>Random Hexamers (0,4 &mu;g/µl)</td><td>QIAGEN GmbH, Germany</td><td>79236</td><td>100 µl</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, moleculaire biologie kwaliteit</td><td>Fermentas GmbH, Germany</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase, (recombinant)</td><td>Fermentas GmbH, Germany</td><td>EP0402</td><td>Wordt geleverd met 10x Taq buffer (met KCl of (NH4)2SO4) en 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>AM2238</td><td>1.000 eenheden</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA ladder, gebruiksklaar</td><td>Fermentas GmbH, Germany</td><td>SM1193</td><td>50 µg</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., USA</td><td>600828</td><td>Enkel kit</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Razorblad</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue spectrofotometer</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Germany</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Real-Time PCR System</td><td>Stratagene, USA</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standard Horizontal Gel Electroforese Chamber</td><td>Biometra</td><td>Uit productie</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka</td><td>Uitgerust met een microforceps</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>Uitgerust met een AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar Filter set 01</td><td>Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany</td><td>485001-0000-000</td><td>UV filter</td></tr><tr><td>Lumar Filter set 09</td><td>Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany</td><td>485009-0000-000</td><td>non-UV filter</td></tr></tbody></table>

isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Veel planten bezitten gespecialiseerde structuren die betrokken zijn bij de productie en secretie van specifieke verbindingen en eiwitten met een laag moleculair gewicht. Deze structuren zijn bijna altijd gelokaliseerd op plantoppervlakken. Hieronder vallen nectaries of klierharen. De uitgescheiden verbindingen worden vaak gebruikt in interacties met de biotische omgeving, bijvoorbeeld als aantrekkingsmiddelen voor bestuivers of als afschrikmiddelen tegen herbivoren.
Klieren die in verschillende opzichten uniek zijn, zijn te vinden in vleesetende planten. In de zogenaamde bekerplanten van het geslacht Nepenthe scheiden bifunctionele klieren in de valkuil aan de ene kant het spijsverteringsvocht af, inclusief alle enzymen die nodig zijn voor de vertering van prooien, en nemen aan de andere kant de vrijgekomen voedingsstoffen op. Dergelijke klieren vormen dus een ideaal, gespecialiseerd weefsel dat zich leent voor het bestuderen van de onderliggende moleculaire, biochemische en fysiologische mechanismen van eiwitsecretie en voedingsopname bij planten. Bovendien zou de biosynthese van secundaire verbindingen geproduceerd door veel planten uitgerust met klierstructuren direct in klieren kunnen worden onderzocht.
Om aan dergelijke gespecialiseerde structuren te kunnen werken, moeten ze efficiënt, snel, metabolisch actief en zonder besmetting met andere weefsels worden geïsoleerd. Daarom werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld en toegepast voor studies naar Nepenthes spijsverteringsvloeistof. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat werd gebruikt om met succes enkele bifunctionele klieren uit Nepenthes-vallen te bereiden, op basis van een gemechaniseerd microsamplingplatform. De klieren konden worden geïsoleerd en direct worden gebruikt voor genexpressieanalyse door PCR-technieken na bereiding van RNA.

Voor de preparatie van individuele klieren uit Nepenthes pitcher-weefsel is een gemechaniseerde microdissectietechniek ontwikkeld en toegepast. Het micropreparatieplatform moet worden uitgerust met microforceps, bevestigd aan de micromanipulator, die op hun beurt worden bediend via een bedieningspaneel. Individuele klieren, zichtbaar onder de microscoop, konden worden getarget met de forceps, waarmee het klierweefsel werd gegrepen en mechanisch verwijderd (Figuur 4A).
<p class="jove_content"...

Plantklieren zijn gespecialiseerde structuren die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese en secretie van veel verbindingen die betrokken zijn bij interacties met de biotische omgeving. Om studies naar hun moleculaire en biochemische kenmerken mogelijk te maken, werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld om enkele metabolisch actieve klieren te isoleren, hier van de vleesetende plant Nepenthes.

Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Het doel van de gepresenteerde methode is het verkrijgen van enkelvoudige en zuivere klieren uit vers plantweefsel voor moleculaire analyse. Dit wordt bereikt door eerst een kan uit de nepenthesplant te oogsten. Het weefsel wordt vervolgens direct op ijs gefixeerd op een micro-bemonsteringsplatform om het weefsel vers te houden.Tijdens de micro-bemonsteringsprocedure worden klieren op een precieze manier geïsoleerd en overgebracht naar de PCR-buis voordat een kwantitatieve PCR-analyse wordt uitgevoerd op het geoogste materiaal. Uiteindelijk wordt mechanische micro-bemonsteringstechnologie gebruikt om enkelvoudige en zuivere klieren van vleesetende planten te verkrijgen, om zo snel en micro-invasief specifiek weefsel te leveren voor verdere moleculaire analyse. Vleesetende planten zijn specialisten binnen de flora omdat ze in staat zijn om dierlijke eiwitten te verteren.Onze kennis over hoe dit op moleculair niveau werkt is nog beperkt. Een goed model om deze vraag te beantwoorden is het beeld van de genius-appendix, omdat deze over verschillende organen beschikt, beelden die klieren produceren die bijdragen aan deze verteringsprocessen. In de appendix.Deze klieren bevinden zich in de afbeeldingen onderaan. Voor moleculaire analyse is het noodzakelijk om deze brede en platte structuren, met een diameter van ongeveer 100 tot 200 micrometers, direct uit vers weefsel te isoleren. Wat het bemoeilijkt is dat de klieren bedekt zijn door een beschermende kap.Vanwege een structuur die vergelijkbaar is met een carport, waren driedimensionale waarnemingen tijdens de bemonstering noodzakelijk, evenals een instrument dat zich op een delicate wijze in drie dimensies kan bewegen. We stelden vast dat huidige microdissectietechnieken niet waren ontworpen om onze problemen op te lossen. Een laser faalde bijvoorbeeld vanwege het hoge watergehalte van het plantweefsel.Daarom hebben we besloten om een nieuwe mechanische microdissectietechniek genaamd aika te gebruiken, specifiek voor het isoleren van weefseldelen of zelfs individuele cellen uit 3D-structuren. Deze bestaat uit een stereo- of sum-microscoop waarin een 3D-micromanipulator zodanig is geïntegreerd dat deze eenvoudig zeer platte of zeer hoge objecten kan bereiken. Deze beweegt samen met de microscoop als een kolom om monsters te nemen; voor planten gebruiken we vaak microcapillairen.Echter, in het geval van appendixglas stelden we vast dat de door PTO aangestuurde microforceps effectiever werken voor onze procedure. Voor de appendix is het platform aangepast. Een kleine VXY-tafel ondersteunt een bekerglas gevuld met ijs dat groot genoeg is om zowel het weefselmonster met houder als de plek waar de klier geplaatst moet worden te bevatten.Het ijs zorgt ervoor dat de degradatieprocessen in het weefsel zodanig worden vertraagd dat het mogelijk is om de oorspronkelijke moleculaire staat van het weefsel te herkennen. De volgende procedure is vastgesteld op basis van het onderste gedeelte van een afbeelding. Er wordt een stukje van ongeveer één tot twee vierkante centimeter uitgesneden en vervolgens vlak gemaakt.Het weefsel wordt vervolgens met dubbelzijdige tape op een objectglas gefixeerd. Dit weefselmonster wordt bedekt met RNAse-vrij water en wordt gedurende het bemonsteringsproces vochtig gehouden. Het monster wordt vervolgens zo gepositioneerd dat de klieren en beschermkappen naar de zijde van de manipulator zijn gericht.De hoek tussen het monster en het instrument moet worden aangepast zodat de klieren plat liggen. Met behulp van een universele tafel kan de kanteling in twee assen worden ingesteld en eenvoudig onder de microscoop worden gecorrigeerd. De metalen tafel houdt het monster koel onder de microscoop.De klieren zijn duidelijk te onderscheiden. Fluorescentie helpt om de contour van zowel de klier als de beschermkap eenvoudig te herkennen. Het monster wordt waargenomen door een FSE-filter voor de isolatie van klieren.Voor RNA-extractie wordt een UV-filter gebruikt. Een zeer nauwkeurige positionering van de micropincet is essentieel voor de isolatie van de klier. Het wordt aanbevolen om het instrument in de lage snelheidstand te bedienen.Met de micro-pincet wordt een klier benaderd en worden de armen via de joystick op de randen geplaatst, waarna de micro-pincet voorzichtig wordt gesloten. De klier wordt vervolgens uit het omliggende weefsel getild. Na nauwkeurige isolatie is de intacte holte zichtbaar, waarbij het onderliggende vasculaire weefsel te zien is.De geïsoleerde klier wordt vervolgens overgebracht naar de PCR-buis en geplaatst in de voorbereide buffer. Om deze methode te valideren, werd de genexpressie van atoma leg protein short, TAP, dat wordt uitgescheiden in het vloeibare hars, bepaald; het gen kan direct vanuit de klieren worden geamplificeerd zonder voorafgaande extractie van genomisch DNA. Dit gebeurt simpelweg door de PCR-reactiemix toe te voegen aan het geïsoleerde weefsel.De reeks experimenten omvatte klieren van verschillend behandelde nepenthes-planten, evenals monsters van het omringende epidermale weefsel. Voor elk experiment werd totaal RNA geëxtraheerd. Het verkregen mRNA werd door middel van reverse transcriptie vertaald naar het overeenkomstige cDNA en gebruikt voor de daaropvolgende PCR-reactie.Om de gensequentie van belang te amplificeren, werd realtime PCR gebruikt om het TLP-expressieniveau in de klieren en epidermis van nepenthes te vergelijken. De resultaten tonen aan dat het TLP-transcriptieniveau in de secretoire klieren hoger is vergeleken met het epidermale weefsel in zowel nepenthes allotta als nepenthes miis, zoals gevisualiseerd door een ratio van epidermale weefsel ten opzichte van klierweefsel van minder dan één om te testen of contact met prooien genexpressie kon induceren. TLP-transcriptieniveaus en afbeeldingen van onbehandelde planten en planten die gevoed waren met drosophila melan gaster werden vergeleken na het vangen van prooien.Het epidermale weefsel vertoonde hier een hogere TLP-expressie. Het TLP-transcriptieniveau van klieren en epidermale weefsel en een behandelde afbeelding van nepenthes miis werden vergeleken. De opregulatie van de TLP-expressie in beide weefseltypen geeft aan dat de productie van pitcher-vloeistofeiwitten inderdaad door prooien kan worden geïnduceerd.De PCR-resultaten suggereren dat voeding de TLP-expressie in beide weefseltypen effectief verandert en de expressieverhouding tussen klier en epidermis kan verschuiven. We hebben een efficiënte methode ontwikkeld voor het oogsten van cleanse uit FA-appendixweefsel en een voldoende hoeveelheid mRNA geïsoleerd om genexpressie-experimenten uit te voeren. Met deze nieuwe methode die we hebben ontwikkeld, is het niet alleen mogelijk om transcriptomics in appendixklieren te bestuderen, maar kunnen we daarnaast ook metabolomics en proteomics onderzoeken.I.

isolation-viable-multicellular-glands-from-tissue-carnivorous-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Hier laten we zien ons protocol voor isolatie van basale en submucosale klier kanaal cellen van de muis luchtpijpen. We tonen ook aan de methode van het injecteren van stamcellen in het dorsale muis vetkussentje om een ​​te...

Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp

This video describes a method to isolate gastric epithelial cells from the human fundic tissue. The isolated epithelial cells can be used as an in vitro model to study their regulatory roles in gastric physiology and pathophysiology.

Gastric Fundic Glands Isolation: A Method to Isolate Fundic Glands from Human Stomach Tissue

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Uit stamcellen afgeleide culturen bevatten een enorm potentieel om infectieziekten te modelleren. Hier wordt de kweek van muis en menselijke gastrische organoïden, afgeleid van volwassen stamcellen, beschreven. De organoïden worden gemicro-injecteerd met het gastrische pathogeen Helicobacter pylori.

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Hier beschrijven we een protocol voor de vaststelling en het kweken van mens - en muis-afgeleide 3-dimensionale (3D) maag organoids, en de methode voor de overdracht van 3D organoids naar een 2-dimensionale enkelgelaagde. Het gebruik van de maag epitheliale enkelgelaagde als een roman kras-wond assay voor regeneratie studies wordt ook beschreven.

Muis en mens-afkomstige primaire maag epitheliale enkelgelaagde cultuur voor de studie van regeneratie

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Het protocol is gebaseerd op een droge, niet-bufferextractie van trichomen met alleen vloeibare stikstof, droogijs en nylonzeven en is geschikt voor RNA-extractie en transcriptomische analyse.

Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa

Leer een mechanische micropreparatietechniek om levensvatbare klieren te isoleren uit Nepenthes-weefsel. Deze methode maakt gedetailleerde moleculaire en biochemische analyse van deze gespecialiseerde structuren mogelijk.

Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes

Meer video's verkennen