Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes

Het doel van de gepresenteerde methode is het verkrijgen van enkelvoudige en zuivere klieren uit vers plantweefsel voor moleculaire analyse. Dit wordt bereikt door eerst een kan uit de nepenthesplant te oogsten. Het weefsel wordt vervolgens direct op ijs gefixeerd op een micro-bemonsteringsplatform om het weefsel vers te houden.

Tijdens de micro-bemonsteringsprocedure worden klieren op een precieze manier geïsoleerd en overgebracht naar de PCR-buis voordat een kwantitatieve PCR-analyse wordt uitgevoerd op het geoogste materiaal. Uiteindelijk wordt mechanische micro-bemonsteringstechnologie gebruikt om enkelvoudige en zuivere klieren van vleesetende planten te verkrijgen, om zo snel en micro-invasief specifiek weefsel te leveren voor verdere moleculaire analyse. Vleesetende planten zijn specialisten binnen de flora omdat ze in staat zijn om dierlijke eiwitten te verteren.

Onze kennis over hoe dit op moleculair niveau werkt is nog beperkt. Een goed model om deze vraag te beantwoorden is het beeld van de genius-appendix, omdat deze over verschillende organen beschikt, beelden die klieren produceren die bijdragen aan deze verteringsprocessen. In de appendix.

Deze klieren bevinden zich in de afbeeldingen onderaan. Voor moleculaire analyse is het noodzakelijk om deze brede en platte structuren, met een diameter van ongeveer 100 tot 200 micrometers, direct uit vers weefsel te isoleren. Wat het bemoeilijkt is dat de klieren bedekt zijn door een beschermende kap.

Vanwege een structuur die vergelijkbaar is met een carport, waren driedimensionale waarnemingen tijdens de bemonstering noodzakelijk, evenals een instrument dat zich op een delicate wijze in drie dimensies kan bewegen. We stelden vast dat huidige microdissectietechnieken niet waren ontworpen om onze problemen op te lossen. Een laser faalde bijvoorbeeld vanwege het hoge watergehalte van het plantweefsel.

Daarom hebben we besloten om een nieuwe mechanische microdissectietechniek genaamd aika te gebruiken, specifiek voor het isoleren van weefseldelen of zelfs individuele cellen uit 3D-structuren. Deze bestaat uit een stereo- of sum-microscoop waarin een 3D-micromanipulator zodanig is geïntegreerd dat deze eenvoudig zeer platte of zeer hoge objecten kan bereiken. Deze beweegt samen met de microscoop als een kolom om monsters te nemen; voor planten gebruiken we vaak microcapillairen.

Echter, in het geval van appendixglas stelden we vast dat de door PTO aangestuurde microforceps effectiever werken voor onze procedure. Voor de appendix is het platform aangepast. Een kleine VXY-tafel ondersteunt een bekerglas gevuld met ijs dat groot genoeg is om zowel het weefselmonster met houder als de plek waar de klier geplaatst moet worden te bevatten.

Het ijs zorgt ervoor dat de degradatieprocessen in het weefsel zodanig worden vertraagd dat het mogelijk is om de oorspronkelijke moleculaire staat van het weefsel te herkennen. De volgende procedure is vastgesteld op basis van het onderste gedeelte van een afbeelding. Er wordt een stukje van ongeveer één tot twee vierkante centimeter uitgesneden en vervolgens vlak gemaakt.

Het weefsel wordt vervolgens met dubbelzijdige tape op een objectglas gefixeerd. Dit weefselmonster wordt bedekt met RNAse-vrij water en wordt gedurende het bemonsteringsproces vochtig gehouden. Het monster wordt vervolgens zo gepositioneerd dat de klieren en beschermkappen naar de zijde van de manipulator zijn gericht.

De hoek tussen het monster en het instrument moet worden aangepast zodat de klieren plat liggen. Met behulp van een universele tafel kan de kanteling in twee assen worden ingesteld en eenvoudig onder de microscoop worden gecorrigeerd. De metalen tafel houdt het monster koel onder de microscoop.

De klieren zijn duidelijk te onderscheiden. Fluorescentie helpt om de contour van zowel de klier als de beschermkap eenvoudig te herkennen. Het monster wordt waargenomen door een FSE-filter voor de isolatie van klieren.

Voor RNA-extractie wordt een UV-filter gebruikt. Een zeer nauwkeurige positionering van de micropincet is essentieel voor de isolatie van de klier. Het wordt aanbevolen om het instrument in de lage snelheidstand te bedienen.

Met de micro-pincet wordt een klier benaderd en worden de armen via de joystick op de randen geplaatst, waarna de micro-pincet voorzichtig wordt gesloten. De klier wordt vervolgens uit het omliggende weefsel getild. Na nauwkeurige isolatie is de intacte holte zichtbaar, waarbij het onderliggende vasculaire weefsel te zien is.

De geïsoleerde klier wordt vervolgens overgebracht naar de PCR-buis en geplaatst in de voorbereide buffer. Om deze methode te valideren, werd de genexpressie van atoma leg protein short, TAP, dat wordt uitgescheiden in het vloeibare hars, bepaald; het gen kan direct vanuit de klieren worden geamplificeerd zonder voorafgaande extractie van genomisch DNA. Dit gebeurt simpelweg door de PCR-reactiemix toe te voegen aan het geïsoleerde weefsel.

De reeks experimenten omvatte klieren van verschillend behandelde nepenthes-planten, evenals monsters van het omringende epidermale weefsel. Voor elk experiment werd totaal RNA geëxtraheerd. Het verkregen mRNA werd door middel van reverse transcriptie vertaald naar het overeenkomstige cDNA en gebruikt voor de daaropvolgende PCR-reactie.

Om de gensequentie van belang te amplificeren, werd realtime PCR gebruikt om het TLP-expressieniveau in de klieren en epidermis van nepenthes te vergelijken. De resultaten tonen aan dat het TLP-transcriptieniveau in de secretoire klieren hoger is vergeleken met het epidermale weefsel in zowel nepenthes allotta als nepenthes miis, zoals gevisualiseerd door een ratio van epidermale weefsel ten opzichte van klierweefsel van minder dan één om te testen of contact met prooien genexpressie kon induceren. TLP-transcriptieniveaus en afbeeldingen van onbehandelde planten en planten die gevoed waren met drosophila melan gaster werden vergeleken na het vangen van prooien.

Het epidermale weefsel vertoonde hier een hogere TLP-expressie. Het TLP-transcriptieniveau van klieren en epidermale weefsel en een behandelde afbeelding van nepenthes miis werden vergeleken. De opregulatie van de TLP-expressie in beide weefseltypen geeft aan dat de productie van pitcher-vloeistofeiwitten inderdaad door prooien kan worden geïnduceerd.

De PCR-resultaten suggereren dat voeding de TLP-expressie in beide weefseltypen effectief verandert en de expressieverhouding tussen klier en epidermis kan verschuiven. We hebben een efficiënte methode ontwikkeld voor het oogsten van cleanse uit FA-appendixweefsel en een voldoende hoeveelheid mRNA geïsoleerd om genexpressie-experimenten uit te voeren. Met deze nieuwe methode die we hebben ontwikkeld, is het niet alleen mogelijk om transcriptomics in appendixklieren te bestuderen, maar kunnen we daarnaast ook metabolomics en proteomics onderzoeken.I.