Het beoordelen Myogene Response en vasoactiviteit In Resistance Mesenteriale slagaders behulp Pressure myography

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van een farmacologisch middel of een ziektebeeld op de door druk geïnduceerde vasculaire tonus in kleine resistentie-arteriën van het mesenterium te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de mesenteriale arcade te isoleren uit een muismodel. De tweede stap is het dissekeren van de kleine resistentie-arteriën van de vierde orde.

De volgende stappen zijn de canulatie, het onder druk zetten en de incubatie van het arteriële preparaat. In PSS is de laatste stap het beoordelen van de fysiologische integriteit van het arteriële preparaat, wat wordt aangetoond door de spontane ontwikkeling van vasculaire tonus en een passende reversibele respons op een vasoconstrictor en een vasodilator. Uiteindelijk kan de door druk geïnduceerde constrictie worden gemeten.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van hypertensie, hypotensie of vasculaire dysfunctie. Deze techniek identificeert namelijk belangrijke mechanismen die ten grond liggen aan door druk geïnduceerde veranderingen in de vasculaire tonus, wat een cruciale determinant is voor de vasculaire weerstand, perfusie en bloeddruk. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Jja, postdoctoraal onderzoeker in ons laboratorium.

Begin deze procedure door een glazen canule in een micropipethouder te plaatsen en de micropipethouder aan een perfusiekamer te bevestigen om de perfusiekamer voor te bereiden. Spoel deze eerst vijf minuten met Milli Q-water en vervolgens vijf minuten met dissectie-oplossing. Vul de kamer daarna met twee milliliters dissectie-oplossing.

Vul vervolgens voorzichtig de gehele canule en de bijbehorende slang, zonder luchtbellen te vormen. Bereid onder de dissectiemicroscoop met stompe pincetten twee hechtingen voor, elk met een halve knoop. Gebruik dissectiepincetten om beide canules te laden met gedeeltelijk gesloten hechtknopen, net verwijderd van de punt.

Voer vervolgens een mediane laparotomie uit bij een geanestheseerde rat, van het bekken tot aan het borstbeen, door eerst een incisie in de huid te maken en vervolgens een incisie in de onderliggende spierlaag. Er moet zorgvuldig worden gewerkt om beschadiging van de intra-abdominale organen te voorkomen. Bind beide uiteinden afzonderlijk af om lekkage van chymus en feces te voorkomen, teneinde contaminatie van de extracellulaire badoplossing te vermijden.

Snijd vervolgens het proximale uiteinde van de darm vlakbij de poriën en het distale uiteinde vlakbij de ileocecale overgang af. Maak daarna een incisie in het mesenterium aan de basis nabij de voedende vaatstructuren. Verplaats vervolgens het gehele mesenteriale bed van de dunne darm naar een bekerglas van 50 milliliter met ijskoude dissectie-oplossing en incubeer dit gedurende vijf minuten.

Spoel het vervolgens met verse dissectie-oplossing om het bloed te verwijderen. Zet nu het proximale uiteinde van de darm aan de rechterkant vast met spelden in een schaal met sard, en spreid de resterende darm in een tegenwijzerse richting uit. Zet het segment vast om het mesenterium te spreiden en de bloedvaten bloot te leggen onder een stereozoommicroscoop.

Dissecteer de kleine mesenteriale arteriën van de derde en vierde orde parallel aan de dunne darm door eerst al het omhullende vet nabij de vertakking van de tweede orde te verwijderen. Dissecteer vervolgens de vene weg en isoleer de arterie met een V-vormig vertakkingspunt. Wees voorzichtig om het geselecteerde segment niet te perforeren.

Isoleer vervolgens een sectie van vier tot vijf millimeter van de slagader die parallel loopt aan de dunne darm. Knip alle vertakkingen van de vijfde orde die in de dunne darm ingebed zijn iets verwijderd van de oorsprong van de vertakkingen door en bewaar een gedeelte hiervan. Deze gedeelten zullen dienen als bevestigingspunten voor het overbrengen van arteriële segmenten naar een perfusiekamer en zullen vervolgens de canulatie ervan begeleiden.

Snijd vervolgens de arteriële segmenten door aan weerszijden van de arterie twee incisies te maken distaal van de vertakkingen van de vijfde orde en breng deze over naar de perfusiekamer. Cannuleer één uiteinde van de vaten op een glazen micropipet door de punt van het arteriële segment met dissectiepincetten vast te houden. Schuif de eerder geladen, gedeeltelijk gesloten hechting over het gecannuleerde uiteinde en zet deze vast.

Bevestig vervolgens een met dissectie-oplossing gevulde spuit van 10 milliliter aan de stopkraan die aan deze canule is verbonden. Til de spuit voorzichtig op. De zwaartekracht op de oplossing zal het intravasculaire bloed uit het open uiteinde van het vat verwijderen.

Sluit de stopkraan na het verwijderen van het intra-arteriële bloed. Bind nu het distale uiteinde van de vaten vast aan een tweede glazen canule door de andere canule zo dicht mogelijk bij het ongebonden uiteinde van het arteriële segment te brengen. Schuif de eerder geladen, gedeeltelijk gesloten hechting over het gecanuleerde uiteinde en zet deze vast.

Er moet zorgvuldig worden gewerkt om te voorkomen dat er aan de arteriële segmenten wordt getrokken, en er moet worden gecontroleerd of de stopkranen die aan beide canules zijn bevestigd, gesloten zijn. Verplaats de perfusiekamer naar de tafel van de omgekeerde microscoop die is uitgerust met live videoregistratie. Sluit vervolgens de stopkraan van de canule die aan het proximale uiteinde van het arteriële segment is bevestigd, aan op een servo-gestuurd drukregelsysteem.

Zorg ervoor dat de stopkraan die aan de andere canule is bevestigd gesloten blijft om een stabiele intraluminale druk te handhaven. Bevestig vervolgens de vacuümslang aan de perfusieslang en de zuigpoort aan de perfusiepoort van de kamer. Start de perfusie van het vat met warme PSS via de enkele inline vloeistofverwarmer met een snelheid van 2 mL per minuut.

Zet met behulp van een peristaltische pomp het vacuüm aan zodra de temperatuur van de PSS in de kamer dicht bij 37 °C ligt. Verhoog de intraluminale druk langzaam van 20 naar 100 mmHg. Controleer het vat op lekken door gebruik te maken van de automatische drukinstelling van de drukregelaar.

Beoordeel daarna het arteriële segment op knikken terwijl de druk op 100 millimeter kwik wordt gehouden. Beweeg de canule met de schroefhendel om het arteriële segment recht te trekken en rek de arteriële segmenten niet te ver uit. Verlaag vervolgens de druk naar 70 millimeter kwik om de in vivo druk in de mesenteriale arcade na te bootsen, en laat het arteriële segment stabiliseren en myogene tonus ontwikkelen.

Bekijk in deze procedure de slagader met een 10 x objectief onder een microscoop die is uitgerust met een monochrome videocamera. Koppel de camera aan het apparaat. Meet de luminale diameter met behulp van een video frame grabber en een real-time systeem voor randdetectie.

Noteer vervolgens de diameter van het vat en volg de ontwikkeling van de myogene tonus. Verlaag daarna de druk naar 20 millimeters kwik en laat de diameter stabiliseren. Verhoog vervolgens de intraluminale druk in stappen van bijvoorbeeld 20, 40, 60, 80 en 100, en laat de arterie bij elke druk een stabiele diameter bereiken.

Herhaal vervolgens de drukstaprespons in calciumvrije PSS bevatttend 0,39 millimolair EGTA en 0,1 millimolair natriumnitroprusside; zoals aangegeven door de registratie neemt de diameter van de kleine mesenteriale arteriën van ratten spontaan af wanneer deze worden ondergezet op een druk van 70 millimeters kwik. De toevoeging van één micromolair acetylcholine verhoogde de diameter tot bijna de beginwaarde. De toevoeging van één micromolair fenylefrine aan het weefselbad verkleinde de arteriële diameter, en deze figuur laat zien dat incubatie van de kleine mesenteriale arteriën in calciumvrije PSS de arteriële diameter vergroot. De diameter van een enkel onder druk gezet arterieel segment bij verschillende perfusiedrukken wordt in deze tabel weergegeven.

Hier wordt de arteriële diameter continu geregistreerd terwijl de intraluminale druk stapsgewijs wordt verhoogd in aanwezigheid van PSS en calciumvrije PSS. Hier zijn de curven van de arteriële diameter die bij elke drukstap zijn bereikt, en de staafgrafiek van de myogene tonus die bij elke drukstap is bereikt, wordt hier getoond Off. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het myogene gedrag van kleine resistentiearteriën kan worden beoordeeld.

Na deze techniek kunnen aanvullende procedures worden uitgevoerd, zoals endotheliale disruptie en arteriële permeatie. Beide procedures kunnen verdere vragen beantwoorden over de rol van het endotheel en calcium bij de regulatie van de vasculaire tonus van kleine resistentie-arteriën.