Kenmerken van neerslag gevormde Polyethyleen Glycol Microgels worden gecontroleerd door Moleculair gewicht van de reactanten

Het algemene doel van deze procedure is het vormen van polyethyleenglycol-microgels met behulp van een fotogepolymeriseerde precipitatiereactie, om deze te gebruiken als drug-delivery-voertuigen en scaffolds voor weefselengineering. Dit wordt bereikt door eerst de reagentia voor te bereiden, waaronder een foto-initiator, buffers, triethylamine en een PEG DL-oplossing, en deze op te warmen tot 37 °C. De tweede stap bestaat uit het plaatsen van de reagentia in een microcentrifugebuis en het vortexen hiervan terwijl een temperatuur van 37 °C wordt gehandhaafd.

Vervolgens wordt natriumsulfaat erbij gemengd en wordt de oplossing 30 seconden onder UV-licht geplaatst om cross-linking te induceren. Na de cross-linking vormt zich aan de oppervlakte van de oplossing een troebele laag die de microgels bevat. De laatste stap is het toevoegen van PBS aan het mengsel en het centrifugeren om een pellet te vormen.

Uiteindelijk worden microscopie en dynamische lichtverstrooiing gebruikt om de grootte van de microgels te meten, en wordt de dichtheid gemeten met behulp van een dextrine-dichtheidsgradiënt. Daarnaast wordt de mate van zwelling berekend door het natte en droge gewicht van de microgels te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals emulsie-, suspensie- en dispersietechnieken, is dat microgels die door precipitatiereactie zijn gevormd een lage polydispersiteitsindex hebben zonder het gebruik van organische oplosmiddelen of stabilisatoren; de milde omstandigheden van de precipitatiereactie, de aanpasbare eigenschappen van de microgels en de lage viscositeit voor injecties maken ze geschikt voor NVivo-toepassingen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van weefseltechnologie en regeneratieve geneeskunde, zoals de fabricage van scaffolds met zowel een uniforme grootte als een lage polydispersiteitsindex. De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar therapieën voor geneesmiddelentoediening, omdat groeifactoren in medicijnen gemakkelijk kunnen worden ingekapseld. Begin met het afwegen van 500 milligrams van de foto-initiator en voeg dit toe aan 100 milliliters gedeïoniseerd water om een 0,5% oplossing te maken.

Bescherm de oplossing tegen UV-licht en verwarm deze tot 40 °C onder constant roeren gedurende ongeveer één uur om de foto-initiator volledig op te lossen. Nadat de oplossing volledig is opgelost, wordt deze steriel gefiltreerd door deze door een 0,22 micron filter te leiden en bewaard bij 4 °C in het donker tot gebruik. Verwarm vervolgens triethylamine voor tot 37 °C om de viscositeit te verlagen.

Voeg vervolgens 612 µL hiervan samen met 260 µL zes molaire zoutzuur toe aan 39,4 mL PBS en stel de pH steriel in op 7,8. Filtreer de uiteindelijke oplossing door een 0,22 µm filter en bewaar deze bij 37 °C tot gebruik. Volg het werk van Sony et al. voor de PEG-precursoren volgens de gepubliceerde methoden en bewaar het eindproduct bij -20 °C onder argon; bereid vervolgens vlak voor gebruik 1 mL van een 200 mg/mL PEG-diacrylaat-oplossing door langzaam 0,8 mL van de PBS met toegevoegde triethanolamine en zoutzuur toe te voegen aan 200 mg PEG-diacrylaat.

Weeg daarnaast, vlak voor het experiment, 213 milligram natriumsulfaat af en lossen dit op in één milliliter gedeïoniseerd water. Om een 1,5 molaire oplossing te bereiden, wordt de oplossing 20 minuten lang verhit tot 37 °C en vervolgens gevortext tot het volledig is opgelost. Zodra het is opgelost, worden zowel de uiteindelijke natriumsulfaatoplossing als de PEG-diacrylaatoplossing bij 37 °C gefiltreerd door 0,22 micron filters.

Combineer 127,5 µL PBS met triethylamine en zoutzuur, 10 µL van de 0,5% foto-initiator en 25 µL van de 200 mg/mL PEG-diacrylaatoplossing in een 1,6 mL microcentrifugebuisje. Voeg vervolgens de gewenste moleculen voor inkapseling toe.

Verwarm deze buisjes samen met de 1,5 molaire natriumsulfaatoplossing tot 37 °C. Voeg vervolgens 87,5 µL van de voorverwarmde 1,5 molaire natriumsulfaatoplossing toe aan het eerste buisje met de PEG-oplossing en meng de inhoud door de oplossing drie tot vijf keer te pipetteren. Na het mengen is de zoutconcentratie gelijkmatig verdeeld en moet de oplossing helder worden.

Plaats de buis onder het UV-licht en crosslink gedurende 30 seconden. Na het crosslinken moet er een troebele laag bovenop de oplossing met de microgels zichtbaar zijn. Voeg vervolgens 750 µL PBS toe aan de buis en meng de oplossing goed door te vortexen.

Centrifugeer het mengsel vervolgens bij 4.000 ×g gedurende twee minuten om een pellet te vormen. Verwijder na het centrifugeren het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat de pellet niet wordt verstoord, en suspendeer de microgels in verse PBS. Was de microgels in totaal vijf keer met verse PBS, waarbij ze tussen elke wasbeurt opnieuw worden gecentrifugeerd tot een pellet.

Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant en pipetteer 30 µL microgels vanuit het pellet in één milliliter gedeïoniseerd water. Sonicate vervolgens de microgeloplossing in een sonicatiebad gedurende één uur bij 50 tot 60 Hz en een vermogen van 1,4 A. Pipetteer daarna 15 µL van de microgeloplossing op een schone, zuuretsglazen objectglas en plaats hierop een zuuretsdekglaasje met nummer 1,5.

Keer het objectglas om op een laboratoriumdoekje en druk voorzichtig op het glas om overtollige vloeistof te verwijderen en ervoor te zorgen dat de microgels in een enkele laag liggen. Maak vervolgens met een optische microscoop meerdere afbeeldingen van de microgels met een DIC 100 x olie-objectief. Meet de microgels om een representatieve diameter te bepalen.

Bereken de polydispersiteitsindex met de hier getoonde volumegestuurde vergelijking, waarbij N het totale aantal microgels is en VI het volume van de microgel. Om de gemiddelde microgeldichtheid te meten, worden eerst dextrine-oplossingen bereid van 7, 6, 5, 4, 3 en 1% in gedeïoniseerd water; de dichtheden van de dextrine-oplossingen worden hier getoond. Voeg vervolgens twee milliliter van de 7% dextrine-oplossing toe aan een centrifugebuis van 15 milliliter.

Pipetteer vervolgens langzaam twee milliliters van de 6% dextrine-oplossing om een aparte laag bovenop de 7% dextrine te vormen. Voeg na vijf minuten twee milliliters van de volgende laag toe, bestaande uit 5% dextrine, en ga op deze manier verder tot elke concentratie dextrine in volgorde van afnemende dextrineconcentratie is gelaagd. Laag vervolgens voorzichtig de microgels boven de 1% dextrine-oplossing en centrifugeer de gradiënt bij vijf graden Celsius bij 4 000 ×g gedurende 10 minuten.

Visualise vervolgens de locatie van de microgels en bereken de dichtheid van de microgels op basis van hun positie tussen de lagen. Om de gezwollen massa van de microgels te meten, weegt u eerst een microcentrifugebuisje en voegt u daarna 1 mL van de microgels toe. Was de microgels vijf keer met gedeïoniseerd water, waarbij u tussen elke wasbeurt door spoelt.

Centrifugeer het monster 10 minuten bij 4,000 ×g om de microgels na de laatste wasbeurt te pelletteren. Resuspendeer deze in gedeïoniseerd water en laat ze minimaal 48 uur zwellen. Centrifugeer de gezwollen microgels na 48 uur 10 minuten bij 4,000 ×g en verwijder vervolgens al het supernatant.

Weeg vervolgens het monster en noteer de natte massa. Nadat een nauwkeurig nat gewicht is verkregen, worden de microgels bij minus 80 °C ingevroren en vervolgens gevriesdroogd om het water te verwijderen en de droge massa te bepalen. Zodra al het water is gesublimeerd, wordt het water- en polymeergehalte in de microgels berekend met behulp van de hier getoonde vergelijkingen, waarbij MS het natte gewicht van de microgels is en MD het droge gewicht.

De gemiddelde diameter van PEG-microgels gevormd met verschillende moleculaire gewichten van 20% PEG wordt hier getoond. Het verlengen van de UV-blootstellingstijd had eveneens een effect op de diameter van de microgels. Naarmate de UV-blootstellingstijd toenam, namen ook de diameters van de drie hier getoonde formuleringen toe.

De dichtheid, gemeten met dextrinegradiënten, nam af naarmate het molecuulgewicht van de precursor-peg-moleculen toenam. Dit wordt ook bevestigd in de grafiek van het waterpercentage, waar bleek dat peg met een hoger molecuulgewicht een hogere hoeveelheid water per gram polymeer bevat. Ten slotte, om aan te tonen dat de microgels geladen kunnen worden met fluorescent geconjugeerd eiwit, werd albumine aan het mengsel toegevoegd vóór de polymerisatie, waardoor het ingesloten raakte in de sferen.

Toenemende concentraties van het fluorescent gelabelde eiwit verhoogden de polydispersiteitsindex van de sferen, maar de gemiddelde grootte bleef constant. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle oplossingen te verwarmen tot 37 °C en de microgels goed te vortexen om eventuele aggregaten op te breken tijdens het wassen en het prepareren van de objectglazen voor beeldvorming. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden voor geneesmiddeleninkapseling worden uitgevoerd om verdere vragen te beantwoorden over het effect van de afgifte van het geneesmiddel.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u peg DA microgels kunt creëren onder milde omstandigheden via precipitatiereacties.