Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen
30 januari 2014
Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van corticale microglia uit muisneonaten. Dit wordt bereikt door eerst corticale hersenweefsels uit muisneonaten via microdissectie te verwijderen. De tweede stap is het kweken van gemengde gliale celculturen gedurende 17 tot 21 dagen in vitro.
Vervolgens worden de microglia geïsoleerd uit deze gemengde gliale culturen. De laatste stap is het uitplaten van de microgliacellen in celkweekplaten voor verdere experimenten. Tot slot worden immunofluorescentiemicroscopie en ELISA gebruikt om aan te tonen dat dit isolatieprotocol het immunofenotype en de functionaliteit van de microglia behoudt.
Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen bij microdissectie moeilijk uit te voeren zijn. Een succesvolle uitvoering van deze procedure vereist zowel snelheid als nauwkeurigheid. Te traag werken zal namelijk de celopbrengst verminderen, terwijl een onvolledige verwijdering van de meninges de gliale cultuur zal contamineren en de gliale groei zal belemmeren.
Begin met het bereiden van het complete medium voor microglia, hierna aangeduid als MCM. Bereid één kolf per pup voor en laat deze ten minste een uur incuberen. Deze equilibratiestap is essentieel voor het succes.
Bereid vervolgens de aliquots voor en koel deze op ijs. Aliquoteer voor alle benodigde media zes milliliter MCM per pup en verwarm dit in een waterbad van 37 °C voorafgaand aan de dissectie. Reinig het horizontale luchtstroomstation en de dissectiemicroscoop met 70% ethanol.
Plaats vervolgens de voor de procedure benodigde gesteriliseerde chirurgische instrumenten in het werkgebied. Bereid een steriele schaal voor met dissectiemedium om de kop op te vangen en een andere schaal voor de dissectie. Verdeel het medium voor het fijnhakken in een eigen schaal om het hersenweefsel fijn te hakken.
Plaats na de decapitatie en extractie van de hersenen de vers geïsoleerde hersenen onder een dissectiemicroscoop om de anatomische structuren te visualiseren, waarbij de dorsale zijde naar boven en droog moet blijven. Fixeer de hersenen door de punten van een pincet in de overgang tussen de middenhersenen en de cortex te plaatsen. Verwijder vervolgens volledig de dorsale corticale meninges.
Verwijder vervolgens de ventrale hersenvliezen om de zuiverheid en opbrengst van de microglia te maximaliseren. Het is essentieel om al het meningeaal weefsel volledig te verwijderen. Scheid de cortices van de rest van de hersenen.
Zorg ervoor dat alle resterende corticale hersenvliezen die zich aan de ventrale of mediale zijde van de cortices kunnen bevinden, worden verwijderd. Plaats de cortices, nadat het meningeaal weefsel is verwijderd, in de eerder voorbereide hakschaal. Gebruik een schaar om het hersenweefsel fijn te hakken in een biologische veiligheidskabinet klasse II.
Breng het fijngehakte weefsel over naar een conische buis van 15 millimeter. Spoel zowel de schaar als het hakschalletje af met telkens één milliliter hakmedium om de opbrengst te maximaliseren. Verzamel deze spoelvloeistoffen en voeg ze toe aan de conische buis van 15 milliliter met het fijngehakte weefsel.
Laat de weefselsuspensie één tot twee minuten ongestoord staan, zodat het fijngehakte weefsel naar de bodem van de buis kan zinken. Verwijder na deze tijd voorzichtig twee milliliters van het supernatant en gooi dit weg, waarbij u er zorg voor draagt dat het bezonken fijngehakte weefsel niet wordt verstoord. Voeg drie milliliters van het eerder verwarmde MCM toe aan het fijngehakte weefsel en tritureer het weefsel vervolgens krachtig.
Er mag geen waarneembaar vast weefsel overblijven wanneer het monsteren is voltooid. Voeg nog eens drie milliliter MCM toe met behulp van dezelfde pipetpunt om het resterende getritureerde monster uit de punt te verzamelen. Centrifugeer het fijngehakte weefsel na verzameling om de cellen te pelletteren.
Breng de gepellette cellen na voltooiing terug naar de biologische veiligheidskabinet. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi dit weg. Resuspendeer voorzichtig.
Resuspendeer de celpellet in twee milliliters warme MCM en voeg de celresuspensie vervolgens toe aan de eerder voorbereide kolf. Incubeer de cellen gedurende 24 uur. Tik na 24 uur voorzichtig met de kolf tegen de palm van de hand om het weefselresidu te verbreken.
Controleer de cellen vóór en na het tikken om er zeker van te zijn dat het debris volledig is verwijderd. Vervang vervolgens het medium door vers MCM en plaats de kolf terug in de incubator. Controleer de cellen dagelijks om de groei en contaminatie te monitoren.
Na ongeveer 17 tot 21 dagen zijn de microgliacellen klaar voor oogst; om te bepalen of de cellen gereed zijn, kunnen ze worden onderzocht onder een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop. Microglia zijn klaar voor oogst wanneer ze een confluentie van ongeveer 40% hebben bereikt, waarbij ze verschijnen als kleine, heldere sferische cellen die als een monolaag op elkaar groeien.
Om microglia te isoleren, wordt de kolf krachtig tegen de laboratoriumbank getikt. Deze agitatie helpt om microglia te scheiden van andere gliacellen vanwege de lage adhesie-eigenschappen van microglia. Seal de dopjes van de kolf met parafilm en roteer de gemengde gliaculturen gedurende vijf uur met een temperatuurgecontroleerde, niet-bevochtigde rotatieschudder.
Controleer na deze tijd visueel of de microglia van het flaskoppervlak zijn losgekomen. Onder een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop verschijnen microglia als heldere, sferische, vrijzwevende cellen. Er zal een residuele laag astrocyten en oligodendrocyten aan de bodem van de flask blijven adhereren.
Verzamel vervolgens het supernatant dat de microglia bevat in een steriele conische centrifugebuis en centrifugeer dit. Resuspendeer de microgliapellet in warm kweekmedium voor microglia en bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer. Zaai de cellen 24 uur later uit op een 24-wells plaat op plastic of steriele glazen dekglasjes.
Vervang het medium door vers, warm MGM om zwevende cellen en debris te verwijderen. Deze stap is cruciaal voor de overleving van de cellen en het behoud van quiescente microglia; de microglia-cellen zijn direct na deze her-voedingstap klaar voor experimenten om de zuiverheid van de microglia te beoordelen. Celculturen afgeleid van microglia die endogeen GFP tot expressie brachten, werden gekleurd voor het macrofaagantigeen IBA one en tegengekleurd met dapi.
Om de celkern te visualiseren, vertoonden meer dan 95% van de cellen colocalisatie van GFP IBA1 en dpi. Na stimulatie van de cellen met LPS ondergingen de microglia een sterke morfologische verandering van een klein vertakt fenotype naar een ameboïde vorm. Immunocytochemische kleuring voor P65 toont aan dat P65 onder normale omstandigheden diffuus gelokaliseerd is in het cytoplasma.
Terwijl na een blootstelling van twee uur aan Pam P 65 de immunoreactiviteit drastisch verschoof naar de celkern om te bevestigen dat geïsoleerde microglia hun biochemische immunofunctionaliteit behielden. De secretie van het pro-inflammatoire cytokine TNF alpha werd bepaald na blootstelling aan PAM of LPS. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u corticale microglia isoleert uit pasgeboren muizen voor de beste resultaten.
Het is belangrijk om een steriele techniek te handhaven en om het meningeaal weefsel grondig te verwijderen uit de gedissecteerde corticale regio.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het isoleren van corticale microglia uit muisneonaten, waarbij de nadruk ligt op het belang van het behoud van de immunofunctie van microglia tijdens het proces. De isolatiemethode omvat het micro-dissecteren van hersenweefsel, het kweken van gemengde gliacellen en het vervolgens isoleren van microglia voor experimentele doeleinden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Microglia spelen een cruciale rol in het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Isolatiemethoden kunnen de functionaliteit van microgliacellen beïnvloeden.
- Het behoud van de immuunfunctie is essentieel voor accurate experimentele resultaten.
- Pro-inflammatoire stimuli worden gebruikt om de activatie van microglia te beoordelen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor het isoleren van microglia uit muisneonaten.
- Het waarborgen dat de geïsoleerde microglia hun immunofenotype en functionaliteit behouden.
- Het faciliteren van verdere experimenten naar de biologie van microglia.
Gebruikte methoden
- Microdissectie van corticaal hersenweefsel van muisneonaten.
- Kweek van gemengde gliacellen gedurende 17 tot 21 dagen in vitro.
- Isolatie van microglia uit gemengde gliacultures.
- Gebruik van immunofluorescentiemicroscopie en ELISA om de functionaliteit van microglia te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het isolatieprotocol levert zeer zuivere microgliaculturen op.
- Microglia behouden hun immunofunctionele kenmerken na isolatie.
- Activering met LPS en Pam 3 CSK 4 demonstreert de behouden functionaliteit.
- Fluorescente beeldvorming en immunocytochemie bevestigen de resultaten.
Conclusies
- De beschreven isolatiemethode is effectief voor het verkrijgen van functionele microglia.
- Het behoud van de immunofunctie is cruciaal voor het bestuderen van de biologie van microglia.
- Dit protocol kan worden toegepast op diverse experimentele opstellingen met microglia.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
De isolatie van functionele microglia uit muisneonaten maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij de validatie van neuro-immunologische targets door het immunofenotype en de respons op inflammatoire stimuli te behouden. Dit ex vivo model ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in de vroege ontdekkingsfase door rustende en geactiveerde toestanden te handhaven die relevant zijn voor ziektepaden van het centrale zenuwstelsel. De methode biedt een ziekterelevant systeem voor het screenen van immunomodulerende verbindingen en het beoordelen van target-interactie in preklinische workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar microgliële activatiepaden mogelijk via LPS- en Pam3CSK4-challenge-assays.
- Operationele waarde: Levert zeer zuivere corticale microglia met behoud van de NF-κB p65 nucleaire translocatie en TNF-α secretiefunctie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het testen van hypotheses over targets door het behoud van immunofenotypische getrouwheid van rustende naar pro-inflammatoire toestanden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd microgliamonolaagsysteem voor compound-screening na 17–21 dagen rijping van de gliacultuur.
- Operationele waarde: Maakt kwantificering van de microgliapuurheid mogelijk via IBA-1/GFP-colocalisatie (>95%) en functionele read-outs zoals cytokinerestractie.
- Klaarheid voor assay: Geïsoleerde microglia vertonen morfologische en functionele reacties op stimuli, wat betrouwbare dosis-responsmodellering mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Behoudt de microgliale functionaliteit ex vivo, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking naar preklinische validatie van neuro-inflammatoire targets.
- Mechanistische risicoreductie: Bewaart de biochemische functionaliteit (NF-κB-signalering, TNF-α-vrijgave) die cruciaal is voor het beoordelen van target-gemedieerde modulatie van pathways.
- Ziekterelevantie: Modelleert rustende en geactiveerde microgliatoestanden die toepasbaar zijn in onderzoek naar neurodegeneratieve en neuro-inflammatoire ziekten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De isolatiemethode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie door een reproduceerbaar microgliaplatvorm te bieden voor studies naar het werkingsmechanisme en fenotypische screening in de neuro-immunologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden via NF-κB-translocatie en cytokine-secretie-assays na immuunstimulatie.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door een consistente opbrengst, zuiverheid en functionele responsiviteit van microglia na isolatie met een rotatieschudder.
- Analytics: Genereert kwantitatieve afhankelijke variabelen, waaronder TNF-α-secretieniveaus en p65-nucleaire lokalisatie voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ex vivo microgliafunctie met in vivo relevantie door behoud van immunofenotype en activatiekinetiek.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor microglia-isolatie die toepasbaar is op meerdere validatiecampagnes voor CNS-doelen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door behoud van het microgliale immunofenotype en stimulus-responsieve functionaliteit.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde isolatie via mechanische agitatie levert reproduceerbare microgliaculturen op met >95% zuiverheid en functionele integriteit.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij neuro-immunologische screening door ex vivo microglia-gedrag te behouden dat indicatief is voor in vivo toestanden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende targets mogelijk op basis van gevalideerde target-interactie in functionele microglia-assays.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de dissectie van neonataal muisweefsel en steriele glia-kweektechnieken.
- Afhankelijk van een temperatuurgecontroleerde rotatorschudder en een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop voor de isolatie en verificatie van microglia.
- Standaardisatie van de verwijdering van de hersenvliezen en de kweekduur (17–21 dagen) tussen teams is noodzakelijk om de opbrengst en zuiverheid van de microglia te waarborgen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van de dissociatietijd en de adhesie-eigenschappen van de microglia vereisen.
- Praktische beperking: De opbrengst van microglia is afhankelijk van de volledige verwijdering van het weefsel van de hersenvliezen om contaminatie van de glia-kweek te voorkomen.
