Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen
30 januari 2014
Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).
Het algemene doel van deze procedure is om corticale microglia van muis-neonates te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst microscopisch de corticale hersenweefsels van Muur-neonates te verwijderen. De tweede stap is om gemengde gliacellenculturen 17 tot 21 dagen in vitro te laten groeien.
Vervolgens worden de microglia geïsoleerd uit deze gemengde gliacellenculturen. De laatste stap is om microgliale cellen in celcultuurplaten te plaatsen voor verder experimenteren. Uiteindelijk worden immunofluorescentiemicroscopie en Eliza gebruikt om te laten zien dat dit isolatieprotocol de microgliale immunofenotype en functionaliteit behoudt.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de SEP betrokken bij micro microdissectie moeilijk uit te voeren zijn. Succesvolle uitvoering van deze procedure vereist zowel snelheid als nauwkeurigheid. Dat wil zeggen, te langzaam zijn zal uw celopbrengst verminderen, terwijl onvolledige verwijdering van de hersenvliezen de gliacellencultuur zal besmetten en de gliacellengroei zal belemmeren.
Begin met het voorbereiden van het microglia complete media, hierna MCM genoemd. Bereid één flesje per pup voor en incubeer deze minimaal één uur. Deze gelijkmakingsstap is essentieel voor succes.
Bereid vervolgens een aliquot en koel op ijs. Alle benodigde media, zes milliliter MCM voor elke pup, en verwarm in een 37 graden Celsius waterbad voorafgaand aan de dissectie. Veeg de horizontale luchtstroomwerkplek en het dissectiemicroscoop af met 70%ethanol.
Plaats vervolgens de gesteriliseerde chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de procedure in het werkgebied. Bereid een steriele schaal met dissectie media voor om het hoofd vast te leggen en een andere voor de dissectie. Verdeel het snijmedia in een eigen schaal voor het snijden van het hersenweefsel.
Na het onthoofden en het uittrekken van de hersenen, plaats de vers geïsoleerde hersenen onder een dissectiemicroscoop om de hofjes te visualiseren, zorg ervoor dat de dorsale zijde omhoog en droog blijft. Bevestig de hersenen door de uiteinden van de forceps in het kruispunt van de middenhersenen en de cortex te steken. Eenmaal op zijn plaats, verwijder volledig de dorsale corticale hersenvliezen.
Verwijder vervolgens de ventrale hersenvliezen om de zuiverheid en opbrengst van de microglia te maximaliseren. Het is essentieel om alle hersenvliesweefsel volledig te verwijderen. Scheid de cortices van de rest van de hersenen.
Zorg ervoor dat alle resterende corticale hersenvliezen die mogelijk aanwezig zijn op de ventrale of mediale zijde van de cortices worden verwijderd. Met het hersenvliesweefsel verwijderd, plaats de cortices in de snijdis die eerder werd voorbereid. Werk in een biologisch veiligheidskabinet van klasse twee, gebruik schaar om het hersenweefsel te snijden.
Breng het gesneden weefsel over in een conische buis van 15 millimeter. Spoel zowel de schaar als de snijdis met één milliliter snijmedia om de opbrengst te maximaliseren. Verzamel en verdeel deze spoelingen in de 15 milliliter conische buis met het gesneden weefsel.
Laat de weefselsuspensie een tot twee minuten ongestoord staan, waardoor het gesneden weefsel zich op de bodem van de buis zal bezinken. Na deze tijd, verwijder en gooi voorzichtig twee milliliter van de supernatant weg, zorg ervoor dat het bezonken gesneden weefsel niet wordt verstoord. Voeg drie milliliter van het eerder verwarmde MCM toe aan het gesneden weefsel en tritur het weefsel krachtig.
Er mag geen herkenbaar vast weefsel meer overblijven wanneer tritur klaar is. Voeg nog eens drie milliliter MCM toe met behulp van dezelfde pipettetip om resterend tritureerd monster van de tip te verzamelen. Eenmaal verzameld, centrifugeer het gesneden weefsel om de cellen te pellen.
Wanneer dit voltooid is, breng de gepelletiseerde cellen terug naar het biologisch veiligheidskabinet. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant weg. Resus.
Suspensieer het cellenpellet met twee milliliter warm MCM en voeg vervolgens de celsuspensie toe aan de eerder voorbereide fles. Incubeer de cellen gedurende 24 uur. Na 24 uur, tik voorzichtig met de fles tegen de palm van de hand om het weefseldebris te verstoren.
Controleer de cellen voor en na het tikken om ervoor te zorgen dat het debris volledig is verwijderd. Vervolgens, vervang het media met vers MCM en plaats de fles terug in de incubator. Controleer de cellen dagelijks om de groei en besmetting te monitoren.
Na ongeveer 17 tot 21 dagen zullen microgliale cellen klaar zijn voor oogst om te bepalen of de cellen klaar zijn, bekijk ze onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Microglia zijn klaar voor oogst. Wanneer ze ongeveer 40%co fluentie hebben bereikt, zien ze eruit als kleine, heldere bolvormige cellen die als een monolaag op andere groeien.
Om te isoleren, tik microglië krachtdadig tegen de laboratoriumbank. Deze agitatie helpt om microglia van andere gliacellen te scheiden vanwege de lage hechtingseigenschappen van microglia. Verzegeld de flesdeksels met paraform en draai de gemengde gliacellenculturen gedurende vijf uur met een temperatuur gecontroleerde niet-bevochtigde roterende shaker.
Na deze tijd, inspecteer visueel of de microglia van de flesoppervlakte zijn opgetild. Met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop zijn microglia heldere bolvormige, vrij zwevende cellen. Er zal een resterende laag van astrocyten en oligodendrocyten aan de bodem van de fles hechten.
Verzamel vervolgens het supernatant dat de microglia bevat in een steriele conische centrifugeerbuis en palate.Resus. Suspensieer het microgliapellet in warm microglia-groeimedium en bepaal de celconcentratie met behulp van een hemo cytometer plaat. De cellen op een 24-welplate formaat op kunststof of steriele glazen dekseltjes 24 uur later.
Vervang het media met vers warm MGM om zwevende cellen en puin te verwijderen. Deze stap is cruciaal voor de overleving van de cellen en om kiemrustende microglia te behouden, zijn microgliacellen direct
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het isoleren van corticale microglia van muis-neonates, met nadruk op het belang van het behoud van de immunofunctie van microglia tijdens het proces. De isolatiemethode omvat micros-dissectie van hersenweefsel, het kweken van gemengde gliacellen en vervolgens het isoleren van microglia voor experimenten.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Microglia spelen een cruciale rol in het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Isolatiemethoden kunnen de functionaliteit van microgliacellen beïnvloeden.
- Het behoud van immunofunctie is essentieel voor nauwkeurige experimentele uitkomsten.
- Pro-inflammatoire stimuli worden gebruikt om microglia-activatie te beoordelen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het isoleren van microglia van muis-neonates.
- Om ervoor te zorgen dat geïsoleerde microglia hun immunofenotype en functionaliteit behouden.
- Om verder onderzoek naar microglia-biologie mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Micros-dissectie van corticaal hersenweefsel van muis-neonates.
- Kweek van gemengde gliacellen gedurende 17 tot 21 dagen in vitro.
- Isolatie van microglia uit gemengde gliacellenculturen.
- Gebruik van immunofluorescentiemicroscopie en ELISA om de microglia-functionaliteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het isolatieprotocol levert zeer zuivere microglia-culturen op.
- Microglia behouden immunofunctionele kenmerken na isolatie.
- Activering met LPS en Pam 3 CSK 4 toont behouden functionaliteit.
- Fluorescentiebeeldvorming en immunocytochemie bevestigen de resultaten.
Conclusies
- De beschreven isolatiemethode is effectief voor het verkrijgen van functionele microglia.
- Behoud van immunofunctie is cruciaal voor het bestuderen van microglia-biologie.
- Dit protocol kan worden toegepast op verschillende experimentele opstellingen met betrekking tot microglia.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
