Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in Streptococcus pneumoniae Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescente kleurstoffen te gebruiken om veranderingen in membraandynamiek en intracellulaire ionenconcentraties in een bacterieel systeem te monitoren. Dit wordt bereikt door bacteriën eerst tijdens hun groeifase te incuberen met de betreffende fluor totdat deze is geëquilibreerd over hun membranen. Vervolgens worden de bacteriën behandeld met de agent van keuze en wordt hun fluorescentie gemonitord.

De resultaten kunnen veranderingen in membraandepolarisatie, membraanintegriteit en intracellulaire ionenconcentraties laten zien op basis van de waargenomen veranderingen in fluorescentie van de indicatorkleurstoffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele elektrofysiologische technieken zoals patch clamping die wordt gebruikt in eukaryotische systemen, is dat veranderingen in membraandynamiek en intracellulaire ionenconcentraties nu kunnen worden gemonitord in bacteriën met behulp van fluorescentie. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat er enige inspanning nodig is om de kleurstofconcentraties te optimaliseren.

Laadcondities en detectie-instellingen Begin met bacteriële cellen. Eerst gepelleteerd in wasoplossing, suspendeer de pellet opnieuw in ten minste één milliliter PBS voor 100 miljoen CFU per milliliter, wat genoeg is voor vijf monsters. Breng een milliliter van de gewassen cellen over in een microcentrifugebuis en voeg 25 microliter van een een molaire filter toe.

Gesteriliseerde voorraadoplossing van glucose en vervolgens de cellen gedurende 15 minuten in een verwarmingsblok van 37 graden Celsius incuberen. De toegevoegde glucose kan variëren op basis van het experiment. Na 15 minuten, voeg vijf microliter van de 50 micromolar dieback en 10 microliter PI-oplossing toe.

Meng de cellen grondig door ze meerdere keren omhoog en omlaag te pipetteren. Verdeel vervolgens deze celsuspensie in vijf monsterputjes van een doorzichtige 96-putjesplaat. Laad de plaat in een voorverwarmde platereader ingesteld voor dieback NP-detectie.

Bewaak nu de dieback-equilibratie over de celmembranen door metingen te doen eens per minuut gedurende 30 tot 40 minuten totdat de lezingen zijn gestabiliseerd tot hun pre-behandelingswaarde. Ejecteer vervolgens de plaat en voeg het experimentele middel van keuze toe. Breng onmiddellijk de plaat terug naar de reader en blijf dieback en PI-fluorescentie gedurende de gewenste tijd monitoren.

Bij het voorbereiden van de laadbuffer voor deze procedure, zorg ervoor dat u deze kort door elkaar schudt voordat u PBS en Probenecid toevoegt. Voeg na het toevoegen van die oplossingen deze opnieuw door elkaar en wikkel deze in folie tot één milliliter van twee x celsuspensie. Voeg één milliliter van twee x laadbuffer toe.

Dit is genoeg voor 10 monsters. Incubeer het mengsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 75 minuten, beschermd tegen licht gedurende alle van deze assays. De concentratie van de kleurstof en de incubatietijd moeten mogelijk worden aangepast om de assay en de baseline fluorescentiedetectieniveau te optimaliseren, afhankelijk van de specifieke bacteriesoort en andere experimentele systeemgegevens.

Na de incubatie, was de cellen drie keer voor elke was. Pellet de cellen bij 2.400 Gs gedurende 10 minuten en suspendeer ze opnieuw in twee milliliter PBS met één x pronic. Na de drie wasbeurten, incubeer de cellen gedurende nog eens 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Dit maakt het mogelijk voor estro binnen de bacteriën om de estergroepen van de kleurstof te hydrolyseren, waardoor de kleurstof actief wordt binnen de cel. Vervolgens pellet, verwijder de cellen de snat en suspendeer ze opnieuw in twee milliliter PBS met één x Probenecid. Indien nodig kan nu glucose worden toegevoegd om de bacteriën opnieuw te energizeren. Laad 200 microliter van de cellen in één putje van een 96-putjesplaat voor elk monster en laad de plaat in een voorverwarmde reader in één monster.

Stel eerst een baseline lezing vast bij de juiste golflengten en bij een snelheid van één lezing per seconde gedurende één minuut. Vervolgens verwijder de plaat en voeg ongeveer vijf microliter van de behandeling van keuze toe. Om dat.

Stel snel enkele keren op en neer pijpetteer om de behandeling te mengen en breng de plaat onmiddellijk terug naar de reader. Blijf gedurende de gewenste tijd metingen doen. Om de gegevens te analyseren, bereken de verhouding van de fluorescentiewaarden voor elk tijdstip door waarde één door waarde twee te delen en plot de verhoudingswaarden op een grafiek.

Bij de voorbereiding, maak een reeks van vijf of zes hoge kaliumbuffers met pH-waarden van 6,5 tot 8,0. Gebruik zoals in de vorige procedure, een vortex om de twee x laadbuffer te bereiden vanuit een middenlogfasecultuurwas en concentreer de cellen. Vervolgens vervang de SNAT met twee milliliter BS om een vier x celsuspensie te maken.

Combineer één milliliter van de vier x celsuspensie met één milliliter van de twee x laadbuffer. Incubeer de cellen nu gedurende 40 minuten in een 30 graden Celsius waterbad. Bescherm het tegen licht.

Was nu de cellen drie keer. Pellet de cellen zoals eerder getoond. Voeg vier milliliter PBS met twee x prop Benin en één millimolair glucose terug en herhaal de centrifugatie na de drie wasbeurten.

Incubeer de cellen gedurende nog eens vijf minuten bij 37 graden Celsius. Om de achtergrondfluorescentiefilter te bepalen, steriliseer ongeveer 500 microliter van de geenergizede bacteriesuspensie om de bacteriën te verwijderen. Breng vervolgens 200 microliter van het filtraat over naar een 96-putjesplaat en meet de absorptie vanuit die putje gedurende een minuut.

Om een in vivo kalibratiecurve te verkrijgen, draai 500 microliter ALI watt van de geladen en geenergizede cellen en suspendeer ze. Suspendeer ze in een reeks hoge kaliumbuffers met verschillende pH tot elk monster, voeg 20 micromolair risin toe. Dit brengt de intracellulaire pH van de cellen in evenwicht met de pH van de omringende buffer.

Incubeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, breng