Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce
October 28th, 2013
Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.
Het algemene doel van deze procedure is om fibrine-gebaseerde constructen te creëren die kunnen worden gebruikt om cel- en collageenreorganisatie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst humane veneuze saphenous cellen te isoleren uit donorweefsel en deze uit te breiden in cultuur. De tweede stap is om Velcro-strips op flexibele membranen te plakken.
Aan de onderkant van zes putjesplaten om een vierkante ruimte in het midden te creëren, die het construct zal vasthouden. Vervolgens wordt een mengsel van fibrinogeen, trombine, cellen en fluorescent gelabelde kralen toegevoegd aan de ruimte tussen de Velcro-strips en wordt het toegestaan om te polymeriseren om een gel te vormen. De laatste stap is om de cellen te conditioneren en georiënteerde matrixvorming te induceren door het toepassen van een eenassige cyclische spanning op het construct of door statische spanning vrij te geven.
Door het fibrinegel van de Velcro-palen in één richting te trimmen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in cellulaire en collageenreorganisatie beschrijven door de constructen na verloop van tijd te monitoren met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het collageenremodelingsveld te beantwoorden met betrekking tot de snelheid van collageenvorming en heroriëntatie door verschillende celtypen.
Om te beginnen, verwerf menselijke donorweefsels van de veneuze saana magna in overeenstemming met richtlijnen voor het secundaire gebruik van materiaal. Vervolgens isoleer de humane veneuze saphenous cellen of H VSCs uit het weefsel door het protocol van Schnell et al te volgen, en bewaar ze in vloeibare stikstof. Wanneer nodig, breid cellen uit door één fles met 250.000 snel ontdooide H VSCs in een T 75 fles te plaatsen met 15 milliliter voorverwarmd groeimedium.
Medium bestaande uit 440 milliliter geavanceerd DMEM, 50 milliliter foetaal bovien serum. Vijf milliliter van 100 X pen strep en vijf milliliter van 200 millimolair L glut max. Ververs het groeimedium om de twee tot drie dagen gedurende ongeveer twee weken tot de cellen conflueert zijn.
Eenmaal conflueert, oogst en splits de cellen tot overgang.Negen. Gebruik trypsine totdat er een voldoende aantal cellen is voor het geplande experiment. Ongeveer 1,5 miljoen cellen zijn vereist voor elk construct.
Wanneer er een voldoende aantal cellen is gekweekt, oogst ze bij 90% co fluency en suspendeer vervolgens de cellen in groeimedium bij 15 miljoen cellen per milliliter. Plaats ze op ijs totdat ze nodig zijn. Bereid siliconenlijm voor door de elastomer en het hardingsmiddel in een verhouding van 10 tot één te mengen.
Gebruik deze lijm om zeven millimeter bij drie millimeter strips van de zachte kant van Velcro aan de flexibele membraan van flex cell platen te bevestigen. Om een kruisvorm met een open centrum te vormen, droog de siliconenlijm een nacht in een oven bij 60 graden Celsius om een verharding van de lijm te garanderen. Steriliseer vervolgens de plaat door vijf milliliter 70%ethanol toe te voegen aan elke put en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
Spui de putten drie keer met steriel PBS. Vervolgens verwijder de PBS uit de putten en de Velcro-strips. Plaats de plaat onbedekt onder de UV-lamp van een weefselkweekkap gedurende 30 minuten om de oppervlakken te steriliseren.
Eenmaal voltooid, dek de plaat af en bewaar het steriel tot gebruik. Bereid vervolgens weefselengineeringmedium voor door 130 milligram allicinezuur, twee fosfaat toe te voegen aan 500 milliliter groeimedium gedurende de eerste zeven dagen van de cultuur. Voeg ook één milligram per milliliter epsilon-aminocapronzuur toe om de afbraak van het fibrine te voorkomen, los fibrinogeen op tot een concentratie van 10 milligram daadwerkelijke eiwit per milliliter weefselengineering Medium aangevuld met aminocapronzuur door voorzichtig te mengen.
Vervolgens steriel. Filter de fibrinogenoplossing door een 0,22 micron spuitfilter en bewaar deze op ijs tot gebruik. Bereid vervolgens de trombineoplossing voor door stock trombine te verdunnen tot een eindconcentratie van 10 internationale eenheden per milliliter in weefselengineering medium aangevuld met aminocapronzuur en bewaar deze op ijs tot gebruik.
Plaats vervolgens 100 microliter van de eerder bereide celsuspensie in een microcentrifugebuis voor elk weefselconstruct dat zal worden gemaakt. Centrifugeer de cellen gedurende zeven minuten bij 350 keer G, en gooi vervolgens het supernatant weg, suspendeer de cellen in 50 microliter van de trombineoplossing en voeg vier microliter toe, een blauwe fluorescente polystyreen microsferen om als interne referentiemarkers te worden gebruikt. Trek vervolgens 50 microliter van de fibrinogenoplossing op in een pipettetip.
Verhoog het volume van de pipet tot 100 microliter en pipet vervolgens de 50 microliter oplossing van fibrinogeen in de centrifugeerbuis. Meng de trombine en fibrinogeen voorzichtig samen door de 100 microliter mengsel op te trekken om bubbeltjesvorming te voorkomen. Zodra de oplossing grondig is gemengd, pipet de gelmengsel in en tussen de Velcro-strips zo snel mogelijk, aangezien de typische geliatietijd voor de fibrinegels, eenmaal gemengd, op de orde van 20 seconden is, incubeer de constructen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een gebufferde incubator met 5% koolstofdioxide om ze te laten gelen.
Voeg vervolgens zes milliliter weefselengineering medium met aminocapronzuur toe aan elke put, en plaats de plaat terug in de incubator. Vervang het medium om de twee tot drie dagen gedurende de eerste zeven dagen. Na een week verwijdert u de aminocapronzuur supplement uit het medium en blijft u de gels cultiveren met het weefselengineering medium.
Laat nog steeds het medium om de twee tot drie dagen vervangen gedurende de eerste vijf dagen in cultuur, sta de constructen toe om te compacteren en te reorganiseren onder statische spanning, bi-axiaal vanwege de beperkingen van de vezels om collageenreorganisatie in één richting onder statische omstandigheden te induceren. Cultiveer eerst de cellen gedurende één extra week op dag 12, snijd het weefselconstruct los van twee Velcro-strips in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een modelsysteem dat gebruikmaakt van met myofibroblasten gevulde fibrinegels om de reorganisatie van collageen in real-time op een niet-destructieve manier te onderzoeken. Het systeem is aanpasbaar en laat variaties toe in celbronnen en medium-additieven om aan specifieke onderzoeksbehoeften te voldoen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Weefselengineering
- Collageenremodellering
Achtergrond
- Op fibrine gebaseerde constructen zijn waardevol voor het bestuderen van cel- en collageeninteracties.
- Inzicht in collageenreorganisatie is cruciaal voor inzichten in weefselreparatie en fibrose.
- Myofibroblasten spelen een belangrijke rol in collageenremodellering.
- Real-time monitoringtechnieken verbeteren de studie van dynamische biologische processen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het creëren van fibrineconstructen die het onderzoek naar collageenreorganisatie vergemakkelijken.
- Om de effecten van verschillende celtypen op collageenvorming en -oriëntatie te onderzoeken.
- Om een platform te bieden voor real-time observatie van cellulaire en collageendynamiek.
Gebruikte methoden
- Isolatie en cultivatie van humane veneuze safene cellen.
- Bereiding van fibrinegels met behulp van thrombine en fibrinogeen.
- Toepassing van cyclische of statische spanning om collageenreorganisatie te induceren.
- Monitoring van veranderingen met behulp van confocale microscopie in de tijd.
Belangrijkste resultaten
- De methode creëerde met succes fibrineconstructen die de studie van collageendynamiek mogelijk maakten.
- Real-time beeldvorming onthulde significante veranderingen in collageenoriëntatie en cellulair gedrag.
- Verschillende celtypen vertoonden verschillende effecten op de snelheid van collageenreorganisatie.
- Het systeem toonde het potentieel voor aangepaste experimenten op basis van specifieke onderzoeksvragen.
Conclusies
- Dit modelsysteem is een veelzijdig hulpmiddel voor het bestuderen van collageenremodellering.
- Bevindingen dragen bij aan een dieper begrip van weefselengineering en herstelmechanismen.
- De aanpak kan worden aangepast voor verschillende experimentele behoeften in het gebied van celbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This model system enables biopharma researchers to study collagen reorganization under controlled mechanical loading, supporting target validation in fibrosis and tissue repair. Real-time imaging of cellular and matrix dynamics provides quantitative readouts for mechanistic de-risking of anti-fibrotic candidates. The tunable platform facilitates assay development for screening compounds that modulate myofibroblast activity and collagen architecture.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on collagen remodeling pathways in fibrotic diseases.
- Operational Value: Enables biological de-risking by visualizing target engagement effects on matrix reorganization.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating compound effects with collagen alignment metrics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides standardized fibrin constructs for reproducible compound testing.
- Quantitative Outputs: Generates measurable collagen reorganization endpoints via time-lapse confocal imaging.
- Scalability: Adaptable construct size and strain parameters support medium-to-high throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human venous saphenous myofibroblast responses to mechanical strain, relevant to vascular fibrosis.
- Translational Continuity: Bridges discovery mechanisms to preclinical validation of anti-remodeling therapies.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on dose-dependent collagen alignment changes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling hypothesis testing, assay readiness, and data-driven advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mechanical stimuli to collagen reorganization dynamics.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducible quantitative matrix readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved collagen orientation and cellular tracking data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro remodeling observations to preclinical fibrosis models through conserved cellular mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying mechanosensitive targets across fibrosis indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in collagen remodeling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through constrained gel geometry and internal reference markers.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on matrix-level phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating dose-dependent collagen reorganization inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, fibrin gel preparation, and confocal microscopy.
- Needs access to Flexcell FX4000T strain application equipment and time-lapse imaging systems.
- Demands cross-team standardization for strain protocols, media conditions, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when translating findings from venous saphenous cells to other fibrosis-relevant myofibroblast sources.
- Practical limitations include gel compaction variability and the need for careful strain calibration to avoid construct detachment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Culture of Human Vena Saphena Cells
3:18
Engineering of Fibrin-based Tissue Constructs
7:23
Applying Strain and Inducing Changes in Stain and Constraints
9:25
Visualizing Cells and Collagen
10:43
Results: Changes in Cellular and Matrix Alignment Due to Controlled Strain
11:55
Conclusion
