Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce
28 oktober 2013
Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.
Het algemene doel van deze procedure is om fibrine-gebaseerde constructen te creëren die kunnen worden gebruikt om cel- en collageenreorganisatie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst humane veneuze saphenous cellen te isoleren uit donorweefsel en deze uit te breiden in cultuur. De tweede stap is om Velcro-strips op flexibele membranen te plakken.
Aan de onderkant van zes putjesplaten om een vierkante ruimte in het midden te creëren, die het construct zal vasthouden. Vervolgens wordt een mengsel van fibrinogeen, trombine, cellen en fluorescent gelabelde kralen toegevoegd aan de ruimte tussen de Velcro-strips en wordt het toegestaan om te polymeriseren om een gel te vormen. De laatste stap is om de cellen te conditioneren en georiënteerde matrixvorming te induceren door het toepassen van een eenassige cyclische spanning op het construct of door statische spanning vrij te geven.
Door het fibrinegel van de Velcro-palen in één richting te trimmen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in cellulaire en collageenreorganisatie beschrijven door de constructen na verloop van tijd te monitoren met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het collageenremodelingsveld te beantwoorden met betrekking tot de snelheid van collageenvorming en heroriëntatie door verschillende celtypen.
Om te beginnen, verwerf menselijke donorweefsels van de veneuze saana magna in overeenstemming met richtlijnen voor het secundaire gebruik van materiaal. Vervolgens isoleer de humane veneuze saphenous cellen of H VSCs uit het weefsel door het protocol van Schnell et al te volgen, en bewaar ze in vloeibare stikstof. Wanneer nodig, breid cellen uit door één fles met 250.000 snel ontdooide H VSCs in een T 75 fles te plaatsen met 15 milliliter voorverwarmd groeimedium.
Medium bestaande uit 440 milliliter geavanceerd DMEM, 50 milliliter foetaal bovien serum. Vijf milliliter van 100 X pen strep en vijf milliliter van 200 millimolair L glut max. Ververs het groeimedium om de twee tot drie dagen gedurende ongeveer twee weken tot de cellen conflueert zijn.
Eenmaal conflueert, oogst en splits de cellen tot overgang.Negen. Gebruik trypsine totdat er een voldoende aantal cellen is voor het geplande experiment. Ongeveer 1,5 miljoen cellen zijn vereist voor elk construct.
Wanneer er een voldoende aantal cellen is gekweekt, oogst ze bij 90% co fluency en suspendeer vervolgens de cellen in groeimedium bij 15 miljoen cellen per milliliter. Plaats ze op ijs totdat ze nodig zijn. Bereid siliconenlijm voor door de elastomer en het hardingsmiddel in een verhouding van 10 tot één te mengen.
Gebruik deze lijm om zeven millimeter bij drie millimeter strips van de zachte kant van Velcro aan de flexibele membraan van flex cell platen te bevestigen. Om een kruisvorm met een open centrum te vormen, droog de siliconenlijm een nacht in een oven bij 60 graden Celsius om een verharding van de lijm te garanderen. Steriliseer vervolgens de plaat door vijf milliliter 70%ethanol toe te voegen aan elke put en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
Spui de putten drie keer met steriel PBS. Vervolgens verwijder de PBS uit de putten en de Velcro-strips. Plaats de plaat onbedekt onder de UV-lamp van een weefselkweekkap gedurende 30 minuten om de oppervlakken te steriliseren.
Eenmaal voltooid, dek de plaat af en bewaar het steriel tot gebruik. Bereid vervolgens weefselengineeringmedium voor door 130 milligram allicinezuur, twee fosfaat toe te voegen aan 500 milliliter groeimedium gedurende de eerste zeven dagen van de cultuur. Voeg ook één milligram per milliliter epsilon-aminocapronzuur toe om de afbraak van het fibrine te voorkomen, los fibrinogeen op tot een concentratie van 10 milligram daadwerkelijke eiwit per milliliter weefselengineering Medium aangevuld met aminocapronzuur door voorzichtig te mengen.
Vervolgens steriel. Filter de fibrinogenoplossing door een 0,22 micron spuitfilter en bewaar deze op ijs tot gebruik. Bereid vervolgens de trombineoplossing voor door stock trombine te verdunnen tot een eindconcentratie van 10 internationale eenheden per milliliter in weefselengineering medium aangevuld met aminocapronzuur en bewaar deze op ijs tot gebruik.
Plaats vervolgens 100 microliter van de eerder bereide celsuspensie in een microcentrifugebuis voor elk weefselconstruct dat zal worden gemaakt. Centrifugeer de cellen gedurende zeven minuten bij 350 keer G, en gooi vervolgens het supernatant weg, suspendeer de cellen in 50 microliter van de trombineoplossing en voeg vier microliter toe, een blauwe fluorescente polystyreen microsferen om als interne referentiemarkers te worden gebruikt. Trek vervolgens 50 microliter van de fibrinogenoplossing op in een pipettetip.
Verhoog het volume van de pipet tot 100 microliter en pipet vervolgens de 50 microliter oplossing van fibrinogeen in de centrifugeerbuis. Meng de trombine en fibrinogeen voorzichtig samen door de 100 microliter mengsel op te trekken om bubbeltjesvorming te voorkomen. Zodra de oplossing grondig is gemengd, pipet de gelmengsel in en tussen de Velcro-strips zo snel mogelijk, aangezien de typische geliatietijd voor de fibrinegels, eenmaal gemengd, op de orde van 20 seconden is, incubeer de constructen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een gebufferde incubator met 5% koolstofdioxide om ze te laten gelen.
Voeg vervolgens zes milliliter weefselengineering medium met aminocapronzuur toe aan elke put, en plaats de plaat terug in de incubator. Vervang het medium om de twee tot drie dagen gedurende de eerste zeven dagen. Na een week verwijdert u de aminocapronzuur supplement uit het medium en blijft u de gels cultiveren met het weefselengineering medium.
Laat nog steeds het medium om de twee tot drie dagen vervangen gedurende de eerste vijf dagen in cultuur, sta de constructen toe om te compacteren en te reorganiseren onder statische spanning, bi-axiaal vanwege de beperkingen van de vezels om collageenreorganisatie in één richting onder statische omstandigheden te induceren. Cultiveer eerst de cellen gedurende één extra week op dag 12, snijd het weefselconstruct los van twee Velcro-strips in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een modelsysteem waarin gebruik wordt gemaakt van met myofibroblasten gepopuleerde fibrinegels om de reorganisatie van collageen in real-time en op een niet-destructieve wijze te onderzoeken. Het systeem is aanpasbaar, waardoor variaties in celbronnen en additieven in het medium mogelijk zijn om aan specifieke onderzoekbehoeften te voldoen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Weefseltechnologie
- Collageenremodellering
Achtergrond
- Op fibrine gebaseerde constructen zijn waardevol voor het bestuderen van interacties tussen cellen en collageen.
- Inzicht in collageenreorganisatie is essentieel voor het begrijpen van weefselherstel en fibrose.
- Myofibroblasten spelen een belangrijke rol bij de remodellering van collageen.
- Real-time monitoringtechnieken verbeteren de bestudering van dynamische biologische processen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het creëren van fibrineconstructen die de studie naar collageenreorganisatie faciliteren.
- Om de effecten van verschillende celtypen op de vorming en oriëntatie van collageen te onderzoeken.
- Om een platform te bieden voor real-time observatie van cellulaire en collageendynamiek.
Gebruikte methoden
- Isolatie en kweek van menselijke veneuze saphena-cellen.
- Bereiding van fibrinegels met behulp van trombine en fibrinogeen.
- Toepassing van cyclische of statische rek om collageenreorganisatie te induceren.
- Monitoring van veranderingen in de loop van de tijd middels confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- De methode heeft succesvol fibrineconstructen gecreëerd die de studie van collagedynamiek mogelijk maakten.
- Real-time imaging onthulde significante veranderingen in de collageenoriëntatie en het cellulaire gedrag.
- Verschillende celtypen vertoonden uiteenlopende effecten op de snelheid van de collageenreorganisatie.
- Het systeem demonstreerde het potentieel voor op maat gemaakte experimenten op basis van specifieke onderzoeksvragen.
Conclusies
- Dit modelsysteem is een veelzijdig instrument voor het bestuderen van collageenremodellering.
- De bevindingen dragen bij aan een dieper begrip van weefselengineering en herstelmechanismen.
- De aanpak kan worden aangepast aan diverse experimentele behoeften binnen het vakgebied van de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit modelsysteem stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om collageenreorganisatie onder gecontroleerde mechanische belasting te bestuderen, wat bijdraagt aan targetvalidatie bij fibrose en weefselherstel. Real-time imaging van cellulaire en matrixdynamiek biedt kwantitatieve read-outs voor mechanisch de-risking van antifibrotische kandidaten. Het instelbare platform faciliteert de ontwikkeling van assays voor het screenen van verbindingen die de myofibroblastactiviteit en de collageenarchitectuur moduleren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over collageenremodelleringspaden bij fibrotische ziekten.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door de effecten van target-engagement op matrixreorganisatie te visualiseren.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de prioritering van portfolio's door de effecten van verbindingen te correleren met metrieken voor collageenuitlijning.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Biedt gestandaardiseerde fibrineconstructen voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Kwantitatieve resultaten: Genereert meetbare eindpunten voor collageenreorganisatie via time-lapse confocale beeldvorming.
- Schaalbaarheid: Aanpasbare constructgrootte en rekparameters ondersteunen screening met een medium tot hoge doorvoer.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert de respons van menselijke myofibroblasten uit de vena saphena op mechanische rek, wat relevant is voor vasculaire fibrose.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsmechanismen en preklinische validatie van therapieën tegen remodeling.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria op basis van dosisafhankelijke veranderingen in de collageenuitlijning.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows van vroege ontdekking tot preklinische fasen, waardoor hypothesetesten, assay-gereedheid en datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door mechanische stimuli te koppelen aan de dynamiek van collageenreorganisatie.
- Screening: Zorgt voor assay-standaardisatie en reproduceerbare kwantitatieve matrix-uitlezingen voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Levert tijdopgeloste data over collageenoriëntatie en cellulaire tracking voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro observaties van remodellering met preklinische fibrosemodellen via geconserveerde cellulaire mechanismen.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van mechanosensitieve targets bij verschillende fibrose-indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in collageenremodellering te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door een beperkte gelgeometrie en interne referentiemarkers.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege go/no-go-beslissingen mogelijk te maken op basis van fenotypen op matrixniveau.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die een dosisafhankelijke remming van collageenreorganisatie vertonen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primaire celisolatie, de bereiding van fibrinegel en confocale microscopie.
- Toegang tot Flexcell FX4000T-apparatuur voor rektoepassing en time-lapse-beeldvormingssystemen is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor rekprotocollen, mediagebonden condities en pijplijnen voor beeldanalyse.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het vertalen van bevindingen van veneuze saphena-cellen naar andere fibrosis-relevante myofibroblastbronnen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in gelcompactie en de noodzaak van zorgvuldige rekkalibratie om loslating van het construct te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Culture of Human Vena Saphena Cells
3:18
Engineering of Fibrin-based Tissue Constructs
7:23
Applying Strain and Inducing Changes in Stain and Constraints
9:25
Visualizing Cells and Collagen
10:43
Results: Changes in Cellular and Matrix Alignment Due to Controlled Strain
11:55
Conclusion
