Name: Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T21:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Leer hoe je fibrine-gebaseerde weefselconstructen maakt met myofibroblasten om cel- en collageenherorganisatie in realtime te bestuderen. Deze methode maakt niet-destructieve monitoring van collageenremodellering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd uitgevoerd in het onderzoeksprogramma van het BioMedical Materials (BMM) instituut. BMM wordt medegefinancierd door het Nederlandse Ministerie van Economische Zaken, Landbouw en Innovatie. De financiële bijdrage van de Nederlandse Hartstichting is dankbaar erkend.

1. Cultuur van de mens Vena saphena Cellen <ol><li> Isoleer cellen van de vena saphena magna, verkregen van een donor in overeenstemming met richtlijnen voor het secundair gebruik materiaal, volgens het protocol van Schnell et al.. 9 en bewaar deze in vloeibare stikstof. Uit het gedeelte van de vena saphena magna ve donor gesneden stukken van 2 x 2 mm tot cultuur in een zes-well plaat. Gebruik 2 stuks per putje. Algemeen genoeg cellen kan worden verkregen tot ongeveer 3 flesjes vullen met 0,25 x 10 6 cellen in vloeibare stikstof. HVSCs worden gekarakteriseerd als myofibroblasten, door het tonen van expressie van vimentine, geen expressie van desmine en een subpopulatie uiten α gladdespieractine 10. Volgende beginnen het protocol bij de cellen van de vloeibare stikstof ontdooien het aantal cellen te verhogen. </li><li> Plaats de cellen van een flacon in een T75 weefselkweek kolf en voeg groeimedium (GM), bestaande uit geavanceerde DMEM, 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline /streptomycine en 5 ml L-glutamax. Wijzig medium om de 2-3 dagen. </li><li> Cellen groeien samenvloeiing na ongeveer 14 dagen. WINKEL 0,5 x 10 6 cellen in een flacon in vloeibare stikstof, genoemd passage 1. </li></ol> Opmerking: Bevriezing van de cellen is niet nodig bij het ​​oogsten HVSCs, maar wordt uitsluitend gebruikt voor opslag. <ol start="4"><li> Plaats de HVSCs uit een flacon in een T175 weefselkweek kolf en voeg GM. Wijzig medium om de 2-3 dagen. Cellen groeien samenvloeiing na circa 7 dagen. WINKEL 3 x 10 6 cellen in een flacon in vloeibare stikstof, genoemd passage 2. </li><li> Plaats de cellen van een flacon in een rollerbottle en voeg GM. Wijzig medium om de 2-3 dagen. Cellen groeien samenvloeiing na ongeveer 8 dagen. Een rollerbottle bevat ongeveer 20-30 x 10 6 cellen. Kweekcellen tot passage 6. Gebruik geen cellen van een passage hoger dan doorgang 9, aangezien cel fenotype kunnen veranderen. </li></ol&gt; 2. Engineering van fibrine-based Tissue constructen <ol><li> Bereid siliconenlijm door mengen van het elastomeer met het hardingsmiddel (10:01). Snij 7 x 3 mm rechthoekige segmenten van klittenband. Lijm de klittenband in een 6 putjes, met flexibele membranen aan een kruis te vormen, en een vierkante ruimte van 3 mm tussen de klittenband te verlaten. </li></ol> Opmerkingen: Gebruik alleen de zachte kant van het klittenband en het gezicht van deze kant naar boven. Bij het verlijmen van het klittenband, alleen betrekking hebben op het klittenband met siliconen lijm, verspreiden zich niet lijmen hele goed. Aangezien de cultuur platen rolmembraan bodems, gebruik iets onder de wells plaat voor het versterken van de flexibele membranen, gemakkelijk lijmen waarborgen op de plaat. <ol start="2"><li> Droog de siliconenlijm overnacht in een oven op 60 ° C tot verharding van de lijm te garanderen. Steriliseren door toevoeging van 70% EtOH aan de putjes en incubeer gedurende 30 minuten. Spoel 3x met PBS en verwijder alle PBS uit de wells en de klittenband. Gezet onder UV gedurende 30 minuten en houd steriel tot gebruik. </li><li> Bereid Tissue Engineering medium (TM), dat bestaat uit GM en 130 mg L-ascorbinezuur 2-fosfaat. </li><li> Voeg 1 mg / ml ε-aminocapronzuur (ACA) aan de TM. ACA wordt gebruikt voor de eerste 7 dagen van cultuur aan de fibrine voorkomen afbrekende 11. Alternatief aprotinine worden gebruikt. </li><li> Om de vorming klonteren te voorkomen, laat fibrinogeen op kamertemperatuur komen alvorens te openen. Zonder klonten fibrinogeen zal gemakkelijker oplossen. Los fibrinogeen tot een concentratie van 10 mg werkelijke eiwit / ml TM 7 aangevuld met ACA. Steriel filter de fibrinogeenoplossing, meerdere filters nodig kunnen zijn. Slaan op ijs tot gebruik. </li></ol> Opmerking: Om fibrinogeen mix ontbinden zachtjes te veel schuimvorming te voorkomen. <ol start="6"><li> Los trombine tot een concentratie van 10 IU / ml TM 7 aangevuld met ACA. Slaan op ijs tot gebruik. </li> &lt;/ Ol&gt; Opmerking: Opslag op ijs is nodig om vroege gelering van trombine en fibrinogeen voorkomen. <ol start="7"><li> Trypsinize de cellen opnieuw in suspensie in GM en tellen. </li><li> Gebruik 15 x 10 6 cellen / ml voor het zaaien van de fibrine-based weefselconstructen (concentratie op basis van methoden voor tissue engineering hartkleppen 7). Een gel bestaat uit 100 ul gof el en dus van 1,5 x 10 6 cellen. Doe 1,5 x 10 6 cellen in een centrifugebuis, waardoor zoveel centrifugebuizen als het aantal gels die worden gemaakt. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 350 xg gedurende 7 min en gooi het supernatant. Resuspendeer de cellen in 50 ul trombine. Voeg 4 ul van blauwe fluorescerende polystyreen microsferen om deze schorsing. Plaats 50 gl van fibrinogeen in een flesje. Gebruik een pipet tot het nemen van de 50 ul trombine met cellen. Het volume van de pipet 100 ul. Pipetteer de 50 ul oplossing van trombinecellen in de flacon met fibrinogeen aan de trombine en fibrinogeen mixen, en het nemen van de 100 pi mengsel. </li></ol> Opmerking: De fluorescerende polystyreen microsferen worden gebruikt als interne referentie markers voor beeldanalyse. Bij het mengen van trombine en fibrinogeen, de vorming van luchtbellen door voorzichtig pipetteren het mengsel. Luchtbellen zullen resulteren in gaten in de fibrine gel. <ol start="10"><li> Pipetteer de gel-mengsel in en tussen de klittenband. De typische geltijd voor fibrine gels, wanneer de componenten worden gemengd, in de orde van 20 sec. </li></ol> Opmerkingen: Doe dit zo spoedig mogelijk gelering te voorkomen voordat het mengsel wordt gepipetteerd in de putjes. Oefenen alvorens cellen en kralen. <ol start="11"><li> Incubeer suspensies gedurende 30 min bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 incubator gelering mogelijk voor het toevoegen cultuur TM met ACA. </li><li> Vervang TM met ACA om de 2-3 dagen voor de eerste 7 dagen. Gels zijn stabiel genoeg na een week worden gekweekt zonder ACA. Na de eerste week vervangen TM om de 2-3 dagen. Voeg 6 ml TM per putje. Op dag 12 cellen genoeg collageen voor visualisatie geproduceerd. </li></ol> 3. Het toepassen Strain en Inducerende Veranderingen in Strain en Constraints <ol><li> Statische belasting wordt door de cellen direct, vanwege cel tractie en verdichting 12 toegepast. Om collageen reorganisatie induceren, snijd de weefselconstruct los van twee klittenband in een richting. Dit resulteert in een richting beperkingen (Figuur 1A). Voer deze op dag 12, aangezien het construct wordt vervolgens stabiel genoeg en collageen is gedeponeerd. </li><li> Toepassen cyclische belasting door een vacuüm aan de onderkant van de kweekplaten met flexibele membranen met behulp van de Flexcell FX4000T systeem. Plaats de platen op een basisplaat, bovenop loading posten (die een deel van ee cyclische belasting-apparaat). De pomp voert een vacuüm op het membraan en daardoor trekt het membraan via rechthoekige paal dat eronder ligt. Door de kruisvormige bevestigingen van het weefsel construeert het membraan (via de klittenband) en rechthoekige paal de toegepaste cyclische stam uniaxiale (Figuur 1B). </li><li> In eerste instantie gebruik maken van statische cultuur gedurende 5 dagen om de eerste mechanische integriteit te bereiken, vóór toepassing van cyclische belasting beginnend op dag 6. Programma een cyclische vlek protocol in de controller voor de vacuümpomp. Bijvoorbeeld gebruik maken van een vooraf vastgestelde tussenpozen cyclisch stam protocol, met eenassige richting 13. Dit betekent dat een pulserend stam van een sinusgolf met 1 Hz, persen 0-5% rek voor een periode van 3 uur, afgewisseld met rustperiodes 3 uur. Voer deze cyclische stam protocol voor 7 dagen, het induceren van een uitgelijnde collageen organisatie. </li><li> Meestal na 12 dagen HVSCs een uitgelijnde collageen organizatio hebben geproduceerdn. Na een uitgelijnde collageen organisatie bereikt, verandert de uniaxiale cyclische spanning richting, loodrecht op de oorspronkelijke stam richting. Doe dit door de rechthoekige berichten van 90 °. </li></ol> 4. Visualiseren cellen en collageen <ol><li> Om actieve, real-time collageen remodeling, label monsters visualiseren met sondes die niet interfereren met de levensvatbaarheid van de cellen of de vorming van collageen. Gebruik sondes om fluorescent vlekken op de cel cytoplasma en collageen. </li><li> Alternatief tweede harmonische generatie met behulp van confocale laser scanning microscopie kan worden gebruikt om collageen structuren met behulp autofluorescence 14, met excitatie bij 780 nm en opsporing tussen 500-550 nm visualiseren. </li><li> Verwijder de cultuur platen uit de installatie en de incubator, voor de conjunctuur gespannen monsters tijdens de 3 uur rusttijd, en te transporteren naar een confocale laser scanning microscoop naar de cellen en collageen te visualiseren. </li></ol>

<ol><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).</li>
<li>Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cyclic+distention+enhances+the+mechanical+properties+of+collagen-based+media-equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).</li>
<li>Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+axial+strain+additively+increase+matrix+remodeling+and+MMP-9%2C+but+not+MMP-2%2C+expression+in+arteries+engineered+by+directed+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).</li>
<li>Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+multiscale+modeling+predicts+tissue-level+and+network-level+fiber+reorganization+in+stretched+cell-compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).</li>
<li>Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+tissue+development+under+biaxial+stretch+using+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).</li>
<li>Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+engineered+tissue+anisotropy+in+response+to+altered+loading+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).</li>
<li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+a+cell+carrier+in+cardiovascular+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications.</a> Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).</li>
<li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).</li>
<li>Schnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+cell+source+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+venous+vs.+aortic+human+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts.</a> Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).</li>
<li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+human+tissue-engineered+heart+valves%3A+prospects+for+systemic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application.</a> Circulation. , I152-I158 (2006).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).</li>
<li>John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+stiffness+regulates+fibroblast+behavior+in+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).</li>
<li>Rubbens, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+straining+accelerates+the+development+of+tissue+properties+in+engineered+heart+valve+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).</li>
<li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+and+quantitative+analysis+of+collagen+production+by+chondrogenic+human+mesenchymal+stem+cells+cultured+in+chitosan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).</li>
<li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).</li>
<li>Merryman, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+heart+valve+interstitial+cell+stiffness+and+transvalvular+pressure%3A+implications+for+collagen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis.</a> Am. J. Physiol. 290, (2006).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cellular+mechanotransduction+to+biologically+inspired+engineering%3A+2009+Pritzker+Award+Lecture%2C+BMES+Annual+Meeting+October+10%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).</li>
<li>van der Schaft, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Skeletal+Muscle+Tissues+from+Murine+Myoblast+Progenitor+Cells+and+Application+of+Electrical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (73), e4267(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het beschreven modelsysteem cel-bevolkte fibrine constructen grote mogelijkheden voor de studie van de cel en collageen (her) inrichting (de Jonge et al.. 15), bijvoorbeeld te gebruiken voor weefselregeneratie doeleinden. Door het gebruik van fibrine als de oorspronkelijke cel vervoerder, na fibrine degradatie, wordt een weefsel gemaakt met cellen en slechts endogene matrix. Op deze wijze worden cellen gestimuleerd om te reageren op spanning, statisch of cyclisch van aard, door toepassing co...

Cardiovasculaire weefsels hebben een prominente dragende functie. In het bijzonder de inhoud en organisatie van collageenvezels in de extracellulaire matrix bijdragen aan de dragende eigenschappen en domineren algehele weefsel sterkte 1. In tissue engineering mechanische conditionering van het construct wordt gebruikt - meestal bestaande uit (cyclische) uitpersen regimes - om weefsel organisatie en mechanische eigenschappen 2,3 versterken. Volledig begrip van stam-geïnduceerde collageen organisatie in complex weefsel geometrieën weefsels voorgedefinieerde collageen architectuur maakt is nog niet bereikt. Dit is voornamelijk te wijten aan onze beperkte kennis van collageen remodeling in het ontwikkelen van weefsels. Bestaande modellen geven vooral informatie over de uiteindelijke netto resultaat van collageen remodeling met gebruik van statische belasting 4-6. Hier bieden we een zeer afstembare modelsysteem dat de studie van collageen (re) organisatie maakt in een real-time mode, in 3D, onder invloedvan statische of cyclische belasting. Het weefsel constructen fibrine-based, zodat alle collageen in het construct is endogeen. Cel en collageen organisatie in de constructies wordt gevisualiseerd, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. In dit protocol wordt het gebruik van het model voor Human Vena saphena Cells (HVSCs) beschrijven, aangezien deze cellen staan ​​bekend om hun toegenomen extracellulaire matrix productie en de mogelijkheid om de matrix en ons langdurig gebruik in cardiovasculaire weefsels gemanipuleerde 7 verbouwen, gebaseerd over het werk van de Jonge et al.. 8

<table><tbody><tr><td>Culture plastic</td><td>Greiner</td><td></td><td>Omvat kweekkolven en pipetten</td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Elastomeer en uithardingsmiddel</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regelmatige winkel</td><td></td><td>Je kunt dit kopen in een reguliere winkel, gebruik alleen de zachte kant</td></tr><tr><td>Bioflex kweekplaten</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>Onbehandeld</td></tr><tr><td>L-Ascorbinezuur 2-fosfatase</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-Aminocapronzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine trombine</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogeen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0,45 spuitfilter</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen microsferen</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>Blauw fluorescerend, 10 μm diameter</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>Omvat rechthoekige laadposten</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td><td>Vriendelijk ter beschikking gesteld door het Laboratorium voor Macromoleculaire en Organische Chemie, Afdeling Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven</td></tr><tr><td>Confocale laserscanningmicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta laserscanningmicroscoop en Two-Photon-LSM modus</td></tr><tr><td>Amfotericine</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Nodig voor celisolatie</td></tr></tbody></table>

techniek fibrine-based tissue constructen van myofibroblasten en application of constraints en zeef to cell en collageen (re) organisatie induce

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collageen inhoud en organisatie bij de ontwikkeling van collagene weefsels kan worden beïnvloed door lokale weefsel stammen en weefsel beperking. Weefselingenieurs doel om deze principes te gebruiken om weefsels te creëren met voorgedefinieerde collageen architecturen. Een volledig begrip van het exacte onderliggende processen van collageen remodelleren de definitieve weefselarchitectuur controle echter ontbreekt. In het bijzonder weinig bekend over de (her) oriëntatie van de collageenvezels in reactie op veranderingen in weefsel mechanische belastingscondities. We ontwikkelden een in vitro modelsysteem bestaande uit biaxiaal constrained myofibroblast-gezaaide constructen fibrine, collageen verder te ontrafelen (her) oriëntatie in reactie op i) terugkeer naar biaxiale eenassige statische belastingsomstandigheden en ii) uniaxiale cyclische belasting van de biaxiaal beperkt constructen voor en na een verandering in belastingsrichting, met gebruik van de Flexcell FX4000T laadinrichting. Time-lapse confocale beeldvorming wordt gebruikt om visualize collageen (her) oriëntatie op een niet-destructieve manier. Cel en collageen organisatie in de constructen kunnen worden gevisualiseerd in real-time, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. Verschillende aspecten van het model systeem kan worden aangepast, zoals mobiele bron of het gebruik van gezonde en zieke cellen. Additieven kunnen worden gebruikt om verder te verhelderen mechanismen onderliggende collageen remodelleren, bijvoorbeeld door toevoegen van MMPs of blokkering integrinen. Vorm en grootte van de construct kan gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke behoeften, wat resulteert in een zeer regelbaar modelsysteem cel en collageen (re) organisatie bestuderen.

Dit model systeem maakt het mogelijk voor het kweken myofibroblastachtige gezaaide fibrinegelen. Figuur 1A toont een tissue eerst gekweekt onder statische biaxial beperkingen. Weefselbegrenzingen zijn vrijgegeven door het snijden van de fibrinegel uit twee beperkingen, om eenassige statische randvoorwaarden creëren, en het weefsel compacts en renovaties achteraf (figuur 1A). Voor cyclische belasting, wordt het weefsel gekweekt onder statische biaxial beperkingen ook. Na 5 dagen cyclisch...

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van op fibrine gebaseerde constructen die gebruikt kunnen worden om de reorganisatie van cellen en collageen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst menselijke veneuze saphena-cellen uit donorweefsel te isoleren en deze in kweek uit te breiden. De tweede stap is het vastlijmen van klittenbandstrips op flexibele membranen.Aan de bodem van zes-wellplaten wordt een vierkante ruimte in het midden gecreëerd, waarin het construct wordt geplaatst. Vervolgens wordt een mengsel van fibrinogeen, trombine, cellen en fluorescentielabelled beads toegevoegd aan de ruimte tussen de Velcro-strips, waarna het mengsel mag polymeriseren tot een gel. De laatste stap is het conditioneren van de cellen en het induceren van een georiënteerde matrixvorming door het construct te onderwerpen aan een uniaxiale cyclische rek of door statische rek los te laten.Door de fibrinegel in één enkele richting van de klittenbandpalen af te trimmen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die veranderingen in cellulaire en collageenreorganisatie beschrijven door de constructen in de loop van de tijd te monitoren met behulp van confocale microscopie. Deze meth

engineering-fibrin-based-tissue-constructs-from-myofibroblasts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier tonen we de fabricage van op basis van collageen, weefsel constructen die het skelet myoblasten. Deze 3-D ontworpen constructies kunnen worden gebruikt om weefsels te vervangen of...

Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen

We beschrijven de isolatie van neonatale cardiomyocyten en de voorbereiding van de cellen voor inkapseling in fibrine hydrogel constructen voor tissue engineering. We beschrijven methoden voor het analyseren van de weefselmanipulatieproducten myocard na de cultuur periode met inbegrip van actieve kracht die op elektrische stimulatie en levensvatbaarheid van de cellen en immunohistologische vlekken.

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Wij presenteren een model van ligamentweefsel waarin driedimensionale constructen worden behandeld met het menselijk oefenconditionerende serum en geanalyseerd voor collageengehalte, functie en cellulaire biochemie.

Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

Dit artikel presenteert een strategie voor het bouwen van eindige-elementenmodellen van vezelige geleidende materialen die zijn blootgesteld aan een elektrisch veld (EF). De modellen kunnen worden gebruikt om de elektrische input te schatten die cellen die in dergelijke materialen zijn gezaaid, te schatten en de impact te beoordelen van het veranderen van de materiaaleigenschappen, structuur of oriëntatie van de steiger.

Eindige element modellering van een cellulair elektrisch micromilieu

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Het volgende protocol presenteert een op afschuiving gebaseerde extrusiemethode voor de fabricage van collageenhydrogels met fibrillen met nanoschaalpatronen, die kan worden toegepast op een breed scala aan weefselengineeringtoepassingen.

Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer hoe je fibrine-gebaseerde weefselconstructen maakt met myofibroblasten om cel- en collageenherorganisatie in realtime te bestuderen. Deze methode maakt niet-destructieve monitoring van collageenremodellering mogelijk.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce (Video) | JoVE Journal

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

Meer video's verkennen