Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte strategie voor het immobiliseren van elk gewenst eiwit op polyacrylamidehydrogels, om zo verschillende parameters van de cellulaire micro-omgeving onafhankelijk te kunnen beheersen. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitoplossing over het oppervlak van de PDMS-stempel te verspreiden. De tweede stap bestaat uit het zorgvuldig drogen van het gestructureerde oppervlak van de PDMS-stempel met een constante stroom van stikstofgas van hoge zuiverheid.

Vervolgens wordt de met proteïne gecoate stempel met de gestructureerde zijde in contact gebracht met het oppervlak van de gedroogde hydrogel en worden er korte drukpunten uitgeoefend op de bovenkant van de PDMS-stempel om een goed contact tussen de microstructuren van de stempel en het hydrogeloppervlak te waarborgen; de laatste stap is om de PDMS-stempel voorzichtig van het hydrogeloppervlak te verwijderen en de stempel te reinigen na het afplakken van de niet-printzones. Met BSA kunnen cellen worden geplaatst op het micropatroon-hydrogeloppervlak. Ten slotte wordt een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gebruikt om de proteïne-microstructuren waar te nemen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de mechanotransductie, zoals de relatieve bijdrage van eigenschappen van de extracellulaire matrix, bijvoorbeeld stijfheid, de dichtheid van cel-liganden of de aard van de eiwitten. In het proces van ano-transactie wordt aanbevolen om deze procedure uit te voeren in een chemische zuurkast. Begin met het plaatsen van ronde glazen dekglasjes met een diameter van 25 millimeter in een Petrischaal en bestrijk deze gedurende vijf minuten met een 0,1 molar natriumhydroxide-oplossing.

Verwijder de natriumhydroxidoloplossing en dompel de dekglasjes volledig onder in steriel DD H2O; schud ze 20 minuten voorzichtig op een schudplaat. Giet het steriele DD H2O af, voeg opnieuw steriel DD H2O toe om de dekglasjes volledig onder te dompelen en schud ze nogmaals 20 minuten voorzichtig. Verwijder de dekglasjes met een steriele pincet en plaats ze in een nieuwe Petrischaal. Droog de dekglasjes, met de geactiveerde zijde naar boven, met een constante stroom hoogzuiver stikstofgas.

Zodra de dekglasjes droog zijn, plaatst u ze terug in de steriele cultuurkap en brengt u een dunne laag trimethylpropylacrylaat aan op de geactiveerde zijde van elk dekglasje. Laat dit één uur inwerken. Was de dekglasjes vervolgens uitgebreid met steriel DD H2O.

Dompel de dekglasjes vervolgens onder in steriel DD H2O in een nieuwe petrischaal. Sluit de petrischaal af met parafilm en plaats deze 10 minuten op een schudplateau onder zachte agitatie. Gebruik tot slot een steriele pincet met fijne punten om de dekglasjes van het DD H2O over te brengen naar een nieuwe petrischaal.

Plaats de geactiveerde zijde naar boven. Bedek de schaal met aluminiumfolie om te voorkomen dat er stof aan de dekglasjes hecht en bewaar deze bij kamertemperatuur op een droge plaats. Bereid ter start van deze procedure vijf milliliters van een steriele hydroxy polyacrylamide hydrogeloplossing en 100 µL van een verse 10% ammoniumpersulfaatoplossing.

Voeg, zoals beschreven in de protocoltekst, 2,5 µL tetramethyleendiamine en 25 µL van de ammoniumpersulfaatoplossing toe aan de hydroxy-polyacrylamide-hydrogeloplossing. Om de polymerisatie te initiëren, wordt de oplossing onder steriele omstandigheden in een steriele zuurkast drie keer opeenvolgend gepipetteerd om te mengen zonder luchtbellen te introduceren. Plaats een druppel van 25 µL van de hydroxy-polyacrylamide-hydrogeloplossing op een cirkelvormig dekglas van 25 mm en plaats onmiddellijk een cirkelvormig glazen dekglas van 22 mm bovenop de druppel om de hydroxy-polyacrylamide-hydrogeloplossing plat te drukken. Het glazen dekglas van 22 mm was vooraf geactiveerd door een blootstelling van zeven minuten in een UV-ozoonreiniger.

Centreer het glazen dekglas met steriele pincetten en strijk eventuele luchtbellen glad. Laat de hydroxy polyacrylamide hydrogel 15 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. Keer de buis met de resterende hydroxy polyacrylamide hydrogeloplossing handmatig om.

Om de voltooiing van het polymerisatieproces te volgen, worden de dekglasjes volledig ondergedompeld in steriel ddH₂O. Scheid het glazen dekglasje van 22 millimeter voorzichtig door de rand van een scheermesje tussen het glazen dekglasje van 22 millimeter en de hydroxy-polyacrylamide-hydrogellaag te plaatsen. Was de hydroxy-polyacrylamide-hydrogel drie keer met steriele PBS en laat de gel volledig ondergedompeld in steriele PBS om de hydratatie te behouden.

De polydimethylsiloxaan- of PDMS-microstempels die in deze procedure worden gebruikt, zijn gefabriceerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de PDMS-microstempels in een 50:50 ethanol-wateroplossing en sonicize deze gedurende 15 minuten. Droog de stempels met een stikstofstroom en plaats ze met de zijde van het patroon naar boven in een UV-ozonreiniger voor zeven minuten.

Plaats onder een steriele laminaire flowkast een druppel van 150 µL van de gewenste eiwitoplossing op het microgestructureerde oppervlak van A-P-D-M-S. In deze demonstratie wordt FI nin gebruikt als stempel. Verspreid de eiwitoplossing over het stampoppervlak door deze met een steriele pipetpunt naar elke hoek van de stempel te bewegen.

Laat de eiwitoplossing 60 minuten absorberen op de PDMS-stempel. Schakel onder deze steriele kap de lampen uit om beschadiging van de eiwitten te voorkomen. Verplaats vervolgens de met hydroxy polyacrylamide-hydrogel gecoate dekglasjes naar een nieuwe petrischaal.

Verwijder overtollig PBS van het oppervlak van de hydroxy poly acrylamide hydrogel-substraten met een lage stikstofstroom onder steriele omstandigheden. Stop de procedure zodra er geen sporen meer van stilstaand water op het geloppervlak zichtbaar zijn.

De gel mag in dit stadium niet volledig uitdrogen. Droog het gestructureerde oppervlak van de PDMS-stempel voorzichtig af met een gestage stroom hoogzuiver stikstofgas. Pak de eiwitgecoate stempel vast met een pincet voor wondverzorging en breng het gestructureerde oppervlak in contact met het gedroogde hydrogeloppervlak.

Oefen met de punt van de pincet korte drukpunten uit op de bovenkant van de PDMS-stempel om een goed contact te waarborgen tussen de microstructuren van de stempel en het hydrogeloppervlak; laat de PDMS-stempel na één uur gedurende één uur op het hydrogeloppervlak rusten bij kamertemperatuur. Verwijder de PDMS-stempel voorzichtig van de hydroxypolyacrylamide-hydrogel met een anatomische pincet en reinig de stempel door deze 15 minuten in een ethanol-wateroplossing te laten weken. Was de gestempelde hydroxypolyacrylamide-hydrogel uitgebreid met drie wissels PBS onder steriele omstandigheden, waarbij elke wissel 10 minuten duurt.

Voeg na de laatste PBS-wasbeurt een steriele BSA-oplossing toe en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder zachte agitatie op een schudplateau. Dit zal de niet-geprinte zones blokkeren voor de volgende dag. Was de gestempelde hydroxy polyacrylamide-hydrogel grondig door drie opeenvolgende spoelingen met PBS onder steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per spoeling.

Gestempelde hydroxy-polyacrylamide-hydrogels kunnen tot één week worden bewaard bij vier graden Celsius. De resultaten tonen een lineaire correlatie tussen de evolutie van de stijfheid van hydroxy-polyacrylamide-hydrogels en de hoeveelheid bisacrylamide-crosslinker. Epifluorescentiebeelden van laminaire rechthoekige micropatronen, gedeponeerd op hydroxy-polyacrylamide-hydrogels met drie verschillende stijfheden, demonstreren de onafhankelijke afstelling van de geometrie van het micropatroon en de stijfheid van de matrix. De ligandendichtheid van de cellen kan worden gemoduleerd door de concentratie van de eiwitoplossing te variëren die wordt gebruikt om de PDMS-stempels te incuberen.

Hier worden twee fluorescentiebeelden getoond van opeenvolgende microcontactprintingen. Strepen fibronectine in rood en laminine in groen, gekruist onder een hoek van 90 graden, en strepen fibrine, laminine en collageen, opeenvolgend gemicrogeprint op een 25 kilo pascal hydroxy-polyacrylamide-hydrogelondergrond. Wanneer primaire cellen werden uitgeplaat op homogeen gecoate en micropatroon-hydroxy-polyacrylamide-hydrogeloppervlakken, was de celviabiliteit tot drie dagen na het uitplaten ten minste 80%.

Er werd ook waargenomen dat de cellen sterker prolifereren op stijve substraten vergeleken met zachte substraten. Wanneer ze werden geplaatst op rechthoekige, met fibronectine gecoate micropatronen die waren aangebracht op hydroxy-polyacrylamide-hydrogels met drie verschillende stijfheden, vertoonden primaire endotheelcellen een lage actinevezeldichtheid en een afgeronde nucleus op de zachte hydrogel.

Op stijvere substraten zijn actinevezels rechter en dikker en is de kern na ontwikkeling vervormd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van mechanische transductie om de individuele rol van parameters in de cellulaire micro-omgevingen te onderzoeken in een breed scala aan cellulaire systemen, zoals primaire cellen of stamcellen, op weefselniveau, modelorganismen, of diverse demografische en organsystemen.