Name: Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer hoe je hydroxy-PAAm hydrogelen bereidt voor het ontkoppelen van mechanotransductie-effecten in celbiologisch onderzoek. Deze methode maakt eenvoudige immobilisatie van ECM-eiwitten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Belgische Nationale Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek (F.R.S.-FNRS) via “MIS Confocale Microscopie”, “Crédit aux Chercheurs”-subsidies en het “Nanomotility FRFC-project” (nr. 2.4622.11). Het doctoraatsbeurs van T.G. wordt ondersteund door de Stichting voor Opleiding in Industrieel en Landbouwkundig Onderzoek (FRIA). De auteurs danken Sylvain Desprez voor de mechanische karakterisering en Géraldine Circelli voor de confocale beeldvorming.

1 Activeren van de Oppervlakte van de dekglaasjes <ol><li> Plaats glas ronde dekglaasjes (25 mm diameter) in een petrischaal en uitstrijkje 0,1 M NaOH-oplossing op het voor 5 minuten (zuurkast aanbevolen). </li><li> Verwijder de NaOH-oplossing en dekglaasjes volledig onder te dompelen met steriele DDH 2 O voor 20 min, terwijl zachtjes rocken op een rockende plaat in een steriele cultuur kap. </li><li> Drain steriele DDH 2 O en herhaal de stap 1.2. </li><li> Verwijder de dekglaasjes met steriele pincet en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven. </li><li> Droog dekglaasjes onder een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas. </li><li> In een steriele cultuur kap, smeer een dunne laag 3 (trimethoxysilyl) propyl acrylaat (92%) van de geactiveerde kant van het dekglaasje gedurende 1 uur. </li><li> Veelvuldig wassen dekglaasjes met 3 wasbeurten van steriele DDH 2 O en dompel ze in steriele DDH 2 O in een nieuwe petrischaal. </li><li> Tik op de petrischaalmet Parafilm en plaats het op een rocker plaat onder zacht schudden gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de dekglaasjes van DDH 2 O met een steriele pincet met fijne tips en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven. </li><li> Bewaar bij kamertemperatuur op een droge plaats met aluminiumfolie om stof van het vasthouden aan de dekglaasjes voorkomen. </li></ol> 2 Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen <ol><li> Bereid een gewicht van 65 mg N-hydroxyethyl acrylamide (HEA) in een 1,5 ml Eppendorf buis. Het is belangrijk om een ​​nieuwe HEA te bereiden. </li><li> Voeg 1 ml van 50 mM HEPES buffer HEA en meng met een vortexer tot een totale HEA oplossen. </li><li> Voeg 400 ul van 40% w / w in HEPES acrylamide-oplossing en het vereiste volume van 2% w / w in HEPES bis-acrylamide-oplossing (zie tabel 1) op de gewenste hydrogel stijfheid bereikt. Aanpassen met 50 mM HEPES tot een eindvolume van 5 ml. </li><li> Meng de oplossing met behulp van een vortexer en ontgast hetin een vacuümkamer gedurende 20 min om de zuurstofconcentratie in de oplossing, die hydroxy-PAAM polymerisatie voorkomt. </li><li> Onder een steriele kap Filtreer de oplossing ontgast met een 0,2 micrometer poriegrootte om te steriliseren. </li><li> Activeren ronde glazen dekglaasjes (22 mm diameter) in een UV / ozon reiniger gedurende 7 min. </li><li> Bereid 100 ul van 10% ammoniumpersulfaat (APS)-oplossing, dat is 10 mg APS in 100 ul DDH 2 O. Het is belangrijk om een ​​nieuwe APS te bereiden. </li><li> Voeg 2,5 gl tetramethyleendiamine (TEMED) en 25 gl APS oplossing van het gesteriliseerde hydroxy-PAAM oplossing (stap 2.5) om de polymerisatie te initiëren. Meng de oplossing door 3 opeenvolgende pipettings zonder introductie van bellen, onder steriele omstandigheden. </li><li> Onder een steriele kap, plaats een 25 ul druppel van het hydroxy-PAAM oplossing op een 25 mm dekglaasje (verkrijgbaar bij stap 1.9) en onmiddellijk plaats een 22 mm glass dekglaasje (bereid in stap 2.5) bovenop de druppel de hydroxy-PAAM oplossing knijpen. Centreer de 22 mm glas dekglaasje met een steriele pincet en glad uit eventuele luchtbellen. </li><li> Laat hydroxy-PAAM hydrogels polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Inverteer handmatig de resterende hydroxy-PAAM oplossing in de Eppendorf buis tot de voltooiing van de polymerisatie volgen. </li><li> Volledig dompel dekglaasjes met steriele DDH 2 O en 22 mm dekglaasjes zorgvuldig gescheiden door invoering van de rand van een scheermes tussen de 22 mm dekglaasjes en hydroxy-PAAM hydrogel laag. </li><li> Wassen hydroxy-PAAM hydrogels met steriele PBS (3 uitwisseling van PBS) en laat de gel volledig ondergedompeld in steriele PBS om hydratatie te behouden. </li><li> WINKEL hydroxy-PAAM hydrogels in steriele PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen. </li></ol> 3 Polydimethylsiloxaan (PDMS) Microstamp Fabrication OPMERKING: De fabricage van een silicium meester wordt voorafgaand aan sta vereistrt het PDMS microstamp fabricage. Dit microfabrication van een silicium meester kan worden gedaan door lithografische technieken, die gespecialiseerde apparatuur en training vereist. Samenwerkingen met een nanofabricage faciliteit worden aangemoedigd om het silicium meester fabriceren. U kunt ook contact opnemen met een bedrijf dat op maat gemaakte microstructured silicium masters fabriceert op de vraag. Het is belangrijk op te merken dat de fabricage van het silicium meester hoeft slechts eenmaal te worden gedaan. Inderdaad, microgestructureerde silicium masters onbeperkt worden gebruikt elastomere stempels produceren. <ol><li> Mix PDMS en het hardingsmiddel in een verhouding 10: 1 in een plastic beker en meng met een pipet voor 10 minuten. </li><li> Ontgas de PDMS mengsel onder vacuüm om luchtbellen die tijdens de stap 3.1 gevormd verwijderen. </li><li> Plaats de microstructuur silicium meester in een petrischaal en wierp een 10-mm dikke laag ontgast PDMS mengsel op het zonder de vorming van luchtbellen. </li><li> Genees de PDMS 2 uur bij 60 ° C in eenoven. </li><li> In een stofvrije omgeving, peel-off van de PDMS laag en accijnzen 1 cm 2 microstamps met een scalpel. </li><li> Behulp van een tang, plaats PDMS microstamps patroon-up in een petrischaal. </li></ol> 4 Micropatterning Hydroxy-PAAM Hydrogelen <ol><li> Plaats PDMS microstamps in een ethanol / water (50/50)-oplossing en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. </li><li> Droog de stempels een stikstofstroom stroming en plaats ze-patroon in een UV / ozon cleaner (λ &lt;200 nm) gedurende 7 minuten. </li><li> Onder een steriele kap, plaats een 150-ul druppel gewenste eiwitoplossing (bijvoorbeeld 100 ug / ml laminine in PBS of 25 ug / ml fibronectine in PBS) op het microgestructureerde oppervlak van 1 cm2 PDMS stempel. </li><li> Optioneel: Wijzig de concentratie van de eiwitoplossing om de cel-ligand dichtheid moduleren. </li><li> Spreid de eiwitoplossing over het stempel oppervlak door het bewegen met een steriele punt van een pipet naar elke hoek vande stempel. </li><li> Laat de eiwitoplossing geadsorbeerd aan het PDMS stempel voor 60 minuten onder een steriele kap. Schakel lampen aan eiwit schade te voorkomen. </li><li> Onder een steriele kap, overdragen hydroxy-PAAM gecoate dekglaasjes (beschikbaar vanaf stap 2.13) in een petrischaal. </li><li> Verwijder overtollig PBS uit het oppervlak van hydroxy-PAAM substraten met een lage stikstofstroom onder steriele omstandigheden. Stop de procedure zodra geen bewijs van stilstaand water op het gel oppervlak waargenomen. De gel dient niet grondig worden gedroogd in dit stadium. </li><li> Droog zorgvuldig de gestructureerde oppervlak van het PDMS stempel met een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas. </li><li> Pak de met eiwit beklede stempel met dressing weefsel pincet en plaats het gestructureerde oppervlak in contact met het gedroogde hydrogel oppervlak. Toepassen korte drukpunten met de punt van pincet op de bovenkant van de PDMS stempel om een ​​goed contact tussen stempel microfeatures en hydrogel oppervlak te verkrijgen. </li><li> Laat de PDMS stempel op The hydrogel oppervlak gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig PDMS postzegels uit hydroxy-PAAM hydrogels met dressing weefsel tang en volg de stap 4.1 op de stempel te reinigen. </li><li> Was grondig de gestempelde hydroxy-PAAM hydrogels door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling. </li><li> Optioneel: Extra micropatterns van andere ECM eiwitten kunnen aan de hydroxy-PAAM oppervlak worden toegevoegd door de volgende stappen 4,5-4,11. </li><li> Passiveren onbedrukte zones met een steriele oplossing van BSA bij 5 mg / ml in PBS gedurende een nacht bij 4 ° C onder zacht schudden op een schommelende plaat. </li><li> Was uitgebreid door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling. In dit stadium kan gestempeld hydroxy-PAAM hydrogels worden bewaard bij 4 ° C maximaal een week. </li></ol> 5. Cell Afzetting op micropatterned hydroxy-PAAM Hydrogelen <ol><li> Incubeer dekglaasjes in celmedium gedurende 30-45 min vóór plateren cells. </li><li> Was hechtende cellen gekweekt in een 75 cm2 kolf met steriele PBS bij 37 ° C en verwijder met 3 ml trypsine-EDTA of Accutase gedurende 10 minuten. </li><li> Breng de gewenste hoeveelheid voorverwarmde compleet groeimedium geschikt is voor uw cellijn in de kolf die de vrijstaande cellen en centrifuge de celsuspensie gedurende 3 min bij 650 x g. </li><li> Verwijder het supernatant met een micropipet en resuspendeer de cellen in compleet kweekmedium 15-20,000 cellen / ml. </li><li> Voeg 4 ml van de celoplossing een micropatterned dekglaasje (verkregen uit stap 5.1) en plaats het cel bedekte dekglaasje in een incubator bij 37 ° C en 5% vochtigheid gedurende 1-2 uur. </li><li> Zuig zachtjes losse cellen en vervang kweekmedium. Bijgesloten cellen naar de incubator laten verspreiden volledig (3-6 uur, afhankelijk van het celtype). </li></ol>

<ol><li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li>
<li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li>
<li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288(2013).</li>
<li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microfluidic+method+to+select%2C+isolate%2C+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li>
<li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li>
<li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li>
<li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li>
<li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li>
<li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+%22ink%22+followed+by+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499(2012).</li>
<li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+towards+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899(2011).</li>
<li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671(2012).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Confinement%3A+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li>
<li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness%3A+a+material%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn gedeclareerd.

Veel in vitro waarnemingen in de moderne celbiologie uitgevoerd op harde dekglaasjes, vaak bekleed met een dunne laag van ECM eiwitten of synthetische peptiden die de RGD-sequentie. Echter, zulke fundamentele cultuur substraten niet recapituleren de hele fysisch-chemische complexiteit van de ECM en dus niet voorzien van een nauwkeurig model voor het bestuderen van cellulaire processen mechanotransduction. Om dit probleem aan te pakken, stellen we een eenvoudig alternatief voor tweedimensionale hydrogels functio...

Veel aspecten van de lokale cellulaire micro-omgeving (bijvoorbeeld stijfheid, poriegrootte, aard van eiwitten of cel-ligand density) een coördinaat set van regulerende signalen die cellulaire processen zoals motiliteit, celproliferatie, differentiatie en genexpressie. Modificaties van de fysicochemische eigenschappen van het extracellulaire milieu kan worden waargenomen door cellen en veroorzaken verschillende fysiologische gevolgen, zoals vervorming van cellulaire polarisatie, migratie en differentiatie. Het blijft echter onduidelijk hoe cellen vertalen ECM veranderingen in cellulaire biochemische signalen. Het is derhalve van groot belang te ontwerpen gecontroleerde in vitro micro-omgevingen die de interacties tussen cellen en hun micromilieu kan reproduceren voor het bestuderen mechanotransduction trajecten. Om dit probleem aan te pakken, hebben we onlangs een nieuwe methode 1, genaamd hydroxy-PAAM hydrogels, om eenvoudig genereren twee-dimensional zachte matrices die toelaten om zelfstandig te beheersen belangrijke mechanotransduction aanwijzingen: matrix stijfheid, cel geometrie en opsluiting, de aard van de eiwitten en cel-ligand dichtheid. ECM stuurt cellulaire processen via hellingen in morphogens (chemotaxis), lijm-eiwitten (haptotaxis) en stijfheid (durotaxis). In de afgelopen decennia, geavanceerde in vitro platformen werden ontwikkeld om deze extracellulaire signalen te isoleren om te plagen uit hoe cellen zijn in staat om biochemische en biofysische eigenschappen te vertalen naar fysiologische processen 2-5. Elektronenbundel 6, 7 fotolithografie, fotochemische immobilisatie 8 of plasma geassisteerde technieken 9 zijn ontwikkeld om de groei van levende cellen op micropatterned substraten sturen. Hoewel deze technieken belangrijke resultaten hebben opgeleverd, de meeste van hen geen onderscheid tussen de individuele invloed van verschillende signalen op mobiele gedrag toestaanen ze technische faciliteiten die paar laboratoria kunnen veroorloven, verlangen. Onder deze technieken, microcontactprinten (μCP), heeft zich ontpopt als een robuuste en toegankelijke methode om cel-lijm micro-eilanden 10 te creëren. Meer recent zijn omvangrijke inspanningen 11-14 werden geleverd om μCP ontwikkelen op hydrogels met instelbare starheid om de brede waaier van rigiditeiten waargenomen in levende weefsels te reproduceren. Onder deze werken, heeft polyacrylamide (PAAM) populair 15 geworden en is nu al een van de meest gebruikte polymeren gebaseerde matrices voor mobiele biomechanica assays. PAAM oppervlakken worden vaak gefunctionaliseerd met de heterobifunctionele verknoper N-sulfosuccinimidyl-6-[4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) en ECM eiwitten zijn gekoppeld aan het oppervlak door UV activering van de sulfo-SANPAH nitrofenyl azide groepen 16. Een andere techniek bestaat uit het koppelen hydrazine eiwitten die zwaar zijn geoxideerdmet perjodaat 17. Hynd en medewerkers introduceerde een techniek voor patroonvorming biomimetische hydrogel oppervlakken eiwitten en peptiden die fotopolymerisatie in aanwezigheid van een acroyl streptavidine monomeer 18 vereist. Meer recent Tseng et al. Hebben een nieuwe methode micropatterning 19 gebaseerd op diepe UV blootstelling van PAAM via een optische kwartsmasker die vereist geactiveerde PA gels incuberen met 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) gerapporteerd en N-hydroxysuccinimide (NHS) wateroplossingen vóór het eiwit voegen. Ondanks het vermogen van deze technieken die homogene en reproduceerbare eiwitten micropatterns creëren meeste lijden belangrijke beperkingen: lange synthesewerkwijzen (bijvoorbeeld dialyse, vriesdrogen, etc), dure chemische verbindingen (bijvoorbeeld, hyaluronzuur, sulfo-SANPAH) of diepe UV bestraling. Bovendien zijn deze technieken niet onafhankelijk modulatie substraat stijfheid, micropattern toestaangeometrie, ECM eiwit natuur, en cel-ligand dichtheid. Rekening houdend met deze beperkingen, hebben we een nieuwe en eenvoudige-acrylamide gebaseerde aanpak die immobilisatie van een verscheidenheid van eiwitten en biomoleculen op zachte hydrogels maakt en maakt onafhankelijk afstemmen van mechanotransduction signalen om hun rol in cellulaire functies ontcijferen ontwikkeld. In plaats van het behandelen van PAAM hydrogels met agressieve chemische stoffen, introduceren we een commerciële acrylamide monomeer met hydroxylgroepen tijdens PAAM polymerisatie. Deze eenvoudige handeling overwint de intrinsieke anti-klevende eigenschap van PAAM hydrogels, zonder enige andere technische eisen. De aanwezigheid van hydroxylgroepen leidt tot een hoge affiniteit van hydroxy-PAAM hydrogels voor eiwitten en biomoleculen die waterstofbinding interacties vormen. In combinatie met μCP, hydroxy-PAAM hydrogels maken een snelle generatie van tweedimensionale cultuur platform met een onafhankelijke controleop matrix stijfheid, type ECM eiwitten, cel-ligand dichtheid en kleverigheid beperkt, die beoogd een krachtig platform voor het bestuderen mechanotransduction zijn. Het doel van dit protocol is om de nodige informatie voor het eenvoudig maken van hydroxy-PAAM hydrogels zonder enige expertise in materiaalkunde bieden. Het uiteindelijke doel is om een ​​middel te bieden voor onderzoekers om fysiologisch relevante vragen op cellulair en weefselniveau die kunnen leiden tot een beter begrip van mechanotransduction routes betrokken bij pathofysiologische mechanismen te vragen.

<table><tbody><tr><td>UV/Ozone Photoreactor</td><td>Ultra-Violet Producten</td><td>Model PR-100</td><td></td></tr><tr><td>Wiegelplaat</td><td>IKAcWerke</td><td>Model KS 130 Basic</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Model Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum degassing kamer</td><td>Applied Vacuum Engineering</td><td>DP- 8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen pincet met fijne punt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Kledingweefsel pincet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen in polystyreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie, dikte 0,5&nbsp;mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>Isopore membraanfilter (0,2 &micro;m poriegrootte)</td><td>Millipore</td><td>GTTP Filtercode</td><td></td></tr><tr><td>Ronde glazen deksel (22 mm diameter)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>Ronde glazen deksel (25 mm diameter)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet met variabel volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitpikocentrifugebuizen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Meshandgrepen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mesbladen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurkolven (75 cm2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon badbak, massief (roestvrij staal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 siliconen elastomeer kit</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid (poeder)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N,N&rsquo;-Methyleenbis(acrylamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxyethylacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-Tetramethylethyleendiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium PerSulfaat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectine</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Laminine van EHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dubbel gedistilleerd water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel groeimedium</td><td>Cells Applications</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endotheel Cellen (HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA laboratoria</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufferoplossing 1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotica-antimycotica</td><td>PAA laboratoria</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline oplossing</td><td>PAA laboratoria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phaloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vinculine antilichaam geproduceerd in muis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis antilichaam-tetramethylrhodamine</td><td>Molecular Probes</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectine (konijn)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminine antilichaam (konijn)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van hydroxy-paam hydrogelen voor ontkoppeling van de effecten van mechanotransductie cues

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Het is nu algemeen bekend dat vele cellulaire functies worden gereguleerd door interacties van cellen met fysisch-chemische en mechanische signalen van hun extracellulaire matrix (ECM)-omgeving. Eukaryotische cellen voortdurend voelen de lokale micro-omgeving door bovengrondse mechanosensors fysieke veranderingen van ECM in biochemische signalen transduceren, en integreren deze signalen om specifieke veranderingen in genexpressie. Interessant fysicochemische en mechanische parameters van de ECM kan paar met elkaar lot van de cel reguleren. Daarom is een sleutel tot het begrijpen mechanotransduction is om de relatieve bijdrage van ECM signalen op cellulaire functies los te koppelen. Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol om snel en eenvoudig te genereren biologisch relevante hydrogels voor de onafhankelijke afstelling van mechanotransduction signalen in vitro. We chemisch gemodificeerde polyacrylamide hydrogels (PAAM) om hun intrinsiek niet-pat te overwinnenive eigenschappen door het opnemen van hydroxyl-gefunctionaliseerde monomeren acrylamide tijdens de polymerisatie. We verkregen een nieuwe PAAM hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM die immobilisatie van elke gewenste aard van ECM eiwitten toestaat. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogelen met microcontactprinten stelt onafhankelijk regelen van de morfologie van afzonderlijke cellen, de matrix stijfheid, de aard en de dichtheid van ECM eiwitten. Wij bieden een eenvoudige en snelle methode die kan worden ingesteld in elk biologie lab om te studeren in vitro cel mechanotransduction processen. Wij valideren deze roman tweedimensionale platform door het uitvoeren van experimenten op endotheelcellen die een mechanische koppeling tussen ECM stijfheid en de kern aan te tonen.

Figuur 1A toont de co-polymerisatie van acrylamide (AAm) en bisacrylamide (bis-AAm) met N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomeren die een primair hydroxyl gevormd door willekeurig radicaalpolymerisatie- een hydrofiele netwerk van polyacrylamide met ingebedde hydroxylgroepen (hydroxy-PAAM) . In dit protocol moet een gewicht 65 mg HEA worden verdund in een volume van 1 ml HEPES. Wetende dat de dichtheid van HEA is ongeveer gelijk aan een, gaan we ervan uit dat we een werkvolume van 1.065 pi (HEA + HEPES) t...

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte strategie voor het immobiliseren van elk gewenst eiwit op polyacrylamidehydrogels, om zo verschillende parameters van de cellulaire micro-omgeving onafhankelijk te kunnen beheersen. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitoplossing over het oppervlak van de PDMS-stempel te verspreiden. De tweede stap bestaat uit het zorgvuldig drogen van het gestructureerde oppervlak van de PDMS-stempel met een constante stroom van stikstofgas van hoge zuiverheid.Vervolgens wordt de met proteïne gecoate stempel met de gestructureerde zijde in contact gebracht met het oppervlak van de gedroogde hydrogel en worden er korte drukpunten uitgeoefend op de bovenkant van de PDMS-stempel om een goed contact tussen de microstructuren van de stempel en het hydrogeloppervlak te waarborgen; de laatste stap is om de PDMS-stempel voorzichtig van het hydrogeloppervlak te verwijderen en de stempel te reinigen na het afplakken van de niet-printzones. Met BSA kunnen cellen worden geplaatst op het micropatroon-hydrogeloppervlak. Ten slotte wordt een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gebruikt om de proteïne-microstructuren waar te ne

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden...

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer hoe je hydroxy-PAAm hydrogelen bereidt voor het ontkoppelen van mechanotransductie-effecten in celbiologisch onderzoek. Deze methode maakt eenvoudige immobilisatie van ECM-eiwitten mogelijk.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Meer video's verkennen