Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues
28 augustus 2014
We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.
Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige en efficiënte strategie te ontwikkelen voor het immobiliseren van elke eiwit van belang op poly acrylamide hydrogels om verschillende parameters van het cel micro-omgeving onafhankelijk te kunnen controleren. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitoplossing over het PDMS stempeloppervlak te verspreiden. De tweede stap is om het gestructureerde oppervlak van het PDMS-stempel voorzichtig te drogen met een gelijkmatige stroom van hoogzuiverheidsstikstofgas.
Vervolgens wordt het met eiwit beklede stempel met een gestructureerd oppervlak in contact gebracht met het droge hydrogeloppervlak en korte drukpunten worden aangebracht op de bovenkant van het PDMS-stempel om een goede contact tussen de stempel micro-functies en het hydrogeloppervlak te garanderen, de laatste stap is om de PDMS-stempel voorzichtig van het hydrogeloppervlak te verwijderen en de stempel te reinigen Na activatie van de niet-afdrukzones. Met BSA kunnen cellen op het micropatroon hydrogeloppervlak worden geplaatst. Uiteindelijk wordt een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gebruikt om de eiwitmicrofuncties te observeren.
Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in het mechanotransductieveld te beantwoorden, zoals de relatieve bijdrage van extracellulaire matrixeigenschappen, bijvoorbeeld stijfheid, celligondichtheid of eiwitnatuur. In het ano transactieproces wordt aanbevolen dat deze procedure in een chemische afzuigkap wordt uitgevoerd. Begin door cirkelvormige glazen deksels met een diameter van 25 millimeter in een petrischaal te plaatsen en er vijf minuten lang een 0,1 molaire natriumhydroxideoplossing op te smeren.
Verwijder de natriumhydroxideoplossing en dompel de deksels volledig onder in steriele DD H2O, schud zachtjes gedurende 20 minuten op een schuddende plaat, giet de steriele DDH twee O af en dompel deksels opnieuw onder in steriele DDH twee O en schud gedurende nog eens 20 minuten zachtjes. Verwijder de deksels met steriele pincetten en plaats ze in een nieuwe petrischaal. Laat de geactiveerde kant naar boven gericht, droog de deksels met een gelijkmatige stroom van hoogzuiverheidsstikstofgas.
Zodra de deksels droog zijn, breng ze terug naar de steriele kweekkap en smeer een dunne laag drie trimethyl propyl acrl op de geactiveerde kant van elke deksel. Laat het een uur staan na een uur. Was de glazen deksels grondig met steriele DD H2O.
Dompel de deksels vervolgens in steriele DD H2O in een nieuwe petrischaal. Sluit de petrischaal af met parafilm en plaats deze op een schuddende plaat onder zachte agitatie gedurende 10 minuten. Gebruik ten slotte steriele pincetten met fijne uiteinden om de deksels over te brengen van de DDH twee O naar een nieuwe petrischaal.
Met de geactiveerde kant naar boven. Bedek de schaal met aluminiumfolie om te voorkomen dat stof aan de deksels kleeft en bewaar op kamertemperatuur op een droge plaats. Om deze procedure te beginnen, bereid vijf milliliter van een steriele hydroxypoly acrylamide hydrogeloplossing en 100 microliters van een verse 10% ammoniumpersulfaatoplossing voor.
Zoals beschreven in de protocoltekst, voeg 2,5 microliter tetramethyleen diamine en 25 microliter van de ammoniumpersulfaatoplossing toe aan de hydroxypoly acrylamide hydrogeloplossing. Om de polymerisatie te initiëren, meng de oplossing door middel van drie opeenvolgende pipetteren zonder introductie van luchtbellen onder steriele omstandigheden onder een steriele kap, plaats een 25 microliter druppel van de hydroxypoly acrylamide hydrogeloplossing op een 25 millimeter cirkelvormige deksel en plaats onmiddellijk een 22 millimeter cirkelvormige glazen deksel op de druppel om de hydroxypoly acrylamide hydrogeloplossing te persen. De 22 millimeter glazen deksel werd eerder geactiveerd door een zeven minuten durende blootstelling in een UV ozonreiniger.
Centreer het glazen deksel met steriele pincetten en maak eventuele luchtbellen glad. Laat de hydroxypoly acrylamide hydrogel in kamertemperatuur gedurende 15 minuten polymeriseren. Draai handmatig de resterende hydroxypoly acrylamide hydrogeloplossing in de buis om.
Om het voltooien van het polymerisatieproces te volgen, dompel de deksels volledig onder in steriele D DH twee o. Scheid voorzichtig het 22 millimeter glazen deksel door de rand van een scheermesje in te brengen tussen het 22 millimeter glazen deksel en de hydroxypoly acrylamide hydrogellaag. Was de hydroxypoly acrylamide hydrogel drie keer met steriele PBS en laat de gel volledig onderdompelen in steriele PBS om de hydratatie te behouden.
De polydimethylsoane of PDMS micro-stempels die in deze procedure worden gebruikt, werden vervaardigd zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de PDMS micro-stempels in een 50 tot 50 ethanolwateroplossing en soniceer gedurende 15 minuten. Droog de stempels met een stikstofstroom en plaats ze patroon omhoog in een UV ozonreiniger gedurende zeven minuten.
Onder een steriele kap plaatst u een druppel van 150 microliter van een gewenste eiwit oplossing op het micro-gestructureerde oppervlak van A-P-D-M-S. Stamp FI nin wordt in deze demonstratie gebruikt. Verspreid de eiwitoplossing over het stempeloppervlak door het met een steriele pipettentip naar elke hoek van het stempel te bewegen.
Laat de eiwitoplossing 60 minuten op de PDMS-stempel absorberen. Schakel in deze steriele kap de lampen uit om eiwitbeschadiging te voorkomen. Breng vervolgens de met hydroxypoly acrylamide hydrogel beklede deksels over in een nieuwe petrischaal.
Verwijder overtollig PBS van het oppervlak van de hydroxypoly acrylamide hydrogel substraten met de lage stikstofstroom onder steriele omstandigheden. Stop de procedure. Zodra er geen bewijs van staand water op het geloppervlak meer wordt waargenomen.
Het gel moet in dit stadium niet volledig worden gedroogd. Droog voorzichtig het gestructureerde oppervlak van de PDMS-stempel met een gelijkmatige stroom van hoogzuiverheidsstikstofgas. Pak de met eiwit beklede stempel vast met dressing tissue pincetten en breng een gestructureerd oppervlak in contact met het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert hydroxy-PAAm, een nieuwe polyacrylamide hydrogel die directe binding van ECM-eiwitten mogelijk maakt met minimale expertise. De integratie van hydroxy-PAAm met microcontact printing zorgt voor onafhankelijke controle van verschillende signalen in de celmicro-omgeving, wat de studie van cellulaire mechanotransductie vergemakkelijkt.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biomaterialen
Achtergrond
- Hydrogeltechnologie is cruciaal voor het bestuderen van celgedrag.
- ECM-eiwitten spelen een belangrijke rol in celfuncties.
- Microcontact printing is een techniek die wordt gebruikt om oppervlakken te patrooneren.
- Begrip van mechanotransductie is essentieel voor verschillende biologische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor eiwit-immobilisatie op hydrogels.
- Om nauwkeurige controle over de celmicro-omgeving mogelijk te maken.
- Om de studie van cellulaire reacties op mechanische signalen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het verspreiden van eiwit-oplossing op een PDMS-stempeloppervlak.
- Het drogen van de PDMS-stempel met stikstofgas.
- Het contact maken van de eiwit-gecoate stempel met het hydrogeloppervlak.
- Het gebruiken van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om eiwitpatronen te observeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle immobilisatie van eiwitten op hydroxy-PAAm hydrogels.
- Aangetoonde controle over micro-omgevingsparameters.
- Mogelijkheid gegeven voor observatie van cellulair gedrag op gepatroond oppervlak.
- Inzichten verschaft in mechanotransductieprocessen.
Conclusies
- Hydroxy-PAAm is een veelzijdig hulpmiddel voor celbiologieonderzoek.
- De methode vereenvoudigt het proces van het bestuderen van ECM-interacties.
- Verdere toepassingen in mechanotransductieonderzoeken worden verwacht.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Decoupling mechanotransduction cues is critical for understanding how extracellular matrix (ECM) properties independently influence cell fate decisions in early discovery. The hydroxy-PAAm hydrogel platform enables precise, independent control of matrix stiffness, protein composition, and ligand density, directly supporting mechanistic de-risking and target validation. This capability enhances predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline and informs risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of individual ECM parameters to clarify their roles in cellular signaling and gene expression.
- Supports functional target validation by isolating mechanical and biochemical cues affecting cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing independent tuning of microenvironmental variables.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses and target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, tunable hydrogel substrates for reproducible cell-based assays.
- Standardizes assay conditions by independently controlling matrix stiffness, protein type, and ligand density.
- Enables quantitative, high-content readouts for compound screening and phenotypic analysis.
- Supports scalable and reusable assay platforms for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanotransduction models with disease-relevant ECM conditions for translational continuity.
- Facilitates risk-adjusted advancement by providing mechanistic insights into cell-ECM interactions.
- Supports biomarker discovery by enabling controlled studies of cellular responses to defined mechanical cues.
Pipeline & Workflow Integration
This hydrogel platform fits from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling hypothesis-driven studies of ECM influence on cell fate.
- Discovery Biology: Provides a system for hypothesis testing and pathway clarification by decoupling ECM variables.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible substrates with independently tunable parameters.
- Analytics: Generates quantitative measurements of cell morphology, viability, and mechanotransduction outputs.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking disease-relevant ECM properties.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel preparation, protein immobilization, and sterile technique.
- Needs access to fluorescence microscopy and microcontact printing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of ECM protein selection and assay protocols.
- Adaptable to various cell types and experimental models with protocol optimization.
- Storage and handling of hydrogels must maintain hydration and sterility for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Activating the Surface of Glass Coverslips
3:42
Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels
5:50
Micropatterning Hydroxy-PAAm Hydrogels
9:09
Results: Micropatterned Hydroxy-PAAm Hydrogels Enable Independent Tuning of Mechanotransduction Cues In Vitro
10:55
Conclusion
