Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry
13 december 2013
Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.
In deze procedure wordt retinaal weefsel van muizen gebruikt om aan te tonen hoe delicaat neuraal weefsel gestabiliseerd kan worden om de structurele integriteit te behouden. Tijdens verschillende stappen van de immunohistochemische kleuring wordt het oog eerst geënucleerd, waarna het hoornvlies wordt verwijderd en de retina van de sclera wordt gescheiden. Maak incisies in de retinale oogbeker om het weefsel vlak te maken.
Bevestig vervolgens het netvlies aan een ringversterkt membraan met behulp van een zuigoverdracht zonder directe manipulatie om de integriteit van het weefsel te behouden. Breng de ring nu over naar een multi-wellplaat voor kleuring. Onze resultaten tonen aan dat deze techniek effectief kan worden toegepast in levend weefsel en een superieur substraat biedt voor de beeldvorming van synaptische eiwitten in vergelijking met bestaande methoden voor het hanteren van gedissecteerd netvlies.
Deze technieken maken de overdracht van delicaat weefsel mogelijk met minimale fysieke manipulatie. Dit vermindert de kans op vervorming en beschadiging. We bedachten dit oorspronkelijk toen we metingen moesten verrichten bij platgeprepareerd weefsel van een RD one-muis, een model voor retinale degeneratie; de retina van deze muis is extreem dun en fragiel vanwege uitgebreid celverlies veroorzaakt door de Chief-mutatie.
Een postdoc uit ons lab zal mij helpen bij het demonstreren van de procedure. Enucleer eerst de ogen van een geanestheseerde muis en breng de ogen over naar een gezuursde HEPES-gebufferde Ringer-oplossing. Om het hoornvlies te verwijderen, houdt u het oog bij de limbus vast met een pincet en snijdt u vervolgens een cirkelvormig pad langs de ora serrata.
Verwijder de lens met een pincet voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames. Gebruik een pincet met afgeronde randen om zoveel mogelijk glasvocht te verwijderen. Stabiliseer nu de oogkom door de sclera stevig met een pincet vast te houden.
Plaats een tweede pincet tussen het netvlies en de oogbeker. Beweeg het pincet langzaam langs de omtrek. Knip de oogzenuw door tussen het netvlies en de oogbeker, en verwijder de oogbeker met een schaar.
Maak incisies vanaf de perifere retina helemaal tot aan de oogzenuw. Om de volledige retina te gebruiken, kunnen er alternatief incisies worden gemaakt vanaf de periferie tot halverwege de oogzenuw om de houder te verkorten. Verwijder het overtollige deel met een draaibank.
Polijst vervolgens ruwe oppervlakken met fijn schuurpapier. Verwijder de pootjes aan de onderkant van de ring. Snijd de smalle punt van een plastic pipet af.
Breng vervolgens het weefsel met wat oplossing over naar het membraan. Verwijder de oplossing geleidelijk terwijl u de retina uitspreidt en het weefsel ontvouwt. Bevestig nu de retina aan het membraan, waarbij de ganglioncellen naar boven zijn gericht.
Snijd de houdertip van een spuit van one milliliter af en plaats deze direct onder het weefsel. Trek de zuiger terug naar een volume van ongeveer 0.3 milliliters om het weefsel fysiek in het membraan te vangen. Trek enkele borosilicaat capillaire pipetten met een weerstand van ongeveer one mega.
Breek vervolgens voorzichtig de punt van elke patchpipet af. Voeg daarna 0,3 µL van de selectine-voorraadkleuringsoplossing toe aan 10 µL van de Heaps buffered ringer-oplossing. Plaats het membraan nu in de registratiekamer die wordt geperfuseerd met warme, zuurstofrijke Heaps buffered ringer-oplossing.
Positioneer de pipet met kleurstof tegen het inner limiting membrane met behulp van een micromanipulator. Beweeg de pipet verder naar voren om het inner limiting membrane te penetreren. Injecteer vervolgens de kleuringsoplossing in de enkele of meerdere doelgebieden.
Laat het weefsel nu 10 minuten herstellen van de injectie terwijl het wordt bekeken onder epi-fluorescentieverlichting. Indien gewenst kan het insert worden overgebracht naar een kweekschaal met glazen bodem, waarbij de zijde van het netvlies naar beneden wordt geplaatst. Voeg één druppel HEPES-oplossing toe om het preparaat vochtig te houden.
Breng daarnaast drie druppels vacuümvet aan rondom de rand van de plastic ring om de insert stevig in de kweekschaal te bevestigen. Plaats de schaal na fixatie op de microscooptafel en dompel het membraan onder in de sucrosegradiëntoplossingen. Snijd het membraan uit de plastic insertring.
Verwijder zoveel mogelijk oplossing met Kim wipes en plaats het op parafilm met de retina naar boven gericht. Verplaats de parafilm met het weefsel naar de cryostaatkamer en voeg een druppel OCT-medium toe. Gebruik het quick-freezer apparaat om het invriezen te versnellen.
Los het bevroren monster los en draai het om. Snijd nu het overtollige bevroren OCT weg. Laat ongeveer twee millimeter rondom het monster aan drie zijden over en millimeters aan de zijde die aan de houder wordt bevestigd.
Bedek de blootgestelde retinale zijde met een druppel OCT, waarbij het bevestigde gedeelte vrij blijft. Vries het membraan met het retinale weefsel in. Plaats een druppel OCT op een koude houderring.
Plaats het bevroren monster onmiddellijk in de holder. Snijd secties van 10 tot 20 micron bij -19 °C en positioneer deze op warme polylysine-gecoate hechtingglaasjes. Plaats de glaasjes met de aangehechte secties gedurende twee tot drie minuten in het donker op een verwarmingsplatform van 41 °C.
Bewaar de monsters vervolgens bij -20 °C. Dit experiment illustreert een snelle en eenvoudige karakterisering van de retinale vasculatuur als een complex netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt. Door een boluslading van iso-selectine te combineren met sulforhodamine-immersielabelling, kan levend weefsel in de retina vrijwel onmiddellijk worden gevisualiseerd en gescand, waarbij bloedvaten van de oppervlakkige tot de diepe laag kunnen worden gelabeld.
In tegenstelling tot relatief goed diffundeerbare selectines, permeert SRH niet goed door het innerlijk begrenzend membraan. Er zijn verschillende voordelen aan fixatie met carbimide vergeleken met conventionele fixatie met paraformaldehyde bij het labelen van synaptische eiwitten; zo vertoonde immunofluorescente kleuring voor de synaptische marker PSD 95 in de IPL na een korte fixatieperiode met carbimide een helder punctaat uiterlijk, wat consistent was met het onderscheiden van individuele synapsen.
Daarentegen is de identificatie van de synaptische componenten minder duidelijk bij gebruik van het conventionele paraformaldehyd-fixatief. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in de cryostaatsecties van het netvlies. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u delicaat weefsel op dit membraan monteert en hoe u cytochemische kleuring op het preparaat toepast.
Het duurt 15 minuten om het netvlies aan het filter te bevestigen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de structurele beoordeling van wholemount-retina-preparaten met gebruik van retinaal weefsel van muizen. Het bevat gedetailleerde instructies voor de dissectie, het mounten en de kleuringsprocessen om de weefselintegriteit te behouden voor het beelden van synaptische eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunohistochemie
- Retinale biologie
Achtergrond
- De structurele integriteit van neuraal weefsel is cruciaal voor nauwkeurige beeldvorming.
- Bestaande methoden kunnen de weefselkwaliteit tijdens dissectie in gevaar brengen.
- Fluorescente markers verbeteren de visualisatie van cellulaire componenten.
- Een vergelijking van fixatiemethoden is essentieel voor optimale resultaten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor de preparatie van retinaal weefsel.
- Om de effectiviteit van verschillende fixatiemethoden te beoordelen.
- Om imagingtechnieken voor synaptische eiwitten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Nucleatie van het oog en verwijdering van het hoornvlies.
- Scheiding van de retina van de sclera en het platmaken van het weefsel.
- Bevestiging van de retina aan een membraan via vacuümtransfer.
- Kleuring en beeldvorming van synaptische eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol behoudt de integriteit van het weefsel effectief.
- Fluorescente markers zorgen voor een superieure visualisatie.
- Vergelijking van fixatiemethoden levert belangrijke inzichten op.
- Deze techniek is toepasbaar op live-tissue imaging.
Conclusies
- De beschreven methode verbetert de structurele beoordeling van retineweefsel.
- Het biedt een betrouwbaar substraat voor de beeldvorming van synaptische eiwitten.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere neurale weefsels.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol richt zich op een kritieke uitdaging bij de ontdekking van geneesmiddelen voor neurowetenschappen: het behouden van de structurele integriteit van fragiel neuraal weefsel tijdens immunohistochemische verwerking. Door een betrouwbare visualisatie van synaptische eiwitten en vasculaire netwerken in retinaal wholemounts mogelijk te maken, ondersteunt het de validatie van targets en mechanistische risicovermindering in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische assays door weefselvervormingsartefacten te minimaliseren die de readouts van target-engagement zouden kunnen beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de lokalisatie van synaptische eiwitten en de architectuur van de retinale vasculatuur in ziektemodellen.
- Operationele waarde: Biedt een gestabiliseerd platform voor consistente antilichaamkleuring en toediening van fluorescente markers.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste uitlezingen van synaptische marker-puncta en vasculaire netwerken.
- Operationele waarde: Compatibel met multi-well plate-formaten voor gestandaardiseerde workflows voor immunostaining en imaging.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de continuïteit van live-tissue imaging naar analyse van gefixeerd weefsel voor studies naar target engagement en pathway-modulatie.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in histologische preparaten, waardoor de reproduceerbaarheid bij preklinische beoordelingen van effectiviteit en veiligheid wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen in neuraal weefsel tot de preklinische validatie van modulator-effecten op de synaptische integriteit en vasculaire functie.
- Discovery Biology: Faciliteert mechanistische risicoreductie door duidelijke visualisatie van de distributie van synaptische eiwitten en de integriteit van de neurovasculaire eenheid mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunofluorescentie-outputs die geschikt zijn voor high-content analyse van de effecten van verbindingen op de retinale structuur.
- Analytics: Genereert puncta-dichtheid en metrieken voor het vasculaire netwerk die een vergelijkende analyse tussen experimentele condities ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om retinale synaptische en vasculaire biomarkers af te stemmen op preklinische ziekteprogressie en behandelrespons.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselstabilisatie dat toepasbaar is op meerdere neurale weefseltypen en kleuringsprotocollen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie door ondubbelzinnige synaptische en vasculaire visualisatie in fragiel neuraal weefsel.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays en verlaagt de faalpercentages bij immunohistochemische verwerking van delicate preparaten.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door het aantal fout-negatieven als gevolg van weefselschade tijdens de preparatie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve verbindingen mogelijk op basis van betrouwbare structurele en functionele read-outs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgische dissectie en technieken voor weefselbehandeling.
- Is afhankelijk van de toegang tot ring-ondersteunde gehydrofiliseerde PTFE-membranen en een zuigtransferapparaat.
- Vereist standaardisatie van fixatie-, kleurings- en beeldvormingsprotocollen tussen onderzoeksteams.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan variërende weefseldikte en fragiliteit in verschillende neurale modellen.
- Praktische beperkingen omvatten de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur om het ondersteunende membraansysteem voor te bereiden en te onderhouden.
