Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry
13 december 2013
Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.
Deze procedure gebruikt muisretinaweefsel om te demonstreren hoe kwetsbaar neuraal weefsel kan worden gestabiliseerd om de structurele integriteit te behouden. Tijdens verschillende stappen van immunohistochemisch kleuren, nucleeer eerst het oog, verwijder de hoornhuid en scheid de retina van de sclera. Maak insnijdingen in de retinale oogcup om het weefsel plat te maken.
Bevestig vervolgens de retina aan een versterkte ringmembraan met behulp van een zuigtransfer zonder directe manipulatie om de integriteit van het weefsel te behouden. Breng nu de ring over naar een multi-well plaat voor kleuring. Onze resultaten tonen aan dat deze techniek effectief kan worden gebruikt in levend weefsel en biedt een superieur substraat voor de beeldvorming van synaptische eiwitten in vergelijking met bestaande metalen voor het hanteren van gedissecteerde retina.
Deze technieken maken de overdracht van delicaat weefsel mogelijk met minimale fysieke manipulatie. Dit zal de kans op vervorming en schade verminderen. We hadden dit idee voor het eerst toen we moesten opnemen van plat gemonteerd weefsel in RD een muis, een model van retinale degeneratie, en deze muisretina zijn extreem dun en kwetsbaar vanwege uitgebreide celverlies veroorzaakt door de mutatie Chief.
Een postdoc in ons lab zal zich bij mij voegen om de procedure te demonstreren. Nucleër eerst de ogen van een verdoofde muis en breng de ogen over in geoxygeneerde hepen gebufferde ringer-oplossing. Om de hoornhuid te verwijderen, houd het oog vast bij de limbus met pincetten en snijd vervolgens een cirkelvormige baan langs de ora serrata.
Trek de lens er met pincetten uit voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames. Gebruik pincetten met een gemengde rand om zoveel mogelijk glasvocht te verwijderen. Stabiliseer nu de oogcup door de sclera stevig vast te houden met pincetten.
Plaats een tweede set pincetten tussen de retina en de oogcup. Beweeg de pincetten langzaam rond de omtrek. Snijd de oogzenuw tussen de retina en de oogcup en verwijder de oogcup met schaar.
Maak insnijdingen vanaf de retinale periferie tot aan de oogzenuw. Of, om de hele retina te gebruiken, maak insnijdingen vanaf de periferie tot halverwege de oogzenuw om de houder te verkorten. Verwijder het overtollige gedeelte met een draaibank.
Polijst vervolgens de ruwe oppervlakken met fijn schuurpapier. Verwijder de voetjes onder de ring. Snijd de smalle punt van een plastic pipette af.
Breng vervolgens het weefsel over met wat oplossing naar de membraan. Verwijder geleidelijk de oplossing terwijl je de retina uitspreidt en het weefsel ontvouwt. Bevestig nu de retina aan de membraan met de ganglioncellen naar boven.
Snijd de houdertip van een een milliliter spuit af en plaats deze direct onder het weefsel. Trek de zuiger terug tot een volume van ongeveer 0,3 milliliter om het weefsel fysiek binnenin de membraan te plaatsen. Trek enkele borosilicaat capillaire pipetten met een weerstand van ongeveer een mega.
Breek vervolgens voorzichtig de punt van elke patch pipet. Voeg vervolgens 0,3 microliter is selectin stamoplossing toe aan 10 microliter van de hepen gebufferde ringer-oplossing. Plaats nu de membraan in de opnamekamer geperfundeerd met warme geoxygeneerde hepen gebufferde ringer-oplossing.
Positioneer de pipet met kleurstof tegen de binnenste begrenzingsmembraan met behulp van een microm manipulator. Breng de pipet verder om de binnenste begrenzingsmembraan te doorboren. Injecteer vervolgens de kleurstofoplossing in de enkele of meerdere gerichte locaties.
Laat nu 10 minuten verstrijken zodat het weefsel kan herstellen van de injectie terwijl je het bekijkt onder epifluorescentie-verlichting. Indien gewenst, breng de inzet over naar een glasbodem kweekschaal en plaats deze met de retina naar beneden. Voeg een druppel heepoplossing toe om het specimen vochtig te houden.
Plaats ook drie plekken vacuümvet rond de omtrek van de plastic ring om de inzet stevig aan de kweekschaal te bevestigen. Breng de schaal over naar het microscoopplatform na fixatie, dompel de membraan onder in de sucrosegradiëntoplossingen. Verwijder de membraan uit de plastic inzetring.
Verwijder zoveel mogelijk oplossing met Kim-doekjes en plaats het op param met de retina naar boven. Breng de paraform over met het weefsel naar de cryostatkamer en voeg een druppel OCT-medium toe. Gebruik het snelvriesapparaat om het bevriezen te versnellen.
Los het bevroren monster los en draai het om. Snijd nu het overtollige bevroren OCT af. Laat ongeveer twee millimeter rond het monster op drie zijden en millimeters van de zijkant, die aan de houder zal worden bevestigd.
Bedek de blootgestelde retinale zijde met een druppel OCT en laat het gehechte gebied vrij. Bevriez de membraan met het retinale weefsel. Plaats een druppel OCT op een koude houderring.
Plaats het bevroren monster onmiddellijk in de druppel. Snijd 10 tot 20 micron secties bij minuus 19 graden Celsius en plaats ze op warme polylysine kleefschuiven. Plaats de schuieven met de gehechte secties op een 41 graden Celsius verwarmingsplatform gedurende twee tot drie minuten in het donker.
Bewaar vervolgens de monsters bij minuus 20 graden Celsius. Dit experiment illustreert een snelle en eenvoudige karakterisering van retinale vaatwand als een uitgebreid netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt. Door een boluslading van iso selectin te combineren met sulfa rumine onderdompeling labelen, kan levend weefsel bijna onmiddellijk in de retina worden gevisualiseerd en gescand, bloedvaten kunnen worden gelabeld van de oppervlakkige tot de diepe laag.
In tegenstelling tot relatief goed diffundeerbaar, permeëert SRH is selectin niet goed door de binnenste begrenzingsmembraan. Er zijn verschillende voordelen van fixatie met carbimide boven conventionele fixatie met para formaldehyde bij het labelen van synaptische eiwitten, bijvoorbeeld, na een korte periode van fixatie met carbimide immunofluorescentiekleuring voor de synaptische marker. PSD 95 in de IPL had een heldere gepuncteerde verschijning consistent met het on
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de structurele beoordeling van retinale preparaten van hele muizenretina's. Het beschrijft de dissectie, montage en kleuringsprocessen om de weefselintegriteit te behouden voor beeldvorming van synaptische eiwitten.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunohistochemie
- Retinaal onderzoek
Achtergrond
- De structurele integriteit van zenuwweefsel is cruciaal voor nauwkeurige beeldvorming.
- Bestaande methoden kunnen de weefselkwaliteit tijdens de dissectie aantasten.
- Fluorescente markers verbeteren de visualisatie van cellulaire componenten.
- Vergelijking van fixatiemethoden is essentieel voor optimale resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor de bereiding van retinale weefsels.
- Om de effectiviteit van verschillende fixatiemethoden te beoordelen.
- Om beeldvormingstechnieken voor synaptische eiwitten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Nucleatie van het oog en verwijdering van het hoornvlies.
- Afscheiding van de retina van de sclera en vlakken van het weefsel.
- Bevestiging van de retina op een membraan met behulp van zuigtransfer.
- Kleuring en beeldvorming van synaptische eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol behoudt effectief de weefselintegriteit.
- Fluorescente markers bieden superieure visualisatie.
- Vergelijking van fixatiemethoden levert belangrijke inzichten op.
- Deze techniek is toepasbaar voor beeldvorming van levend weefsel.
Conclusies
- De beschreven methode verbetert de structurele beoordeling van retinaal weefsel.
- Het biedt een betrouwbaar substraat voor de beeldvorming van synaptische eiwitten.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere neurale weefsels.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical challenge in neuroscience drug discovery: preserving the structural integrity of fragile neural tissue during immunohistochemical processing. By enabling reliable visualization of synaptic proteins and vascular networks in retinal wholemounts, it supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease models. The method enhances predictive confidence in preclinical assays by minimizing tissue distortion artifacts that could confound target engagement readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic protein localization and retinal vasculature architecture in disease models.
- Operational Value: Provides a stabilized platform for consistent antibody staining and fluorescent marker delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of synaptic marker puncta and vascular networks.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats for standardized immunostaining and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from live tissue imaging to fixed tissue analysis for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in histological preparations, improving reproducibility across preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing in neural tissue to preclinical validation of modulator effects on synaptic integrity and vascular function.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by enabling clear visualization of synaptic protein distribution and neurovascular unit integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunofluorescence outputs suitable for high-content analysis of compound effects on retinal structure.
- Analytics: Generates puncta density and vascular network metrics that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of retinal synaptic and vascular biomarkers with preclinical disease progression and treatment response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue stabilization platform applicable to multiple neural tissue types and staining protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through unambiguous synaptic and vascular visualization in fragile neural tissue.
- Operational Value: Improves assay reproducibility and reduces failure rates in immunohistochemical processing of delicate preparations.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives from tissue damage during preparation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective compounds based on reliable structural and functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and tissue handling techniques.
- Depends on access to ring-supported hydrophilized PTFE membranes and suction transfer apparatus.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols across research teams.
- Involves adaptation considerations for varying tissue thickness and fragility across neural models.
- Practical limitations include the need for specialized equipment to prepare and maintain the supporting membrane system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
