Name: Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor retinale wholemount-preparatie met muizenweefsel. Deze methode behoudt de structurele integriteit van het neurale weefsel voor beeldvorming en immunohistochemische kleuring van synaptische eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01-EY020535 (B.T.S), International Retinal Research Foundation en Karl Kirchgessner Foundation (B.T.S).

Bij alle experimentele procedures werden dieren behandeld volgens de voorschriften in de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visuel onderzoek en in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door Weill Cornell Medical College. Dieren werden geëuthanaseerd door koolstofdioxide en vervolgens cervicale dislocatie.
1. Dissectie van de gehele netvliesmontage
<ol>
	<li>Nadat de muis is geëuthanaseerd, enucleer zijn ogen en plaats ze in geoxideerde HEPES-gebufferde Ringer's oplossing (Tabel 1).</li>
	<li>Verwijder de hoornhuid door in een cirkelvormige baan langs de ora serrata te snijden met kleine schaar, waarbij het oog met pincetten bij de limbus wordt vastgehouden. Trek de lens eruit met pincetten.</li>
	<li>Verwijder zoveel mogelijk glasvocht met stompe pincetten. Deze stap is belangrijk voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames; het is niet nodig bij het uitvoeren van alleen immunohistochemie.</li>
	<li>Los het netvlies van de oogcup los door pincetten tussen het netvlies en de oogcup te plaatsen, waarbij de pincetten langzaam rond de omtrek worden bewogen. Stabiliseer de oogcup door de sclera stevig vast te houden met een tweede set pincetten. Snijd de oogzenuw op de locatie tussen het netvlies en de oogcup om de scheiding van het netvlies van de oogcup te vergemakkelijken.</li>
	<li>Het netvlies kan in stukken worden gesneden (bijv. kwartjes) of als geheel worden gebruikt. Om in stukken te snijden, gebruikt u een schaar om incisies te maken vanaf de rand van het netvlies tot aan de oogzenuw. Als u het hele netvlies wilt gebruiken, maakt u incisies vanaf de rand tot halverwege de oogzenuw. De incisies helpen om een platte voorbereiding te maken.</li>
</ol>
2. Monteren op gehydrofiliseerde PTFE-membraaninzet
<ol>
	<li>Bereid het membraan voor zoals hieronder beschreven. Wanneer fysiologische opnames of kleurstofinjectie-experimenten worden uitgevoerd, verkort de houder door een draaibank of handzaag te gebruiken, zodat de resterende ring een hoogte van 1 mm heeft. 
	Opmerking: De kweekplaatinzet kan ongewijzigd of gewijzigd zijn (Figuur 1A). De keuze van de configuratie wordt bepaald door het doel van het experiment. Voor immunokleuring is een ongewijzigde inzet geschikt.</li>
	<li>Polijst ruwe oppervlakken met fijne (300 grit of hoger) schuurpapier.</li>
	<li>(Optioneel) Verwijder de voetjes onder de ring met schaar.</li>
	<li>Om eventueel vuil te verwijderen, spoel of soniceer het membraan 2-3 min. in gedestilleerd water.</li>
	<li>Monteer het weefsel op het membraan (Figuur 1A). Plaats het weefsel met wat oplossing op de bovenkant van het membraan met een plastic overdrachtspijpje. Snijd indien nodig de smalle punt van het pijpje af, om te voorkomen dat het weefselmonster aan het pijpje blijft plakken tijdens het overbrengen.</li>
	<li>Bevestig het netvlies met ganglioncellen (GC's) omhoog: op het membraan, verwijder geleidelijk oplossing terwijl het netvlies wordt verspreid en de plooien met pincetten worden ontvouwen.</li>
	<li>Aan de andere kant van het membraan, plaats een lege spuit (1 ml) direct onder het weefsel. Breng zuiging aan door de plunjer naar achteren te trekken tot een volume van 0,2-0,3 ml. Vergroot het zuigoppervlak door de vasthoudende punt van de spuit te snijden voor gebruik. Het weefsel vereist geen verdere behandeling voor hechting, omdat het fysiek in het membraan is ingesloten.</li>
</ol>
3. Bolusinjectie van Isolectin Alexa 488
<ol>
	<li>Bereid patchpijpjes en kleurstofoplossing. Trek patchpijpjes van borosilicaat capillair glas met een Flaming/Brown puller, met een weerstand van ~1 MΩ. Breek voorzichtig de punt van het pijpje.</li>
	<li>Maak kleurstofoplossing door 0,3 μl isolectin Alexa 488 stamoplossing toe te voegen aan 10 μl van de HEPES-gebufferde Ringer's oplossing beschreven in stap 1.2.</li>
	<li>Breng monster over naar de patch-clamp opzet voor injectie (Figuur 1C). Plaats het membraan met bevestigd weefsel in de opnamekamer geperfundeerd met opgewarmde (37 °C) en geoxideerde HEPES-gebufferde Ringer's oplossing.</li>
	<li>Plaats het pijpje met kleurstof tegen de binnenste beperkende membraan (ILM, Figuur 2A). Gebruik een micromanipulator om het pijpje verder tegen het ILM te brengen tot het het doorboort. Injecteer de kleurstofoplossing met een druk van 10-20 psi gedurende 1 sec. met behulp van een picospritzer. Enkele of meerdere locaties kunnen worden aangewezen voor injectie (Figuur 2B). Als een picospritzer niet beschikbaar is, kan een 10 ml-spuit worden gebruikt om een positieve luchtdruk voor injectie te leveren.</li>
	<li>Incubeer het geïnjecteerde weefsel gedurende 10 min. Tijdens incubatie kan het geïnjecteerde weefsel onder epifluorescentie-verlichting worden bekeken.</li>
	<li>Na markering kan de voorbereiding naar een microscoop worden gebracht voor beeldvorming. Breng de inzet over naar een glasbodem kweekschaal, met de netvlieszijde naar beneden (Figuur 1C).</li>
	<li>Voeg een druppel HEPES-oplossing toe om het specimen vochtig te houden.</li>
	<li>Plaats 2-3 stippen vacuümvet rond de omtrek van de plastic ring om de inzet stevig aan de bodem van de kweekschaal te bevestigen.</li>
	<li>Breng de schaal over naar het microscoopplatform.</li>
</ol>
4. Paraformaldehyde en carbodiimide fixatie
<ol>
	<li>Fixeer het monster door de inzet over te brengen naar fixeermiddel gedurende 15 min. Langere of kortere fixatietijden kunnen worden gebruikt,

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

De hoge biocompatibiliteit en transparantie in oplossingen van de gehydrofiliseerde PTFE-membraan is voordelig bij het werken met levend weefsel. Deze voorbereiding is met succes gebruikt in eerder werk voor patch-clamp opnames van lichtreacties8-10. Hier laten we zien hoe deze aanpak kan worden toegepast voor structurele analyse van de gehele retina.
De bolus ladingstechniek kan effectief worden gebruikt voor het labelen van levend weefsel. Deze techniek wordt ondersteund door de s...

Het uitvoeren van immunohistochemie in delicate intacte weefsels brengt het risico met zich mee dat er schade ontstaat tijdens het hanteren en overbrengen. Dit kan optreden in hersenslices of ander dun weefsel, zoals gedegenereerde retina. Bovendien zijn er bepaalde methoden voor weefselfixatie die voordelig kunnen zijn voor immunokleuring van neuronale structuren, maar die resulteren in een verminderde structurele stabiliteit, waardoor hun gebruik wordt uitgesloten. Een specifiek voorbeeld hiervan is carbodiimide-gebaseerde fixatie, die superieur is voor het kleuren van receptoren en hormonen1-7, maar meestal wordt vermeden vanwege de instabiliteit van het gefixeerde weefsel.
Hier beschrijven we een procedure die een gehydrofiliseerde PTFE-membraan gebruikt om delicaat weefsel, vast of onbehandeld, structureel te ondersteunen voor een verscheidenheid aan kleuringstechnieken. Het ondersteunende membraan maakt het mogelijk om delicaat weefsel te manipuleren voor en na fixatie, wat verschillende verwerkingsstappen mogelijk maakt met minimale risico's op weefselschade. Al met al biedt deze eenvoudige methode om de weefselintegriteit te behouden de mogelijkheid om technieken te gebruiken die anders zouden kunnen worden vermeden. Als zodanig zou deze aanpak ook met succes kunnen worden gebruikt voor de voorbereiding van een breed scala aan weefsels, zoals hersenslices die broos worden na slijpprocedures.

<table><tbody><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrofiel PTFE (Biopore), 0,4 &mu;m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Insuline spuit, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>dissectie</td></tr><tr><td>Pincet, Dumont #55, roestvrij staal</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>dissectie</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>diversen</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Systeem</td><td>Nikon</td><td>diversen</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillair</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipet Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakgrond Cultuur Schotels met Glas Bodem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Eenmalige Gegradueerde Transfer Pipetten</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell platen, 24-well</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas, #1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Polysine adhesieve slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD montage medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm laboratorium film</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning high vacuum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>Ezel anti-muis Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>Isolectin Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd protocol voor retina wholemount voorbereiding voor imaging en immunohistochemistry

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Werken met delicaat weefsel kan een bemoeilijkende factor zijn bij het uitvoeren van immunohistochemische beoordeling. Hier presenteren we een methode die een ring-ondersteunde hydrofiliseerde PTFE-membraan gebruikt om structurele ondersteuning te bieden aan zowel levend als gefixeerd weefsel tijdens immunohistochemische verwerking, wat het gebruik van een verscheidenheid aan protocollen mogelijk maakt die anders schade aan het weefsel zouden veroorzaken. Eerst wordt dit gedemonstreerd met bolus-belasting van fluorescerende markers in levend retinaweefsel. Deze methode maakt snelle visualisatie van doelgerichte structuren mogelijk, terwijl de membraanondersteuning de weefselintegriteit tijdens de injectie behoudt en eenvoudige overdracht van de voorbereiding voor verdere beeldvorming of verwerking mogelijk maakt.
Ten tweede wordt een procedure voor antilichaamkleuring in weefsel gefixeerd met carbo-di-imide beschreven. Hoewel paraformaldehyde-fixatie gebruikelijker is, biedt carbo-di-imide-fixatie een superieur substraat voor de visualisatie van synaptische eiwitten. Een beperking van carbo-di-imide is dat het resulterende gefixeerde weefsel relatief kwetsbaar is; dit wordt echter overwonnen met het gebruik van de ondersteunende membraan. Retinaweefsel wordt gebruikt om deze technieken te demonstreren, maar ze kunnen worden toegepast op elk kwetsbaar weefsel.

Hier worden twee representatieve experimenten gedemonstreerd die profiteren van het gebruik van een gehydrofiliseerd PTFE-membraan om de hele retina te ondersteunen tijdens kleuringsprocedures. Het eerste experiment illustreert de methode voor een snelle en eenvoudige karakterisering van de retinale vasculatuur, een complex netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt (Figuur 2). Deze aanpak combineert bolus-belading van isolectine met immersie-labeling met SRH. Dit is een effic...

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

In deze procedure wordt retinaal weefsel van muizen gebruikt om aan te tonen hoe delicaat neuraal weefsel gestabiliseerd kan worden om de structurele integriteit te behouden. Tijdens verschillende stappen van de immunohistochemische kleuring wordt het oog eerst geënucleerd, waarna het hoornvlies wordt verwijderd en de retina van de sclera wordt gescheiden. Maak incisies in de retinale oogbeker om het weefsel vlak te maken.Bevestig vervolgens het netvlies aan een ringversterkt membraan met behulp van een zuigoverdracht zonder directe manipulatie om de integriteit van het weefsel te behouden. Breng de ring nu over naar een multi-wellplaat voor kleuring. Onze resultaten tonen aan dat deze techniek effectief kan worden toegepast in levend weefsel en een superieur substraat biedt voor de beeldvorming van synaptische eiwitten in vergelijking met bestaande methoden voor het hanteren van gedissecteerd netvlies.Deze technieken maken de overdracht van delicaat weefsel mogelijk met minimale fysieke manipulatie. Dit vermindert de kans op vervorming en beschadiging. We bedachten dit oorspronkelijk toen we metingen moesten verrichten bij platgeprepareerd weefsel van een RD one-muis, een model voor retinale degeneratie; de retina van deze muis is extreem dun en fragiel vanwege uitgebreid celverlies veroorzaakt door de Chief-mutatie.Een postdoc uit ons lab zal mij helpen bij het demonstreren van de procedure. Enucleer eerst de ogen van een geanestheseerde muis en breng de ogen over naar een gezuursde HEPES-gebufferde Ringer-oplossing. Om het hoornvlies te verwijderen, houdt u het oog bij de limbus vast met een pincet en snijdt u vervolgens een cirkelvormig pad langs de ora serrata.Verwijder de lens met een pincet voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames. Gebruik een pincet met afgeronde randen om zoveel mogelijk glasvocht te verwijderen. Stabiliseer nu de oogkom door de sclera stevig met een pincet vast te houden.Plaats een tweede pincet tussen het netvlies en de oogbeker. Beweeg het pincet langzaam langs de omtrek. Knip de oogzenuw door tussen het netvlies en de oogbeker, en verwijder de oogbeker met een schaar.Maak incisies vanaf de perifere retina helemaal tot aan de oogzenuw. Om de volledige retina te gebruiken, kunnen er alternatief incisies worden gemaakt vanaf de periferie tot halverwege de oogzenuw om de houder te verkorten. Verwijder het overtollige deel met een draaibank.Polijst vervolgens ruwe oppervlakken met fijn schuurpapier. Verwijder de pootjes aan de onderkant van de ring. Snijd de smalle punt van een plastic pipet af.Breng vervolgens het weefsel met wat oplossing over naar het membraan. Verwijder de oplossing geleidelijk terwijl u de retina uitspreidt en het weefsel ontvouwt. Bevestig nu de retina aan het membraan, waarbij de ganglioncellen naar boven zijn gericht.Snijd de houdertip van een spuit van one milliliter af en plaats deze direct onder het weefsel. Trek de zuiger terug naar een volume van ongeveer 0.3 milliliters om het weefsel fysiek in het membraan te vangen. Trek enkele borosilicaat capillaire pipetten met een weerstand van ongeveer one mega.Breek vervolgens voorzichtig de punt van elke patchpipet af. Voeg daarna 0,3 µL van de selectine-voorraadkleuringsoplossing toe aan 10 µL van de Heaps buffered ringer-oplossing. Plaats het membraan nu in de registratiekamer die wordt geperfuseerd met warme, zuurstofrijke Heaps buffered ringer-oplossing.Positioneer de pipet met kleurstof tegen het inner limiting membrane met behulp van een micromanipulator. Beweeg de pipet verder naar voren om het inner limiting membrane te penetreren. Injecteer vervolgens de kleuringsoplossing in de enkele of meerdere doelgebieden.Laat het weefsel nu 10 minuten herstellen van de injectie terwijl het wordt bekeken onder epi-fluorescentieverlichting. Indien gewenst kan het insert worden overgebracht naar een kweekschaal met glazen bodem, waarbij de zijde van het netvlies naar beneden wordt geplaatst. Voeg één druppel HEPES-oplossing toe om het preparaat vochtig te houden.Breng daarnaast drie druppels vacuümvet aan rondom de rand van de plastic ring om de insert stevig in de kweekschaal te bevestigen. Plaats de schaal na fixatie op de microscooptafel en dompel het membraan onder in de sucrosegradiëntoplossingen. Snijd het membraan uit de plastic insertring.Verwijder zoveel mogelijk oplossing met Kim wipes en plaats het op parafilm met de retina naar boven gericht. Verplaats de parafilm met het weefsel naar de cryostaatkamer en voeg een druppel OCT-medium toe. Gebruik het quick-freezer apparaat om het invriezen te versnellen.Los het bevroren monster los en draai het om. Snijd nu het overtollige bevroren OCT weg. Laat ongeveer twee millimeter rondom het monster aan drie zijden over en millimeters aan de zijde die aan de houder wordt bevestigd.Bedek de blootgestelde retinale zijde met een druppel OCT, waarbij het bevestigde gedeelte vrij blijft. Vries het membraan met het retinale weefsel in. Plaats een druppel OCT op een koude houderring.Plaats het bevroren monster onmiddellijk in de holder. Snijd secties van 10 tot 20 micron bij -19 °C en positioneer deze op warme polylysine-gecoate hechtingglaasjes. Plaats de glaasjes met de aangehechte secties gedurende twee tot drie minuten in het donker op een verwarmingsplatform van 41 °C.Bewaar de monsters vervolgens bij -20 °C. Dit experiment illustreert een snelle en eenvoudige karakterisering van de retinale vasculatuur als een complex netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt. Door een boluslading van iso-selectine te combineren met sulforhodamine-immersielabelling, kan levend weefsel in de retina vrijwel onmiddellijk worden gevisualiseerd en gescand, waarbij bloedvaten van de oppervlakkige tot de diepe laag kunnen worden gelabeld.In tegenstelling tot relatief goed diffundeerbare selectines, permeert SRH niet goed door het innerlijk begrenzend membraan. Er zijn verschillende voordelen aan fixatie met carbimide vergeleken met conventionele fixatie met paraformaldehyde bij het labelen van synaptische eiwitten; zo vertoonde immunofluorescente kleuring voor de synaptische marker PSD 95 in de IPL na een korte fixatieperiode met carbimide een helder punctaat uiterlijk, wat consistent was met het onderscheiden van individuele synapsen.Daarentegen is de identificatie van de synaptische componenten minder duidelijk bij gebruik van het conventionele paraformaldehyd-fixatief. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in de cryostaatsecties van het netvlies. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u delicaat weefsel op dit membraan monteert en hoe u cytochemische kleuring op het preparaat toepast.Het duurt 15 minuten om het netvlies aan het filter te bevestigen.

optimized-protocol-for-retinal-wholemount-preparation-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Methanol kan worden gebruikt als een hulpmedium voor retinale preparaten voor de gehele montage van het netvlies en langdurige opslag, wat nuttig is voor het onderzoek van retinale ganglioncellen.

Op methanol gebaseerd hele-mountpreparaat voor het onderzoek van retinale ganglioncellen

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie, met de nadruk op de structurele kenmerken van retinale fotoreceptorterminals.

Voorbereiding van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde en uitgebreide voorbereidingsprocedure voor retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het is geschikt voor toepassingen waarbij synapsen in volwassen retinale organoïden worden geanalyseerd.

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.

Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Leer een geoptimaliseerd protocol voor retinale wholemount-preparatie met muizenweefsel. Deze methode behoudt de structurele integriteit van het neurale weefsel voor beeldvorming en immunohistochemische kleuring van synaptische eiwitten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Meer video's verkennen