Name: Long Term Chronische Pseudomonas aeruginosa Luchtweginfectie in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Leer de agar-beads methode om chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie in muizen te bestuderen. Deze techniek maakt stabiele bacteriële belasting gedurende één maand mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in BRAGONZI het laboratorium is gefinancierd door de Italiaanse Cystic Fibrosis Stichting (CFaCore) en EU-F7-2009-223670. Een deel van dit werk werd uitgevoerd in ALEMBIC, een geavanceerde microscopie laboratorium, en de muis histopathologie werd uitgevoerd in de eenheid van de pathologische anatomie (San Raffaele Wetenschappelijk Instituut).

1. Voorbereiden van Bacteriën voor chronische infectie (drie en twee dagen voorafgaand aan Mouse Challenge) <ol><li> Selecteer de juiste P. aeruginosa stam te testen. </li><li> Inoculeren een lusvol P. aeruginosa uit een -80 ° C voorraad cultuur een trypticasesoja Agar (TSA) plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> Kies een enkele kolonie en te enten in 5 ml trypticasesoja Bouillon (TSB) in een 15 ml snap-buisje en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht in een incubator schudden bij 200 rpm. </li></ol> 2. Inbedding Bacteriën in Agar Kralen voor chronische infectie (een dag voor infectie) <ol><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid bacteriële cultuur overnacht, 1:50 verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm. </li><li> Verdun de nachtelijke bacteriecultuur door toevoeging van 2 OD in een nieuw-snap buisje met 20 ml vers TSB. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer 3 -4 uur naar fase loggen in een incubator schudden bij 200 rpm, tot een totaal van 10-15 OD is bereikt. </li><li> Ondertussen bereidt de TSA, van TSB met 1,5% agar, autoclaaf en equilibreren bij 50 ° C in een waterbad. Equilibreer 150 ml preautoclaved zware minerale olie in een Erlenmeyer kolf bij 50 ° C in een waterbad. </li><li> Zodra P. aeruginosa bereikt de log-fase, verzamel de bacteriële cellen door centrifugeren bij 2700 g gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer de bacteriële pellet in 1 ml steriele PBS en vortex grondig de pellet volledig resuspenderen. </li><li> Meng 1 ml bacteriële suspensie met 9 ml vloeibaar TSA vooraf geëquilibreerd bij 50 ° C. </li><li> Voeg de 10 ml TSA-P. aeruginosa mengsel zware minerale olie (voorverwarmd bij 50 ° C) en onmiddellijk roeren gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. De agitatie moet zichtbaar vortex produceren in de olie. </li><li> Koel het mengsel tot 4 ° C, roeren bij minimale spoodzaak van 35 min (figuur 1). </li><li> Laat de agar-kralen-oliemengsel in ijs voor een extra 20 minuten. </li><li> Breng de agar-korrels in 50 ml Falcon buizen en centrifugeer bij 2700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Nauwkeurig verwijderen minerale olie en wassen met steriele PBS zesmaal, zoals beschreven in stap 2.11. Na drie wassingen, kunnen de kralen worden gepelleteerd door zwaartekracht plaats van de centrifuge. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de agar-kralen in 20-30 ml PBS. </li><li> Neem een ​​monster van de korrels (ongeveer 0,5 ml) en aseptisch gehomogeniseerd. </li><li> Neem 100 ul van de gehomogeniseerde kralen en verdunnen in 900 pi steriel PBS. Serieel verdunnen 1:10 tot 10 -6. </li><li> Plaat seriële verdunning op TSA-platen, zoals onverdund monster tot 10 -6 platen en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Meet de kraal diameter met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop op verschillende gebieden. De kraal diameter moet tussen 100-200 pm ( <strong&gt; Figuur 1). </li><li> Bewaar de korrels overnacht bij 4 ° C. </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figuur 1. Overzicht van de agar kralen voorbereiding en muis infectie. P. aeruginosa cellen worden geresuspendeerd in 1 ml PBS en toegevoegd aan 9 ml vloeibaar TSA (50 ° C). Dit mengsel wordt toegevoegd aan 150 ml van zware minerale olie bij 50 ° C in een kolf en geroerd bij hoge snelheid gedurende 6 min bij kamertemperatuur geroerd. Wanneer de kolf wordt afgekoeld tot 4 ° C met langzaam roeren voor 35 min, stolt de agar creëren kralen en bacteriën in het mengsel worden ingebed in de agar korrels. Detail van een agar parelbevattende bacteriële cellen wordt getoond (A). Na het verwijderen van de minerale olie met enkele wasbeurten met steriele PBS, de agar-kralen ophanging is klaar fof enting in de longen van muizen door een intratracheaal injectie (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . 3. Muizen Challenge met Agar-kralen Ethiek Verklaring: Dit protocol en experimenten volg de richtlijnen van het dier zorg en ethische commissie van San Raffaele Wetenschappelijk Instituut. <ol><li> Tel het aantal kolonievormende eenheden (CFU) op TSA platen om het aantal KVE / ml te bepalen in de agar-korrels suspensie. Verdun de agar-kralen met steriele PBS tot 2-4 x 10 7 CFU / ml een optimale inoculum van 1-2 x 10 6 bereikt in 50 pl. </li><li> Verdoven C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 weken oud) mannelijke muizen met ketamine (50 mg / ml) en xylazine (5 mg / ml) in 0,9% NaCl bij een volume van 0,002 ml / g lichaamsgewicht toegediend door intraperitoneale injectie. OPMERKING: Anesthesie wordt beschouwd adeqUate wanneer het dier blijft nog steeds rustig, niet reageert op externe prikkels, en constant hart en ademfrequentie. </li><li> Plaats de muis in rugligging. Ontsmet de vacht van de muis met 70% ethanol. </li><li> Expose de luchtpijp van een verticale snede van de huid en intuberen de trachea met een steriele, flexibele 22 G 0,9 mm x 25 mm IV-katheter, waarbij de aandacht op het stilet verwijderen terwijl naar beneden in de luchtpijp. Plaats de katheter niet te diep in de luchtpijp. Stoppen voor het bereiken van de Carina (vertakking). </li><li> Onmiddellijk een volume van 50 ul van agar kraal schorsing door een 1 ml spuit en bevestig deze aan de katheter. Duw de zuiger van de spuit, waardoor de kralen te worden geïmplanteerd in de longen. Sluit de incisie met hechtmateriaal clips. </li><li> Plaats het dier op een verwarmingselement tot helemaal wakker. </li></ol> 4. Muizen Evaluatie <ol><li> Let op de muizen dagelijks op klinische tekenen zoals vacht kwaliteit, houding,ambulation en vochthuishouding. Monitor dagelijks lichaamsgewicht. Muizen die ≥ 20% lichaamsgewicht verliezen moeten worden gedood. </li><li> Volg Punt 5 voor het verzamelen van bronchoalveolaire lavage vloeistof (BAL) en de punten 6 of 7 voor de inzameling van de longen en de analyse van de totale CFU, histologische analyse, ontstekingsreactie in termen van totale en gedifferentieerde telling van de cellen in de BAL, cytokine-analyse, en myeloperoxidaseactiviteit (MPO). </li></ol> 5. BAL Fluid verzameling en analyse <ol><li> Euthanaseren de muizen door CO 2 inhalatie. </li><li> Plaats de muis in rugligging. Ontsmet de vacht van de muis met 70% ethanol. </li><li> Expose de luchtpijp en de borstkas door een verticale snede van de huid. Expose de longen door het snijden van het middenrif. </li><li> Plaats een hechtdraad onder de luchtpijp met een pincet en intuberen de luchtpijp met een steriele, flexibele 22 g 0.9 mm x 25 mm IV katheter. Trek de twee uiteinden van de hechtdraad aan de ca bindentheter naar de luchtpijp en knoop de draad rond de luchtpijp. </li><li> Neem een ​​volume van 1 ml RPMI 1640 met een spuit 1 ml en hechten aan de katheter. Duw de zuiger van de spuit naar de longen te wassen en onmiddellijk de vloeistof te herstellen, op te slaan in een 15 ml buis. OPMERKING: Als cytokines worden geanalyseerd, voeg proteaseremmers aan RPMI 1640. </li><li> Herhaal deze stap drie keer met in totaal 3 ml RPMI. Van nu af aan, slaan de BAL-vloeistof op het ijs. Ga naar stap 6 voor de verzameling en analyse van de longen. OPMERKING: Houd er rekening mee dat niet alle van de vloeistof zal worden opgehaald (2.8 maximaal ml). </li><li> Voor kwantificering van bacteriën in de BAL-vloeistof, een kleine hoeveelheid monster (300 pl), serieel verdund 1:10 in steriele PBS, plaat op TSA platen en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. </li><li> Telling totale cellen met een omgekeerde licht optische microscoop verdunning een hoeveelheid van de BAS vloeistof 01:02 met Tuerk oplossing in een Burker cellen kamer. </li><li> Centrifugeer de remaining BAS vloeistof bij 330 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Neem de bovenstaande vloeistof voor ELISA cytokine analyse, bewaart bij -80 ° C. Volg de stappen 5,10-5,13 voor differentiële telling cel door cytospin. </li><li> Als de pellet is rood, lyseren de erytrocyten resuspenderen de pellet in 250-300 ul van RBC lysebuffer 1:10 verdund in ultra-puur gedestilleerd water gedurende 3 minuten. Neutraliseren met 2 ml PBS en centrifugeer bij 330 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in RPMI 10% foetaal runderserum (FBS). Gebruik een volume met 1 x 10 6 cellen / ml, gebaseerd op het totale aantal cellen zal. </li><li> Plaats objectglaasjes en filters in geschikte sleuven in de Cytospin de kartonnen filters naar het midden van de Cytospin. Pipetteer 150 ul van elk monster in de juiste putjes van de Cytospin centrifuge en in een cytocentrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Stain dia&#39;s door Romanowsky kleuring met behulp van een commerciële kit, volgens de mainstructies brikant en zoals eerder 12 beschreven. Volg de stappen 5,14-5,17 voor MPO activiteit analyse. </li><li> Centrifugeer de resterende hoeveelheid BAL 380 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl hexadecyltrimethylammoniumbromide chloride 0,5% in ultra-zuiver gedestilleerd water om de cellen te lyseren. De suspensie bij -20 ° C worden bevroren verscheidene dagen voordat de test. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en gebruik de supernatant MPO bepaling uitgevoerd in 96-well platen, toevoegen van het monster in tweevoud in elk putje en indien nodig, ook goede verdunningen van het monster. </li><li> In elk monster in de putjes een gelijk volume van 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) als substraat voor peroxidase. Laat de reactie plaatsvindt in het donker gedurende ten minste 5 minuten en totdat er geen verdere ontwikkeling van de kleur. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 2 MH 2 SO 4 eennd het meten van de OD bij 450 nm. De OD-waarde recht evenredig aan peroxidase activiteit. </li></ol> 6. Meting van van bacteriën in Lung and Cytokine Analyse <ol><li> Onmiddellijk na het verzamelen BAS vloeistof, accijnzen longen van de muis, spoel ze in steriele PBS, afzonderlijke lobben, leg ze in een ronde bodem buis met 2 ml steriele PBS en op te slaan op ijs. OPMERKING: Als cytokines worden geanalyseerd, voeg proteaseremmers aan PBS aan de buizen. </li><li> Aseptisch homogeniseren longen, neemt een kleine hoeveelheid (300 ul) van het homogenaat, serieel verdund 1:10 in PBS, plaat op TSA platen en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. Houdt u er rekening mee dat het totale luchtweg bacteriële verontreiniging van de som van de CFU&#39;s gevonden in BAL vloeistof en longen zal zijn. </li><li> Centrifugeer de resterende homogenaat bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Neem de bovenstaande vloeistof voor ELISA cytokine analyse, en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 7. Histologisch onderzoek &lt;ol&gt; <li> Voer histologische analyse alleen de longen waarin BAS vloeistof niet is verzameld, long aspecten en eigenschappen behoudt. </li><li> Euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie. </li><li> Expose de borstkas door een verticale snede van de huid, bloot de longen door het snijden van het middenrif. </li><li> Accijnzen longen, spoel ze in PBS, scheiden de lobben, leg ze in een buisje met 5-10 ml 10% neutraal gebufferde formaline (4% formaldehyde) en bewaar bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li><li> Embed longen in paraffine, met standaardprocedures. </li><li> Snijd 5 micrometer dikke secties met behulp van een microtoom. </li><li> Stain dia met hematoxyline en eosine en bedekken de dia&#39;s met een dekglaasje, volgens standaard procedures. </li><li> Onderzoek dia&#39;s met behulp van een omgekeerde helderveld microscoop en het verwerven van beelden door het aansluiten van de microscoop naar een camera. </li></ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De kritische stappen in de P. aeruginosa-kralen voorbereiding en muis uitdaging worden hieronder vermeld. De P. aeruginosa stam gebruikt voor muizen uitdaging is van cruciaal belang. Sterfte, chronische infectie of klaring kan aanzienlijk verschillen afhankelijk van de bacteriestam die voor de uitdaging. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige...

Cystische fibrose (CF) is een genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) gen. Dit gen codeert voor een chloride kanaal tot expressie gebracht op het membraan van de meeste epitheelcellen. Bronchiëctasieën, slijm plugging en parenchymcellen vernietiging voornamelijk veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa infecties geleidelijk leiden tot ernstige longziekte en sterfte in de meeste van de CF-patiënten 1. Inzicht CF pathogenese en verdere ontwikkeling van nieuwe therapieën afhankelijk diermodel met karakteristieke kenmerken van CF. Verscheidene muizen, genetisch gemodificeerd voor het CFTR gen, zijn gegenereerd, maar beperkingen in het vermogen van deze soorten CF-achtige longziekte en diverse andere organen afwijkingen waargenomen bij CF-patiënten herhalen zijn gedocumenteerd 2. Ontwikkeling van de infectie is een van de grote uitdagingen in de CF diermodel. De literatuur clvroeg suggereert dat een chronische infectie die langer dan een maand kan alleen worden bereikt als muizen worden geënt met bacteriën ingebed in een immobiliseringsmiddel zoals agar, agarose, of zeewier alginaat 3-5. Deze immobiliseren agents de micro-aërobe / anaërobe omstandigheden waarmee bacteriën om te groeien in de vorm van microkolonies, vergelijkbaar met de groei in het slijm van CF-patiënten 6. Dit model van chronische infectie leidt tot de persistentie van de bacteriën in de longen veroorzaakt luchtwegontsteking en beschadiging 7. Afhankelijk van de gebruikte methode, de bacteriestam geïnoculeerd en de dosis in de longen, het percentage chronische geïnfecteerde muizen en de bacteriële verontreiniging teruggevonden in de longen op verschillende tijdstippen kunnen aanzienlijk verschillen. Met name de belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na uitdaging, hetgeen that bacteriecellen geleidelijk gewist door de gastheer. Door het selecteren van P. aeruginosa RP73 klinische stam uit een verzameling van CF isoleert 8 we met succes lage sterfte, meer ernstige letsels, en hoog percentage van chronische infectie verkregen met een stabiele bacteriële verontreiniging tot een maand in C57Bl/6NCrl muizen. Dit document beschrijft de methodiek voor het inbedden van P. aeruginosa in de agar kralen, we hebben geïnfecteerde muizen intratracheale instillatie, gemeten de bacteriële verontreiniging en cytokines in de longen, verzameld BAL vloeistof en uitgevoerd histologisch onderzoek. Over het algemeen zal dit protocol onderzoekers te helpen bij het ​​aanpakken van fundamenteel belangrijke vragen over pathogenese 8,9 en testen van nieuwe therapieën tegen P. aeruginosa chronische infectie 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Heavy mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-Ketamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe 25 G 5/8 in&nbsp;0.5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, Iris, 11 cm, straight</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Suture clips</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Complete protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk solution</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky staining set</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96-well EIA/RIA plate</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3&rsquo;,5,5&rsquo;- Tetramethylbenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral buffered formalin</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin plus alcoholic solution</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Low Cost Heating Pad</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization probe</td><td>Ystral</td><td>2366925(small)</td><td></td></tr><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Camera (microscope)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

long term chronische<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; luchtweginfectie in muizen

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Een muismodel van chronische luchtweg infectie is een belangrijke troef bij cystic fibrosis (CF) onderzoek, maar er zijn een aantal problemen met betrekking tot het model zelf. Vroege fasen van ontsteking en infectie zijn uitgebreid bestudeerd met de Pseudomonas aeruginosa agar-kralen muismodel, terwijl slechts weinig verslagen gericht op de lange termijn chronische infectie in vivo. De belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na prikkeling, hetgeen aangeeft dat bacteriële cellen progressief worden gewist door de gastheer. Dit document presenteert een werkwijze voor het verkrijgen van efficiënte langdurige chronische infectie in muizen. Deze methode is gebaseerd op de inbedding van de P. klinische aeruginosa stammen in de agar-kralen in vitro, gevolgd door intratracheale indruppeling in C57Bl/6NCrl muizen. Bilaterale longinfectie wordt geassocieerd met SEVmene meetbare read-outs waaronder gewichtsverlies, sterfte, chronische infectie, en ontstekingsreactie. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige letsels, en hogere chronische infectie. P. aeruginosa kolonisatie kunnen blijven bestaan ​​in de long voor meer dan drie maanden. Murine longpathologie lijkt op die van CF patiënten met geavanceerde chronische longziekte. Dit muizenmodel dichtst bootst het verloop van de ziekte bij de mens kan worden gebruikt voor zowel onderzoek naar de pathogenese en de evaluatie van nieuwe therapieën.

Wanneer het protocol correct wordt gedaan, de P. aeruginosa agar-beads 100-200 urn meten en kan met een omgekeerde lichtmicroscoop worden nageleefd door pipetteren een klein volume van het agar-korrels suspensie op een dia. Enkele bacteriële cellen zichtbaar in de agar korrels, zoals in detail getoond in figuur 1. De keuze van P. aeruginosa stam gebruikt in de agar-korrels preparaat kritisch. Figuur 2 en Tabel 1 tonen de ge...

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen van een persistente, langdurige chronische luchtweginfectie met pseudomonas aerogen bij muizen. Dit wordt bereikt door eerst de geselecteerde bacteriële stam van pseudomonas aerogen te kweken. De tweede stap is het inkapselen van de bacteriën in kleine agarbolletjes door de bacteriën te mengen met agar en minerale olie bij 50 °C, om vervolgens het mengsel af te koelen tot 4 °C onder langzaam, continu roeren.Vervolgens wordt de minerale olie verwijderd door meerdere wasbeurten met PBS en wordt een aliquot van de agarkralen gehomogeniseerd en op agagarplaten geplaatst. Om het bacteriële gehalte te bepalen, is de laatste stap het injecteren van enkele microliters van de agarkralensuspensie in de trachea van muizen om een chronische Pseudomonas aerogen longinfectie te induceren. Uiteindelijk kunnen bronchoalveolaire lavagevloeistof en longen op verschillende tijdstippen na de challenge worden teruggewonnen en op agarplaten worden geplaatst om het percentage chronisch geïnfecteerde muizen en de bacteriële load in de luchtwegen van overlevende muizen vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van deze agarkralenmethoden ten o

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Stel een chronische bacteriële infectie muismodel met...

Chronisch Salmonella Infected Muis Model

Source: de Vries, C. R., et.al. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the delayed inoculation of luminescent Pseudomonas aeruginosa into a mouse bearing two full-thickness dorsal skin wounds covered by a transparent film dressing. This facilitates biofilm formation and the establishment of chronic infection. Regular bioluminescence monitoring enables quantification of bacterial burden and tracking of infection...

Developing a Mouse Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Skin Wound Infection 

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Deze studie beschrijft de succesvolle generatie voor een nieuwe diermodel van chronische obstructieve longziekte (COPD) door muizen aan hoge concentraties van ozon herhaaldelijk bloot te leggen.

Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

We beschrijven een vertraagd inentingsprotocol voor het genereren van chronische wondinfecties bij immunocompetente muizen.

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Dit manuscript beschrijft de opstelling van een infectieus model van longontsteking bij muizen en de respectieve karakterisering van letselresolutie, samen met methoden voor het kweken van bacteriën en intratracheale instillatie. Een nieuwe benadering met behulp van hoogdimensionale flowcytometrie om het immuunlandschap te evalueren, wordt ook beschreven.

Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Muizen zijn over het algemeen resistent tegen infecties door Mycobacterium abscessus, wat de ontdekking en ontwikkeling van de broodnodige antibiotica tegen longinfecties bemoeilijkt. Hier beschrijven we een methode van inoculumbereiding en intratracheale infectie waarvan is aangetoond dat deze een aanhoudende infectie veroorzaakt bij immunocompetente muizen.

Bereiding van in agarkraal ingebedde Mycobacterium abscessus om immunocompetente muizen intratracheaal te inoculeren

Hier presenteren we een protocol voor het opzetten van een immunosuppressiemodel voor muissepsis via intranasale installatie van Klebsiella pneumoniae en valideren we het model aan de hand van verschillende indicatoren.

Vestiging van een door muis sepsis geïnduceerd immunosuppressiemodel door intranasale instillatie van bacteriën

Leer de agar-beads methode om chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie in muizen te bestuderen. Deze techniek maakt stabiele bacteriële belasting gedurende één maand mogelijk.

Long Term Chronische

Meer video's verkennen