Long Term Chronische

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen van een persistente, langdurige chronische luchtweginfectie met pseudomonas aerogen bij muizen. Dit wordt bereikt door eerst de geselecteerde bacteriële stam van pseudomonas aerogen te kweken. De tweede stap is het inkapselen van de bacteriën in kleine agarbolletjes door de bacteriën te mengen met agar en minerale olie bij 50 °C, om vervolgens het mengsel af te koelen tot 4 °C onder langzaam, continu roeren.

Vervolgens wordt de minerale olie verwijderd door meerdere wasbeurten met PBS en wordt een aliquot van de agarkralen gehomogeniseerd en op agagarplaten geplaatst. Om het bacteriële gehalte te bepalen, is de laatste stap het injecteren van enkele microliters van de agarkralensuspensie in de trachea van muizen om een chronische Pseudomonas aerogen longinfectie te induceren. Uiteindelijk kunnen bronchoalveolaire lavagevloeistof en longen op verschillende tijdstippen na de challenge worden teruggewonnen en op agarplaten worden geplaatst om het percentage chronisch geïnfecteerde muizen en de bacteriële load in de luchtwegen van overlevende muizen vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van deze agarkralenmethoden ten opzichte van bestaande methoden is dat ze een stabiele langdurige chronische infectie bij een hoog percentage muizen mogelijk maken, wat leidt tot de persistentie van een stabiele bacteriële load tot één maand.

De AGA-agar-methode creëert in de long van de muis de micro-aerobe conditie die bacteriën in staat stelt om te groeien in de vorm van microkolonies. Vergelijkbaar met de groei in het slijm van patiënten met cystische fibrose, kunnen deze methoden onderzoekers helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de pathogenese van cystische fibrose en andere luchtwegaandoeningen, en bij het testen van nieuwe therapieën tegen Pseudomonas aeruginosa chronische longinfecties. De methoden kunnen ook worden gebruikt om chronische infecties met andere pathogenen te bereiken, inclusief Burkholderia cepacia of Staphylococcus aureus co-infecties met verschillende pathogenen, of competitie-experimenten. De procedure wordt gedemonstreerd door Pheno, een postdoc, en Camille Riva, een promovendus in mijn laboratorium. Inoculeer drie dagen voorafgaand aan de uitdaging van de muis een lus vol Pseudomonas aeruginosa vanuit de -80 °C stockcultuur op een triptikasoy-agarplaat en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C.

De volgende dag. Selecteer een enkele kolonie die is geïnoculeerd in vijf milliliter tryptikas-sojabouillon en gedurende de nacht bij 37 °C is geïncubeerd in een schudincubator bij 200 RPM. Verdun de volgende ochtend een kleine aliquot van de overnight-bacteriecultuur in fosfaatgebufferde saline in een verhouding van 1:50. Meet vervolgens de optische dichtheid bij 600 nanometer.

Verdun vervolgens de overnight bacteriële kweek door twee OD van de bacteriële suspensie toe te voegen aan een nieuwe buis met 20 milliliters verse TSB en incubeer dit gedurende ongeveer drie tot vier uur tot de log-fase in een schuddende incubator op 37 degrees Celsius bij 200 RPM, totdat een totale OD van 10 tot 50 is bereikt. Zodra Pseudomonas aeruginosa de log-fase bereikt, worden de bacteriële cellen geoogst door centrifugatie bij 2 700 ×g gedurende 15 minuten bij vier degrees Celsius, waarna het supernatant wordt weggegooid. Daarna.

Resuspendeer het bacteriële pellet in één milliliter steriele PBS en vortex thoroughly om het volledig te resuspenderen. Meng vervolgens één milliliter van de bacteriële suspensie met negen milliliters vloeibare TSA die is geëquilibreerd op 50 °C. Voeg dit mengsel toe aan de voorverwarmde zware minerale olie op 50 °C.

Roer onmiddellijk zes minuten lang bij kamertemperatuur. De agitatie moet een zichtbare vortex in de olie veroorzaken. Koel het mengsel vervolgens af tot 4 °C, waarbij 35 minuten lang op de minimale snelheid wordt geroerd.

Laat het geheel vervolgens nog 20 minuten rusten in ijs. Breng daarna de agar-beads over naar 50 milliliter falcon-buisjes en centrifugeer 15 minuten bij 2 700 ×g bij vier graden Celsius.

Verwijder de minerale olie nauwkeurig en was het pellet met agarbeads met steriele PBS. Herhaal de procedure zes keer na drie wasbeurten. De beads kunnen na de laatste wasbeurt door zwaartekracht worden gepellet in plaats van met gebruik van de centrifuge.

Resuspendeer de agar-beads aseptisch in 20 tot 30 milliliter PBS en homogeniseer 0,5 milliliter van de beads. Verdun vervolgens 100 microliter van de gehomogeniseerde beads in 900 microliter steriele PBS en voer seriële verdunningen uit. Verdun de beads zes keer in een verhouding van 1:10 tot een verdunningsfactor van 10⁻⁶.

Plate vervolgens de seriële verdunningen op de TSA-platen, inclusief de onverdunde monsters. Verdun de monsters tot 10⁻⁶ en incubeer de platen bij 37 °C. Meet de diameter van de kralen met een omgekeerde lichtmicroscoop in verschillende velden.

De diameter van de kraaltjes moet tussen 100 en 200 micron liggen vóór de challenge van de muizen. Tel het aantal colony forming units op de TSA-platen om het aantal CFU per milliliter in de agar-kraal-suspensie te bepalen. Pas vervolgens het volume van de agar-kraaltjes aan naar twee tot vier keer 10⁷ CFU per milliliter om een optimaal inoculum van één tot twee keer 10⁶ in 50 µL te bereiken.

Plaats een mannelijke muis van zes tot acht weken oud, die vooraf is geanestheseerd met ketamine en xylazine, in rugligging op een warmtemat en desinfecteer de vacht met 70% ethanol. Leg de trachea vrij door een verticale incisie in de huid. Gebruik vervolgens een pincet om de spieren die de trachea bedekken te scheiden.

Neem vervolgens tot 50 µL van de agarbeadsuspensie op met een spuit van 1 mL. Intubeer daarna de trachea met een katheter en bevestig de spuit van 1 mL met de agarbeadsuspensie aan de katheter. Druk voorzichtig op de zuiger van de spuit om de beads in de long te implanteren.

Sluit vervolgens de incisie met hechtclips. In deze stap wordt de geëuthanaseerde muis in rugligging geplaatst en wordt de vacht gedesinfecteerd met 70% ethanol.

Leg vervolgens de trachea en de borstkas vrij door een verticale incisie in de huid te maken. Leg daarna de longen vrij door het diafragma door te snijden. Plaats met een pincet een hechtdraad onder de trachea en intubeer de trachea met een katheter.

Trek vervolgens de twee uiteinden van de hechtdraad aan om de katheter aan de trachea te binden, en niet de draad rond de trachea. Neem nu één milliliter van het celkweekmedium met een spuit van één milliliter en bevestig deze aan de katheter. Druk de zuiger van de spuit in om de longen te spoelen, vang de vloeistof onmiddellijk op en bewaar deze in een buis van 15 milliliter.

Herhaal deze stap drie keer met in totaal drie milliliter medium, en bewaar vervolgens het bronchoalveolaire lavagevloeistof op ijs voor de inzameling en analyse van de longen. Exiceer de longen uit de muis. Spoel deze met steriele PBS.

Scheid vervolgens de lobben. Plaats deze in een kolf met ronde bodem met 2 mL steriele PBS en bewaar op ijs. Homogeniseer de longen aseptisch en in serie.

Verdun het homogenaat in PBS in een verhouding van één op 10. Plaat vervolgens seriële verdunningen, inclusief het onverdunde monster, op de TSA-platen en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C. Haal het BAL-vloeistof van het ijs en verdun het met Turk-oplossing in een verhouding van één op twee onder een omgekeerde licht-optische microscoop.

Tel het totale aantal cellen in een Burker-telkamer voor een differentiële celtelling. Centrifugeer het BAL-vloeistof bij 330 ×g gedurende acht minuten bij 4 °C. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het pellet tot een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter in celcultuurmedium dat 10% foetaal runderserum bevat. Plaats de microscopische objectglazen en filters in de juiste sleuven van de cytocentrifuge, met de kartonfilters naar het midden gericht.

Pipetteer 150 µL van elk monster in de overeenkomstige putjes van de cytospin en centrifugeer in een cytocentrifuge bij 300 ×g gedurende vijf minuten. Vervolgens moet een celspot worden waargenomen, waarna na kleuring van de spot een differentiële telling onder de microscoop kan worden uitgevoerd. Deze figuur toont het verloop in de tijd van een chronische Pseudomonas aerogenosa-infectie met de referentiestam PAO1 en RP73.

Klinische stam voor elk tijdstip. De histogrammen representeren het sterftepercentage veroorzaakt door bacteriëmie in het rood en de overleving in het grijs, of het percentage dieren dat de infectie heeft opgeruimd in het wit, en diegenen die in staat waren een chronische infectie te ontwikkelen in het groen. De klinische stam Pseudomonas aerogen RP 73 is efficiënter in het vestigen van een chronische infectie vergeleken met de laboratoriumstam PA oh one.

De overlevende muizen werden geëuthanaseerd op de aangegeven tijdstippen en de longen werden geoogst, gehomogeniseerd en geplaatst op TSA-platen om de bacteriële load te bepalen. De groeicurves van de P oh one- en RP 73-stammen in de muizenlongen laten zien dat de hoeveelheid bacteriën drie dagen na infectie hoger is voor P oh one vergeleken met RP 73. Vanaf zeven dagen, wanneer de chronische infectie is vastgesteld, stabiliseert de bacteriële load zich tussen 10⁴ en 10⁵ CFU per long voor beide stammen; na zeven dagen chronische infectie met de RP 73-klinische stam werd de rekrutering van inflammatoire cellen in het BAL-vloeistof geëvalueerd.

Het totale aantal leukocyten is aanzienlijk hoger bij muizen geïnfecteerd met RP 73 vergeleken met niet-geïnfecteerde muizen. De meest vertegenwoordigde cellen zijn neutrofielen, wat duidt op een aanzienlijke respons van het aangeboren immuunsysteem op de chronische infectie. In het onderstaande kader geven de pijlen neutrofielen en een macrofaag aan, zoals te zien is in een spot op een objectglas na cytospin.

Hier worden hematoxyline- en eosinekleuringen getoond op histologische coupes van muizenlongen na zeven dagen chronische infectie met rp. 73 klinische stam; kralen, aangegeven door pijlen, zijn waarneembaar in het bronchiale lumen en microkolonies van bacteriële cellen. In de geïnfecteerde gebieden worden de bronchiën en het pulmonaal parenchym gekenmerkt door een massale rekrutering van ontstekingscellen.

Terwijl de luchtwegen van een niet-geïnfecteerde muis vrij waren van inflammatoire cellen, zijn de diameter en de uiteindelijke concentratie van de BES zeer belangrijke details. Om een goed resultaat te bereiken, is het belangrijk om te onthouden dat de grootte wordt beïnvloed door de roersnelheid tijdens de koelfase, en dat de beginhoeveelheid bacteriën de uiteindelijke verdunning van de beads kan beïnvloeden. Bovendien zal de selectie van een passende Pseudomonas-stam, die een lage mortaliteit bij muizen en een hoog percentage chronische infectie veroorzaakt, het aantal gebruikte muizen minimaliseren.

Na de infectie van de muizen wordt de bacteriële count uitgevoerd. Daarnaast kunnen de ontstekingsreactie in termen van totaal en differentieel celgetal, het VIR-niveau in de bronchiën, cytokineanalyse van het vloeistof, een myeloperoxidase-assay en histologische analyse worden uitgevoerd om de ulceratierespons op de bacteriële infectie te bestuderen. Vergeet niet dat werken met opportunistische pathogenen zoals pseudomonas risico's kan inhouden en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, het hanteren van bacteriën onder een veiligheidskast en het gebruik van steriele technieken.

De ontwikkeling van geschikte diermodellen maakte preklinisch onderzoek naar nieuwe antibacteriële en ontstekingsremmende moleculen mogelijk. Dit is een belangrijke stap voor toekomstige therapeutische interventies bij longinfecties bij patiënten met cystische fibrose of andere respiratoire aandoeningen.