Name: Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer endotheelcellen isoleren uit embryonale voorhersenen voor onderzoek naar cerebrale angiogenese en neurovasculaire interacties. Deze methode genereert zuivere celculturen voor gedetailleerde studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD) Young Investigator Award en de National Institutes of Health verlenen R01NS073635 naar AV.

1. Bereiding van reagentia en oplossingen <ol><li> Coating van 35 mm kweekschaal: collageen type 1 oplossing wordt geleverd als een waterige oplossing van 20 mM azijnzuur (-100 mg eiwit / flacon). Verdun een zodanige hoeveelheid van collageen oplossing om een ​​werkende concentratie van 0,01% met behulp van steriele weefselkweek kwaliteit water. Coat gerechten met 1 ml collageenoplossing voor 3-4 uur bij kamertemperatuur (KT) of 37 ° C of overnacht bij 2-8 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de gecoate schaal en laat het een nacht drogen. Spoel de schotel met weefselkweek kwaliteit water of PBS voor het toevoegen van media. Gecoate gerechten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand. </li><li> Bereid compleet Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM). Vul het DMEM (500 ml) met 10% FBS en antibiotica-antimycotische oplossing (1x concentratie 1 ml/100 ml). Volledige DMEM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden. </li><li> Bereid een aliquot (50 ml) DMEM met DNase I (0,001 mg / ml) (hierna DMEM-DNase I). </li><li> Een volgende hoeveelheid (10 ml) DMEM met collagenase en dispase (1 mg / ml) (hierna DMEM-collagenase/dispase). </li><li> Bereid endotheelcellen kweekmedium (ECCM 500 ml), aangevuld met EGF (5 ug), ECGS (100 mg) en 5 ul van antibiotica-antimycotische oplossing. ECCM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden. </li><li> Voorverwarmen alle media voor gebruik. </li><li> Bereid Zuivering buffer: PBS, pH 7,2 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Houd buffer koud (2-8 ° C). </li></ol> 2. Verwijdering van embryo&#39;s en Dissection van Telencephalon Alle experimenten met proefdieren zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies van McLean Hospital en voldoen aan de NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. <ol><li> Gebruik getimede zwangere CD1-muizen (embryonale dag 15). De dag van de vaginale plug ontdekking wordt beschouwd als embryonale dag 0 (E0). CD1 dammen produceren over het algemeen grote nesten, zo 10-12 embryos worden verwacht van een zwangere dam. </li><li> Voor hysterotomie verdoven zwangere muizen een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Voor muizen ongeveer 20-30 g, levert 0,3 ml van een 10 ml / kg ketamine / xylazine anestheticum en waarborgen die pijn en ongemak is minimaal tijdens intraperitoneale injecties van verdoving. Gebruik de hand terughoudendheid voor de injecties. </li><li> Controleer diepe verdoving door teen knijpen. Verwijder embryo&#39;s uit diep verdoofde muizen. Onthoofden elk embryo onmiddellijk na verwijdering uit de moeder. Plaats de embryonale hoofden in steriele petrischaaltjes in ijskoud PBS. </li><li> Volg hysterectomie door directe euthanasie met verdoving overdosis (130 mg / kg pentobarbital, ip), een methode voor euthanasie, die in overeenstemming is met de AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition. </li><li> Onder een stereomicroscoop, verwijder de hersenen uit het hoofd met fijne microtip schaar en fijn pincet. Opmerking: Een hoge kwaliteit ontledenion is essentieel om succesvol te verwijderen de pial membraan van de embryonale hersenen. Dit wordt bereikt door de praktijk. Fijn pincet en microtip scharen zijn ook belangrijke instrumenten voor het verkrijgen van een goede dissectie. </li><li> Gebruik de tang om een ​​stevige grip op de hersenen en de microtip schaar naar afpellen de pial membraan. Verwijder het mesencephalon en metencephalon en isoleren het telencephalon. Transfer pial-vrij grote hersenen van alle embryo&#39;s naar een 35 mm cultuur schotel met 2 ml PBS in ijs. </li></ol> 3. Celisolatie <ol><li> Hak het telencephalon in 1-2 mm fragmenten met een scalpel en verzamel weefsel in een 15 ml Falcon buis met 2 ml compleet DMEM. </li><li> Distantiëren weefsel grondig, maar voorzichtig met een pipet 1 ml tot klonten verdwijnen en een melkachtige suspensie wordt bereikt. </li><li> Centrifugeer gedissocieerde cellen bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer pellet in DMEM-DNase I. voorzichtig distantiëren de cells opnieuw met 1 ml pipet en centrifugeer bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet in warme compleet DMEM. Filter cellen door een steriele 70 um nylon gaas. Verzamel gefilterde cellen en in het ijs te houden. </li><li> Verzamel de cel-gedeelten van het gaas gehouden en verteren verder met DMEM-collagenase/dispase (2 ml) gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen 3x in DMEM-DNase I door centrifugatie bij 800-1000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zwembad deze cellen met de gefilterde cellen in stap 3.5 verzameld. Was de totale cellen eenmaal met complete DMEM. Ga verder met het aantal cellen en magnetische etikettering stappen te bepalen. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​enkele-celsuspensie voor magnetische kenmerken te verkrijgen. </li></ol> 4. Magnetische Labeling <ol><li> Dit protocol geeft de magnetische kenmerken van 10 7 cellen. Voor cel aantallen lager dan 10 7, gebruiken dezelfde reagens volume en voor mobiele nummers van meer dan 10 7, opschalen alle reagens volumes en het totale volumedienovereenkomstig (bijv. voor 2 x 10 7 totaal cellen, gebruik twee keer het volume van alle aangegeven reagentia). Houd alle reagentia en cellen in ijs. </li><li> Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. </li><li> Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren supernatans volledig. </li><li> Voeg 90 μl/10 7 cellen zuivering buffer om de celpellet gevolgd door 10 ul CD31 microbolletjes. De Microbeads verstrekt door de fabrikant worden geconjugeerd anti-muis CD31 antilichaam monoklonale. </li><li> Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast. Opmerking: Hogere temperaturen en / of langere incubatietijd gedurende magnetische kenmerken kan leiden tot niet-specifieke binding. </li><li> Was de cellen door toevoeging van 1-2 ml/10 7 cellen zuivering buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer cellen in 500 ui buffer zuivering. Ga verder met magnetische afscheiding of zuiveringsstap. </li></ol> 5. Puhet zuiveren <ol><li> Plaats MS kolom in het magneetveld van MACS Separator. </li><li> Kolom spoelen met 500 ul van zuivering buffer. </li><li> Breng celsuspensie op de kolom. Plaats geschikt aantal cellen naar MS kolom als hoger aantal cellen in de kolom kunnen verstoppen. Let op: Elke kolom MS is geschikt voor een maximum aantal van 2 x 10 7 cellen, voor een groter aantal cellen, gebruiken meer kolommen. </li><li> Verzamelen en gooi flow-through met ongelabelde cellen. </li><li> Waskolom met 500 ui buffer zuivering driemaal. Tijdens het wassen stappen, zorg ervoor dat de kolom reservoir leeg is voordat het toevoegen daaropvolgende zuivering buffer porties. </li><li> Verwijder kolom uit de MACS separator en plaats deze op een 15 ml Falcon buis. </li><li> Een plunjer wordt geleverd samen met de kolom MS. Pipetteer 1 ml van zuivering buffer op de kolom MS en onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. </li><li> Plaat celIs op een 35 mm kweekschaal vooraf bekleed met collageen type 1 en groeien cellen ECCM in een incubator ingesteld op 37 ° C met 95% O2 en 5% CO2. </li><li> Verander het medium om de vier dagen. Gebruik PVECs voor experimenten of subcultuur na 10-12 dagen wanneer het gerecht is samenvloeiing. </li></ol> 6. Subcultuur van PV ECS <ol><li> Verwijder de ECCM en spoel de monolaag van PVECS met 1-2 ml steriel PBS. </li><li> Voeg voorzichtig 1,5 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing om de cel monolaag bedekken. </li><li> Breng het gerecht aan de incubator. Binnen 5-7 minuten, zullen cellen los van het oppervlak van de schotel. </li><li> Nadat de cellen losgemaakt, onmiddellijk een gelijk volume trypsine remmer toe en vermaal meerdere malen. </li><li> Breng de cellen naar een steriele 15 ml Falcon buis. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml voorverwarmd ECCM. </li><li> Zaad de cellen voor het uitbreiden van de cultuur, imveroudering of andere testen. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

PVEC zijn meer fysiologisch relevante dan volwassen hersenen endotheelcellen en EC&#39;s uit ander weefsel bronnen voor onderzoek gericht op neurovasculaire interacties en ook therapeutisch potentieel. Voor PVEC voorbereiding, is het essentieel begin met dissectie snel werken om een ​​goede levensvatbaarheid te bereiken, aangezien de dode cellen niet-specifiek kan binden aan CD31 microbolletjes. Bovendien, als eencellige suspensie niet bereikt voordat de magnetische etiket stap resulteert dit in problemen omdat celklont...

Angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn kritieke gebeurtenissen in het centrale zenuwstelsel (CNS) ontwikkeling, herstel en regeneratie. Verschillende elegante studies hebben aangetoond dat endotheelcellen stimuleert neuronale proliferatie en vice versa door afgifte van oplosbare factoren en door direct contact. We vonden het merkwaardig dat in de meerderheid van deze studies 1-3, terwijl neuronale voorlopercellen / neurale stamcellen worden geïsoleerd uit de embryonale hersenen, worden ze gekweekt samen met endotheliale cellen van de volwassen hersenen, andere volwassen weefsel bronnen of endotheliale cellijnen. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de technische moeilijkheden bij het isoleren en kweken van zuivere populaties van endotheelcellen van embryonale hersenen. Echter, angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn gelijktijdige gebeurtenissen in ordes van grootte meer robuust in de embryonale hersenen dan in de normale volwassen hersenen. De periventriculaire vasculaire netwerk van de embryonic voorhersenen (grote hersenen) afkomstig uit een vat geplaatst in de basale ganglia primordium en ontwikkelt in de vorm van een ordelijke gradiënt van ventraal grote hersenen, rug van embryonale dag 11 (E11) 4,5. Deze plexus van schepen van de periventriculaire vasculaire netwerk zijn te onderscheiden van pial schepen op basis van afkomst, anatomische locatie, groeipatronen en ontwikkelingsregulatie 4,5. De richting van de voortplanting van de periventriculaire angiogenese verloop overeenkomt met de telencephalic dwarse neurogenetische verloop. Binnen de grote hersenen, de periventriculaire angiogenese gradiënt en het verloop van GABA neuronen migreren tangentiaal overlapt ruimtelijk en 6. Met betrekking tot de timing, de angiogenese gradiënt is op voorhand van de neurogenetische gradiënt en GABA neuron gradiënt met ongeveer een dag. Zo periventriculaire endotheelcellen zijn in ruimte en tijd goed gepositioneerd om kritische aanwijzingen te verstrekken aan telencephalic neurogenese ondersteunen enneuronale migratie 4,6. Daarom zou het gebruik van embryonale periventricular endotheelcellen in coculture experimenten met neuronale voorlopercellen en / of neuronen een gunstiger model voor het bestuderen neurovasculaire interacties en het ontwikkelen van nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekte of ischemische / traumatisch hersenletsel te bieden. We benadrukken het belang van het verwijderen van de pial membraan, niet alleen om epitheliale besmetting cel te beperken, maar ook om pial endotheelcellen die moleculair en functioneel verschillend van endotheelcellen van de periventriculaire vasculaire netwerk 4,6 (genoemd PVECs te onderscheiden van pial EC&#39;s) zijn te scheiden . Hier beschrijven we de methode die we regelmatig gebruiken in ons laboratorium een ​​rijke en zuivere opbrengst van PVECs verkrijgen. Deze endotheelcellen zijn bereid uit embryonale voorhersenen geïsoleerd uit een getimede-zwangere muis. Zij kunnen worden uitgebreid gesubkweekt en neer bevroren succes voor toekomstig gebruik.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagen, Type 1 solution from rat tail&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Quality Biologicals</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MS column</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD31 microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS multi stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro;m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiotic and antimycotic solution</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Culture dish</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ECCM kit</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>Kit Includes Endotheelcel groeisupplement, EGF en Sojaboon trypsine-remmer</td></tr><tr><td>Endotheelcel groeisupplement (ECGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>Cell Applications</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Weefselkweek kwaliteit water</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25% Trypsine</td><td>Life Technologies</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sojaboon trypsine-remmer</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotinyleerde Isolectin B4 antilichaam</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Von Willebrand factor</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hardset Montagemedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein Animal Health Supply</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fijne microtip schaar</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonale hersenen endotheelcellen kan dienen als een belangrijk instrument in de studie van angiogenese en neurovasculaire ontwikkeling en interacties. De twee vasculaire netwerken van de embryonale voorhersenen, pial en periventriculaire, zijn ruimtelijk onderscheidend en hebben een verschillende herkomst en groeipatronen. Endotheliale cellen van de pial en periventriculaire vasculaire netwerken hebben unieke genexpressie profielen en functies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor isolatie, cultuur en verificatie van zuivere populaties van endotheelcellen uit de periventriculaire vasculaire netwerk (PVECs) van de embryonale voorhersenen (grote hersenen). In deze benadering wordt telencephalon zonder pial membraan verkregen uit embryonale dag 15 muizen gehakt, gedigereerd met collagenase / dispase en mechanisch gedispergeerd in een enkele celsuspensie. PVECs worden gezuiverd van celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-CD-31/PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan microbolletjes met behulp van een sterk magnetischscheidingsmethode. Gezuiverde cellen worden gekweekt op collageen 1 gecoate cultuur gerechten in endotheelcellen kweekmedium totdat ze samenvloeiing en verder gesubkweekt. PVECs verkregen met dit protocol tentoonstelling kasseien en spil gevormd fenotypes, zoals gevisualiseerd door fase-contrast licht microscopie en fluorescentie microscopie. Zuiverheid van PVEC culturen werd opgericht met endotheelcellen markers. In onze handen, deze methode betrouwbaar en consistent levert zuivere populaties van PVECs. Dit protocol zal profiteren studies gericht op het verkrijgen van mechanistische inzichten in voorhersenen angiogenese, het begrijpen PVEC interacties, en cross-gesprekken met neuronale celtypes en heeft enorm potentieel voor therapeutische angiogenese.

De fenotypische karakterisatie van PVECs van dag 1-12 wordt getoond door fase-contrast lichtmicroscopie (figuur 2). De cellen die aan de schotel op dag 1 laten zien morfologie kenmerk van celdeling (Figuur 2A). Tussen de 5-8 dagen, PVECs overgang van kasseien op gevormde morfologie typisch voor endotheelcellen en meer verwant aan de in vivo toestand (figuren 2B en 2C) spindel. Per dag 12 de PVEC cultuur behaalt volledige samenvloeiing (...

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van zuivere culturen van endotheelcellen uit foetale hersenen om cerebrale angiogenese en neurovasculaire interacties te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het peelmembraan te verwijderen en het cephalon uit de foetale hersenen te isoleren. De tweede stap van de procedure is het produceren van een enkelcellige suspensie door middel van dissociatie, filtratie en digestie van het geoogste weefsel.De derde stap is het magnetisch labelen van de cellen met CD 31 microbeads. De laatste stappen zijn het zuiveren van de CD 31-gelabelde cellen door magnetische scheiding en het vervolgens kweken ervan. Uiteindelijk worden zuivere populaties paraventriculaire endotheelcellen gegenereerd voor verdere studie via immunofluorescentiemicroscopie en angiogenese-assays.Deze methode zal ten goede komen aan studies die zich richten op cellulaire en moleculaire mechanismen. Voor hersenanalyses kan het dienen als instrument voor het verduidelijken van interacties tussen ventriculaire endotheelcellen en de kruisbestuiving met neuronale celtypen. Het biedt daarnaast een enorm potentieel voor therapeutische analysemissies.De demonstratie van deze methode is essentieel om enkele technische moeilijkheden weg te nemen die gepaard gaan met het isoleren en kweken van zuivere populaties endotheelcellen uit de embryonale hersenen. Voor dit protocol worden de koppen van E 15 pups van CD1-moederdieren in ijskoud PBS onder een stereomicroscoop geplaatst. Verwijder de hersenen met fijne microtip-scharen en fijne pincetten.Een goede dissectie is essentieel en wordt bereikt door oefening en door het gereedschap in uitstekende conditie te houden. Gebruik vervolgens de pincet om de hersenen stevig vast te pakken en de microtip-schaar om het vlies weg te pellen. Deze stap is de meest uitdagende van de procedure, maar de benodigde vaardigheden komen met oefening.Verwijder vervolgens het mesencephalon en het metencephalon. Isoleer het cephalon. Breng dit daarna, vrij van het peel-membraan, over naar een kweekschaal van 35 millimeter met twee milliliters PBS op ijs.Verzamel alle klauwen in één schaal. Begin met het fijnmaal van de klauwen tot fragmenten van één of twee millimeter met een scalpelmesje. Verzamel het weefsel in een buisje van 15 milliliter met twee milliliter compleet DMEM.Dissocieer het weefsel voorzichtig maar grondig door te pipetteren met een pipette van één milliliter tot de klonten verdwijnen en een melkachtige suspensie is verkregen. Centrifugeer de suspensie bij 800 tot 1000 G gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur voorzichtig het supernatant door aspiratie en resuspendeer.Suspendeer het pellet in DMEM met DS one. Dissocieer de cellen vervolgens opnieuw door middel van voorzichtig pipetteren en herhaal de centrifugatiestap. Resuspendeer het pellet daarna in opgewarmd compleet DMEM.Filter de gesuspendeerde cellen door een nylon gaas van 70 micron en verzamel de celporties die op het gaas zijn achtergebleven en verteer deze verder in twee milliliters DMEM met collagenase en dis bays. Wacht een paar minuten en was vervolgens het weefsel. Drie tot behulp van centrifugatie en resuspensie van de pellet in DMEM met DS one pool, de gewassen collectie met het filtraat op ijs bewaard.Was vervolgens de combinatie met volledig DMEM middels centrifugatie en resuspendeer. Bepaal nu het aantal cellen met een hemocytometer en ga verder met de magnetische labeling. De volumes in dit protocol zijn geschikt voor maximaal 10 miljoen cellen. Schaal deze naar boven voor grotere aantallen cellen.Begin met het centrifugeren van de celsuspensie bij 300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, aspireer het supernatant volledig en voeg 90 µL gekoelde purificatiebuffer toe aan de celpellet, gevolgd door 10 µL CD 31-geconjugeerde micro-beads. Meng de cellen goed met een 200 µL pipette en incubeer de suspensie 15 minuten in een koelkast, maar niet langer, zodat de labeling specifiek blijft. Was de cellen door één tot twee mL gekoelde purificatiebuffer toe te voegen en te centrifugeren bij 300 G gedurende 10 minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 microliters gekoelde zuiveringsbuffer. Plaats nu een MS-kolom in het magnetische veld van de max separator. Spoel de kolom vervolgens uit met 500 microliters zuiveringsbuffer op kamertemperatuur.Breng vervolgens de celsuspensie aan op de kolom. Deze is geschikt voor maximaal 20 miljoen cellen. Verzamel en gooi al het doorstroomvolume dat de ongelabelde cellen bevat weg.Was de kolom drie keer met 500 µL zuiveringsbuffer. Zorg er altijd voor dat het reservoir van de kolom leeg is voordat volgende aliquots zuiveringsbuffer worden toegevoegd. Verwijder nu de kolom uit de max separator en plaats deze op een buis van 15 mL.Voeg één milliliter zuiveringsbuffer toe aan de kolom en spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk uit door de meegeleverde zuiger stevig in de kolomplaat te duwen. De uitgespoelde cellen bevinden zich op een 35 millimeter kweekschaal die vooraf is gecoat met collageen type one.Kweek de cellen nu met ECCM in een incubator ingesteld op 37 °C met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Verschoon het medium elke vier dagen. Observeer de groeiende cellen in de kweekschaal dagelijks via een microscoop.De fenotypische karakterisering van periventriculaire endotheelcellen of PVE CS verandert van dag 1 tot dag 12, zoals waargenomen via fasecontrastlichtmicroscopie. De cellen die op dag één aan het schaaltje hechten, vertonen tussen dag vijf en acht een morfologie die karakteristiek is voor celdeling. De PVE CS gaan over van een klinkerachtige naar een spoelvormige morfologie, wat typisch is voor endotheelcellen en meer overeenkomt met hun in vivo-toestand.Tegen dag 12 bereikt de PVEC-kweek volledige confluentie. De pvs kunnen gemakkelijk worden gesubcultured om de kolonie na subcultuur uit te breiden.De zuiverheid van de endotheliale celculturen werd vastgesteld op 100% met behulp van de volgende endotheliale celmarkers: ISO-lectine, von Willebrand-factor, CD31, PEcam-1 en VE-cadherine. Afbeeldingen bij hoge vergroting van PVC's, geprepareerd uit CD1-embryo's alsmede uit Tie2-GFP-embryo's waarvan de endotheliale cellen GFP tot expressie brachten, werden gelabeld met ISO-lectine. Ze vertoonden de gebruikelijke kasseistenen- en spoelvormige morfologieën, evenals polygonale morfologieën met slanke uitlopers in sommige met collageen gecoate kweekschalen. In afwezigheid van Matrigel vormden pve-CS roosterpatronen die lijken op de unieke kenmerken van het in vivo periventriculaire vasculaire netwerk.Dit weerspiegelt het hoge angiogene potentieel van pve. Cs.An angiogenese-assay werd uitgevoerd waarbij 20.000 PVE CS werden toegevoegd aan kweekschalen gecoat met matrix gel matrix. Deze PV Cs vertoonden een robuuste buikvorming binnen 18 uur.Langetermijnstudie van pve CS, inclusief migratie, motiliteitmorfologie, celfunctie-assays, cũng als in vivo-experimenten, is mogelijk door PV versus uit CD one-embryo's geïsoleerde cellen te labelen met Q dot-nanokristallen. Deze nanokristallen zorgen voor een intense, stabiele fluorescentie in het cytoplasma van levende cellen.Pve EECS kunnen worden getransfecteerd met celtracers zoals cell light plasma membrane. RFP back MAM 2.0 wordt gebruikt voor een duidelijke visualisatie van de celmorfologie in live-cell imaging experimenten. Pve CS werden gekweekt in verschillende media en de celmorfologie werd vergeleken middels fasecontrastmicroscopie en ISO selectine vóór de kleuring.Terwijl PV CS gekweekt in ECCM een spoelvormige morfologie vertoonden en tegen dag 12 confluent waren, vertoonden pve CS gekweekt in groeimedium voor endotheliale cellen van de rattenhersenen een zeer langgerekte morfologie en waren deze tegen dag 20 confluent. Aan de andere kant vertoonden PV CS gekweekt in D-M-E-M-F 12-medium uitsluitend een platte en polygonale morfologie zonder spoelvorming, hadden ze een zeer snelle groei en waren ze tegen dag vier confluent.PVEC's zijn in ECCM gekweekt gedurende maximaal drie passages zonder verlies van fenotype en functie. Daarom is ECCM het voorkeurmedium voor de PVEC-cultuur. Zodra deze techniek onder de knie is, kan dit proces in drie uur worden voltooid mits het correct wordt uitgevoerd.Co-cultuur van periventriculaire endotheelcellen met neuronale precursors stimuleert neurogenese en neuronale migratie waarschijnlijk veel effectiever dan endotheelcellen uit het volwassen brein of andere bronnen. Ze kunnen daarom waardevol zijn bij het ondersteunen van het herstel van neurologische functies in veel verschillende scenario's.

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

This video demonstrates a protocol to induce the differentiation of induced pluripotent stem cells into brain endothelial cells.

Generating Brain Endothelial Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

De vasculaire endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij veel belangrijke cardiovasculaire aandoeningen. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren en uit te breiden van de muisaorta zonder het gebruik van speciale apparatuur. Ons protocol biedt een effectieve manier om mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Leer endotheelcellen isoleren uit embryonale voorhersenen voor onderzoek naar cerebrale angiogenese en neurovasculaire interacties. Deze methode genereert zuivere celculturen voor gedetailleerde studies.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Meer video's verkennen