Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Het algemene doel van het volgende experiment is om een shear-adhesiekaart van celpartikel-adhesie te verkrijgen uit één enkel experiment met behulp van synthetische microvasculaire netwerken. Dit wordt bereikt door het microfluïdische apparaat eerst te coaten met het eiwit van belang, in dit geval avadon. Als tweede stap worden gebiotineerde partikels bij fysiologische shear-snelheden in het apparaat geïnjecteerd, die binden aan het met avadon gecoate apparaat met differentiële patronen afhankelijk van de lokale shear-snelheden.

Vervolgens wordt het aantal gebonden deeltjes geteld om een shear-adhesiekaart van de deeltjes te genereren met behulp van een computationeel gecreëerde database van shear-rate-waarden in het netwerk. De resultaten tonen aan dat een shear-adhesiekaart kan worden verkregen uit een enkel experiment, wat resulteert in een aanzienlijke besparing van tijd en reagentia in vergelijking met conventionele parallelle plaatstroomkamers. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van bestaande methoden, zoals lineaire stroomkanalen, is dat we shear-adhesiekaarten kunnen genereren uit één enkel experiment, wat leidt tot een aanzienlijke besparing in kosten en tijd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van geneesmiddelentoediening, zoals het vermogen van dragers voor geneesmiddelen om te binden aan de gewenste doelwitten. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we paddle plate flow chambers gebruikten om celparticulaire laesies te begrijpen. Onder vloeistofomstandigheden is de focus van deze assay echter om basisinzichten te verschaffen in de adhesie van partikels en cellen.

Het syn vivo-platform kan worden toegepast op een verscheidenheid aan andere systemen, zoals kanker en levering aan het CZS, infectie en ontsteking, trombose en microcirculatoire dysfunctie. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen van het microfluidische apparaat moeilijk aan te leren zijn, het wennen aan kleine monstervolumes tijd kost en de best practices om bubbelvorming te voorkomen beter visueel gecommuniceerd kunnen worden. De procedure wordt gedemonstreerd door Ashley Smith, een research scientist uit ons laboratorium.

Het SynVivo SMN microfluidische apparaat bestaat uit twee sets parallelle poorten, één voor het instromen van oppervlaktecoatings, groepen en/of cellen voor fixatie, en de andere voor het uitvoeren van de assay. Dompel het apparaat om te beginnen volledig onder in een Petrischaal met steriel gedeïoniseerd water en plaats de schaal in een vacuüm. Laat de desiccatie doorgaan totdat alle lucht uit de kanalen van het apparaat is verwijderd.

Dit zou ongeveer 15 minuten moeten duren voordat het apparaat uit het water wordt gehaald. Gebruik fijne pincetten om met water geprimede tigon-slangen in elke poort van het apparaat te plaatsen. De slangen moeten ongeveer één inch lang zijn.

Het apparaat kan nu met een pipet of spuit uit het water worden verwijderd. Plaats een druppel water rond de basis van een van de slangetjes van de inlaatpoort. Verwijder het slangetje voorzichtig.

De waterdruppel voorkomt dat er lucht in het apparaat komt. Bereid vervolgens een spuit van één milliliter voor, gevuld met avadon in een concentratie van 20 µg/mL. Verbind de spuit met een roestvrijstalen naald van 24 gauge en slang. Klem de niet gebruikte inlaatpoort af met een klem.

Plaats de slang in de inlaatpoort van het apparaat. Injecteer avadon met een stroomsnelheid van 1 µL per minuut gedurende 10 minuten om volledige perfusie van het apparaat mogelijk te maken. Aan het einde van de stroomtijd.

Klem alle slangetjes af met klemmen en plaats het apparaat een nacht bij vier graden. Laat het apparaat op kamertemperatuur komen. Plaats het apparaat vervolgens op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde tafel en een hogeresolutiecamera.

Bereid een oplossing van biotinyleerbare deeltjes van twee micron voor met een concentratie van 5 miljoen deeltjes per milliliter in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Laad de deeltjes in een spuit van één milliliter. Bereid een tweede spuit van één milliliter met PBS.

Plaats elke spuit op een spuitpomp en verbind deze vervolgens met de naald en slang menggunakan een pipetspuit. Plaats een druppel water rond de basis van de slang van de inlaatpoort en verwijder voorzichtig de slang die is gebruikt om het apparaat te coaten. Voeg voorzichtig de slangen voor de gebiotineerde deeltjes en voor PBS toe aan elke inlaatpoort.

Begin vervolgens met het injecteren van gebiotinylerde deeltjes met een stroomsnelheid van 2,5 µL per minuut. Controleer de inlaatpoort onder de microscoop bij de eerste tekenen van deeltjes. Start de timer en handhaaf de stroom gedurende drie minuten.

Stop na drie minuten de stroom van gebiotinyleerde deeltjes terwijl u gelijktijdig de stroom PBS start met een debiet van 2,5 µL per minuut. Laat de PBS gedurende drie minuten door het device stromen om ongebonden deeltjes weg te spoelen. Om te beginnen met de acquisitie, gebruikt u de functie 'scan large image' in de imaging-software om een afbeelding van het gehele device te maken; nummer vervolgens opeenvolgend de vertakkingen in het device en creëer een circulair interessegebied met een diameter die tweemaal die van de kanalen bedraagt.

Stel in dit geval de diameter van het interessegebied in op 200 micron, aangezien de diameter van het kanaal 100 micron is. Gebruik de geautomatiseerde tel-functie in de imaging-software om het aantal deeltjes in elk interessegebied naar een spreadsheet te exporteren. Gebruik op dezelfde manier de geautomatiseerde tel-functie om het aantal deeltjes in het gehele device te exporteren.

CFD-simulaties worden uitgevoerd en de resultaten worden opgeslagen in een database voor verdere analyse. De informatie in de resultaten bevat wandafschuifsnelheden, de flux van snelheidspartikels en de adhesie aan het device. Deze informatie wordt gebruikt om het aantal particuall die hechten in elk gebied van belang te bepalen, uitgaande van een gedefinieerde input voor de partikelconcentratie.

Om een afschuifadhesiekaart te genereren, berekent u als laatste stap het adhesiepercentage zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Zet de afschuifadhesiekaart uit met de afschuifsnelheid bij elke vertakking van de netwerken en de waarden voor het adhesiepercentage. Deze afbeelding toont een typisch avidan-gecoat syn vivo SMN-apparaat na binding van twee micron biotinylated particles.

Let op dat deeltjes bij voorkeur hechten nabij de vertakkingen in het netwerk. De genummerde vertakkingen in het syn vivo SMN-netwerk zijn hier te zien. Deze afbeelding is de voorbeeldkaart van de wandschuifspanning gegenereerd door het CFD-model van het apparaat.

De afschuifsnelheid varieert in het apparaat van 250 s⁻¹ tot 15 s⁻¹, zoals waargenomen in de microvasculatuur in vivo. Merk op dat deze variërende afschuifsnelheden niet gelijktijdig kunnen worden bereikt in lineaire microfluïdische kanalen, aangezien deze een constante afschuifsnelheid bieden voor elke debietwaarde. De hier getoonde grafiek van de afschuifsnelheidswaarden bij elke vertakking van het netwerk laat zien dat de patronen van de afschuifsnelheid complex zijn en, in tegenstelling tot lineaire stroomkanalen, niet via een eenvoudige analytische relatie kunnen worden verkregen.

Bovendien zijn er meerdere vertakkingen in het netwerk aanwezig die in dezelfde shear-bin vallen, wat bijdraagt aan de statistische betrouwbaarheid van de getoonde gegevens. Hier volgen voorbeeldresultaten van de CFD-analyse voor partikelstromen in het netwerk, die worden gebruikt om de partikelstromen in de takken en vertakkingen van het experimentele netwerk te berekenen.

De afschuifadhesiekaart die is berekend uit een enkel syn vivo SMN-experiment volgt de omgekeerde relatie zoals waargenomen in afschuifadhesiekaarten verkregen uit lineaire kanaalexperimenten. Echter, met een SynVivo-assay maakt één enkel experiment de generatie van deze afschuifkaart mogelijk, terwijl voor de lineaire kanalen meerdere experimentele runs worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe SynVivo SMN-apparaten kunnen worden gebruikt voor het genereren van de gedeelde adhesie uit een enkel experiment.

Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om te onthouden dat er na de ontwikkeling geen luchtbellen in het SynVivo SMN microfluïdische apparaat mogen komen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van inflammatie om de interactie tussen leukocyten en het endotheel bij verschillende afschuifsnelheden in één enkel experiment te bestuderen. In de volgende generatie apparaten kunnen onderzoekers de rolling, adhesie en migratie van leukocyten in een enkele assay bestuderen, iets wat momenteel nog niet mogelijk is.

Na deze procedure kunnen andere methoden voor het onderzoeken van de adhesie van geneesmiddelen, drug-delivery-systemen en cellen worden uitgevoerd om vragen te onderzoeken zoals het fysiologische effect van stroming op cel-cel-, cel-geneesmiddel- en geneesmiddel-voertuigadhesie.