Name: Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het genereren van afschuifhechtingskaarten met synthetische microvasculaire netwerken. Deze technologie bespaart tijd en reagentia door één enkel experiment te gebruiken in plaats van meerdere conventionele stromingskamers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SynVivo technologie werd ontwikkeld in het kader van subsidie ​​# 2R44HL076034 van de NHLBI.

1. Priming de SynVivo-SMN Microfluidic Device <ol><li> Elke poort (ingang / uitgang) van de inrichting bestaat uit twee parallelle poorten - een voor stromen in oppervlaktecoating eenheden (adhesiemoleculen groei matrices, enz.) en / of cellen voor het zaaien en de andere voor het uitvoeren van de test (Figuur 1A ). </li><li> Volledig onderdompelen SynVivo-SMN microfluïdische apparaat (Figuur 1B) in een petrischaal met steriel gedeïoniseerd (DI) water en plaats de schaal in een vacuüm exsiccator. Laat de exsiccator lopen totdat alle lucht uit de kanalen van de inrichting. Dit moet ongeveer 15 minuten duren. </li><li> Voordat u het apparaat uit het water, plaats Tygon slangen (OD van 0,06 &quot;en ID van 0,02&quot;) gegrond met water in iedere haven van de inrichting met fijne punt pincet. De buis moet ongeveer 1 cm in lengte. Het apparaat kan nu uit het water worden verwijderd. Figuur 1C toont beeld van de device met de slang. </li></ol> 2. De microfluïdische apparaat met gewenste eiwit Coating (bijv. Avidin) <ol><li> Met behulp van een pipet een druppel water (ongeveer 100 pl) rond de basis van de ene inlaatpoort buizen. Verwijder de slang gebruikt om prime het apparaat zorgvuldig. De daling van het water zal voorkomen dat er lucht in het apparaat. </li><li> Bereid een 1 ml injectiespuit geladen met avidine in een concentratie van 20 ug / ml. Verbind de spuit met een 24 G roestvrijstalen naald en slangen. Plaats de slang aan een van de inlaatpoorten van de inrichting. Klem de inlaat poort niet wordt gebruikt met een kaak klem. </li><li> Injecteer avidine met een stroomsnelheid van 1 pl / min gedurende 10 minuten om volledige perfusie van de inrichting mogelijk. Aan het einde van de looptijd, klem de buis met de kaak klem en plaats het apparaat bij 4 ° C overnacht. </li></ol> 3. Vloeiende de Biotinylated Deeltjes voor Adhesie Experimenten <ol><li> Laat het apparaatkamertemperatuur komen. Plaats het apparaat op een omgekeerde fluorescentie microscoop uitgerust met een gemotoriseerde podium en een high performance camera. </li><li> Bereid een oplossing van 2 urn gebiotinyleerd deeltjes in een concentratie van 5 x 10 6 deeltjes / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Laad de deeltjes in een 1 ml spuit. Bereid een tweede spuit van 1 ml van alleen PBS. Plaats elke spuit op een injectiepomp en verbinding maken met naald en leidingen. </li><li> Met behulp van een pipet een druppel water (ongeveer 100 pl) rond de basis van de inlaatpoort slang. Verwijder de slang gebruikt voor het bekleden van het apparaat zorgvuldig. De daling van het water zal voorkomen dat er lucht in het apparaat. </li><li> Steek de slang voor gebiotinyleerde deeltjes en PBS uit stap 3.2 in elk van de inlaatpoorten. Figuur 2A toont beeld van de set-up. </li><li> Begin het injecteren gebiotinyleerde deeltjes bij een stroomsnelheid van 2,5 ul / min. Monitor de inlaat poort op de microscoop. Bij het eerste tekendeeltjes, begint de timer en blijft stroom voor 3 minuten. </li><li> Aan het einde van de 3 min, stop de stroom gebiotinyleerde deeltjes tegelijkertijd staren de stroom van PBS bij een stroomsnelheid van 2,5 ul / min. Laat PBS te stromen in het apparaat gedurende 3 minuten te wassen ongebonden deeltjes. </li></ol> 4. Afbeeldingen ophalen en Making Area of ​​Interest (AOI) metingen met behulp van imaging software (NIKON Elements) <ol><li> Gebruik de functie &quot;scan grote afbeelding&quot; in de imaging software om het beeld van de gehele inrichting te verwerven. </li><li> Opeenvolgend nummer van de vertakkingen in de inrichting en een cirkelvormige AOI met tweemaal de diameter van de kanalen. In dit geval stelt de AOI diameter tot 200 pm omdat het kanaal een diameter van 100 micrometer. </li><li> Gebruik de automatische telling functie in de imaging software om het aantal deeltjes in elk AOI exporteren naar een MS Excel sheet. </li><li> Gebruik ook de geautomatiseerde telling functie om het aantal deeltjes te exporteren in het geheleapparaat. </li></ol> 5. Deeltjesflux analyse met behulp van Computational Fluid Dynamics (CFD) modellen <ol><li> CFD simulaties worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (CFD-ACE +, ESI Inc) voor de SynVivo-SMN apparaat topologie. De resultaten worden opgeslagen in een database voor het analyseren van experimentele waarnemingen. De simulatieresultaten slaan informatie op de muur scheurverhoudingen, snelheid, deeltjesflux, en hechting in het apparaat. </li><li> De simulatieresultaten worden gebruikt om het aantal deeltjes in elk AOI basis van een gegeven inlaat deeltjesconcentratie bepalen. </li></ol> 6. Genereren Shear Hechting Kaart <ol><li> Bereken% adhesie door deling van het gehecht deeltjes in de vertakking van de deeltjes stroomt in de vertakking zie vergelijking 6.1. <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> waarbij het aantal deeltjes gehecht en de deeltjes stromen verkregen uit pROTOCOL stappen 4.3 en 5.2, respectievelijk. </li><li> Teken de afschuifhechting kaart met behulp van de afschuifsnelheid bij elke splitsing van de resultaten van de database in stap (5.1) netwerken en het% hechting waarden verkregen uit vergelijking 6.1. </li></ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis%3A+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation%2C+shear+stress+and+endothelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201(2010).</li>
<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
<li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+significance+of+adhesion+molecules+on+cultured+endothelial+cells+in+response+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation.</a> Microcirculation. 8, 355-364 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9(2001).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li>
<li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro%2Fnano-fabrication+technologies+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li>
<li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication%3A+techniques%2C+applications+%26+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li>
<li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

Vergoeding publicatie voor dit artikel gesponsord door CFD Research Corporation.

Parallelle plaat stroomkamers, terwijl belangrijke inzichten in cel-cel en cel-deeltje interacties lijden aan verschillende beperkingen, zoals hoge consumptie van reagentia en de noodzaak voor meerdere experimentele runs een afschuifweerstand kaart te genereren. Het gebruik van SynVivo synthetisch microvasculaire Networks (SynVivo-SMNs) maakt het genereren van een afschuifweerstand kaart van een experiment onder omstandigheden nabootsen in vivo omstandigheden. Bovendien is aanzienlijke besparingen (&gt; 95%) in...

Voor deze assays bestuderen in cel-cel en deeltjes-cel interacties omvatten gewoonlijk een statisch putjes waarin deeltjes of cellen worden geïncubeerd op eiwit matrices of adherente cellen. Aan het einde van de incubatietijd, is het aantal hechtende deeltjes of cellen gekwantificeerd microscopische 1. Hoewel deze testen leveren significant inzicht in de biochemische processen achter deze interacties, een belangrijke beperking is het ontbreken van fysiologische vloeistofstroom (typisch voor de microcirculatie) en de impact ervan op deeltje hechting. Om deze beperking te overwinnen, hebben in vitro stromingskamers ontwikkeld in de afgelopen jaren. Een gemeenschappelijk element van deze stroming Chambers is een transparante inrichting doorbloed bij lage Reynolds getallen shear tarieven waargenomen in de bloedvaten in vivo 2 overeenkomen. De vaatwand wordt gemodelleerd door een bekleding van biomoleculen of groei van cellen op een oppervlak van de stroming cHamber 3. Deeltjes 4-7 of 8-16 cellen worden vervolgens stroomde op gewenste bereik van stroomsnelheden van het aantal hechtende onder verschillende afschuifsnelheden kwantificeren. Het gebruik van parallelle plaat stroming kamers te bestuderen en bevestig de biochemische verschijnselen is nogal duur en tijdrovend. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat meerdere experimenten moeten worden uitgevoerd voor het genereren van een kaart van de vloeibare shear versus het aantal deeltjes / cellen gehandeld. Daarnaast plaat stromingskamers vereisen grote hoeveelheden reagentia vanwege hun grote omvang (lengte&gt; 250 micrometer en een breedte van&gt; 1 mm). Tot slot, deze apparaten niet nauwkeurig geometrische kenmerken (bijvoorbeeld vertakkingen) en stroom (bv., convergerende vs divergerende stromen) die aanwezig zijn in vivo model. Recente ontwikkelingen in de lithografie gebaseerd microfabrication 17-19 hebben op het gebied van lab-on-a-chip versneldeapparaten 20-21. Deze apparaten zijn instrumenteel in de ontwikkeling van een geminiaturiseerde versie van de parallelle plaat stroom kamer met afmetingen in de micrometer regime geweest. De vermindering van de dimensie levert ook aanzienlijke voordelen in termen van volumes van reagentia, cellen of deeltjes die nodig is voor experimenten. Echter, een belangrijke beperking van de momenteel beschikbare inrichtingen is het gebruik van lineaire kanalen model microvaatjes, dat de complexe microvasculatuur waargenomen in vivo niet nabootsen. We hebben onlangs een nieuwe methode voor het herstellen microvasculaire netwerken op wegwerp plastic substraten waardoor synthetische voorstelling van de in vivo omstandigheden. Deze apparaten genoemd SynVivo-Synthetische Microvasculaire Networks (SMN) worden ontwikkeld met behulp van PDMS gebaseerde soft-lithografie-proces. SynVivo-SMN apparaten kunnen worden gebruikt om afschuifhechting kaart van de mobiele / deeltje hechting 22 te verkrijgen, studie gerichte toediening van medicijnen 23 en have gevalideerd tegen in vivo gegevens 24-25. In dit artikel presenteren we een protocol dat generatie van de afschuifhechting kaart stelt uit een experiment in volumes zo klein als 1-5 ul hetgeen resulteert in een aanzienlijke besparing van tijd en middelen.

<table><tbody><tr><td>SynVivo-SMN</td><td>CFD Research</td><td>SMN-001</td><td>Exclusief bij CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>Elke avidin-bron werkt voor deze test</td></tr><tr><td>Biotinyleerde deeltjes</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>Elke bron van gebiotinyleerde deeltjes werkt voor de test</td></tr><tr><td>Tygon-slang</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>Grootte is typisch voor gebruik met SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>NIKON Elements</td><td>NIKON Instruments</td><td>N/A</td><td>Elke andere beeldverwerkingssoftware kan worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

generatie afschuifhechting kaart behulp synvivo synthetische microvascular networks

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cel / deeltje hechting assays zijn cruciaal voor het begrijpen van de biochemische interacties betrokken bij de ziekte pathofysiologie met belangrijke toepassingen in de zoektocht naar de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Testen met behulp van statische omstandigheden niet aan de afhankelijkheid van de hechting op afschuiving vastleggen, het beperken van hun correlatie met in vivo omgeving. Parallelle plaat stromingskamers dat hechting kwantificeren onder fysiologische stroming moeten meerdere experimenten voor het genereren van een afschuifweerstand kaart. Bovendien, ze vertegenwoordigen niet de in vivo schaal en morfologie en vereisen grote volumes (~ ml) van reagentia voor experimenten. In deze studie demonstreren we de generatie afschuifweerstand kaart uit een experiment met behulp van een microvasculaire netwerk gebaseerde microfluïdische apparaat, SynVivo-SMN. Dit apparaat herschept het complex in vivo vaatstelsel inclusief geometrische schaal, morfologische elementen, stroom functies en cellulaire interacties in eenin vitro-formaat, waardoor een biologisch realistische omgeving voor fundamenteel en toegepast onderzoek in cellulaire gedrag, drug delivery en drug discovery. De assay werd aangetoond door de interactie van de 2 urn biotine beklede deeltjes met avidine gecoate oppervlakken van de microchip. Het volledige gamma afschuiving waargenomen in de microvasculatuur is verkregen in een enkele assay waardoor hechting tegen afschuiving map for de deeltjes onder fysiologische omstandigheden.

Figuur 1A toont een helder veld een schematische en SynVivo-SMN apparaat. Figuur 1B toont de SynVivo-SMN apparaat gemonteerd op een glasplaatje. Figuur 1C toont het apparaat met slang na priming met water in een vacuüm exsiccator. Figuur 2A toont een afbeelding van de experimentele opstelling. Figuur 2B toont een typische avidine beklede SynVivo SMN-inrichting binding van 2 urn gebiotinyleerde deeltjes. Merk...

Stroomkamers die worden gebruikt in adhesie-experimenten bestaan meestal uit lineaire stromingsbanen en vereisen meerdere experimenten bij verschillende stromingssnelheden om een schuifadhesie-kaart te genereren. SynVivo-SMN maakt de generatie van een schuifadhesie-kaart mogelijk door middel van een enkel experiment met microlitervolumes, wat resulteert in aanzienlijke besparingen in tijd en verbruiksartikelen.

Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een shear-adhesiekaart van celpartikel-adhesie te verkrijgen uit één enkel experiment met behulp van synthetische microvasculaire netwerken. Dit wordt bereikt door het microfluïdische apparaat eerst te coaten met het eiwit van belang, in dit geval avadon. Als tweede stap worden gebiotineerde partikels bij fysiologische shear-snelheden in het apparaat geïnjecteerd, die binden aan het met avadon gecoate apparaat met differentiële patronen afhankelijk van de lokale shear-snelheden.Vervolgens wordt het aantal gebonden deeltjes geteld om een shear-adhesiekaart van de deeltjes te genereren met behulp van een computationeel gecreëerde database van shear-rate-waarden in het netwerk. De resultaten tonen aan dat een shear-adhesiekaart kan worden verkregen uit een enkel experiment, wat resulteert in een aanzienlijke besparing van tijd en reagentia in vergelijking met conventionele parallelle plaatstroomkamers. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van bestaande methoden, zoals lineaire stroomkanalen, is dat we shear-adhesiekaarten kunnen genereren uit één enkel experiment, wat leidt tot een aanzienlijke besparing in kosten en tijd.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van geneesmiddelentoediening, zoals het vermogen van dragers voor geneesmiddelen om te binden aan de gewenste doelwitten. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we paddle plate flow chambers gebruikten om celparticulaire laesies te begrijpen. Onder vloeistofomstandigheden is de focus van deze assay echter om basisinzichten te verschaffen in de adhesie van partikels en cellen.Het syn vivo-platform kan worden toegepast op een verscheidenheid aan andere systemen, zoals kanker en levering aan het CZS, infectie en ontsteking, trombose en microcirculatoire dysfunctie. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen van het microfluidische apparaat moeilijk aan te leren zijn, het wennen aan kleine monstervolumes tijd kost en de best practices om bubbelvorming te voorkomen beter visueel gecommuniceerd kunnen worden. De procedure wordt gedemonstreerd door Ashley Smith, een research scientist uit ons laboratorium.Het SynVivo SMN microfluidische apparaat bestaat uit twee sets parallelle poorten, één voor het instromen van oppervlaktecoatings, groepen en/of cellen voor fixatie, en de andere voor het uitvoeren van de assay. Dompel het apparaat om te beginnen volledig onder in een Petrischaal met steriel gedeïoniseerd water en plaats de schaal in een vacuüm. Laat de desiccatie doorgaan totdat alle lucht uit de kanalen van het apparaat is verwijderd.Dit zou ongeveer 15 minuten moeten duren voordat het apparaat uit het water wordt gehaald. Gebruik fijne pincetten om met water geprimede tigon-slangen in elke poort van het apparaat te plaatsen. De slangen moeten ongeveer één inch lang zijn.Het apparaat kan nu met een pipet of spuit uit het water worden verwijderd. Plaats een druppel water rond de basis van een van de slangetjes van de inlaatpoort. Verwijder het slangetje voorzichtig.De waterdruppel voorkomt dat er lucht in het apparaat komt. Bereid vervolgens een spuit van één milliliter voor, gevuld met avadon in een concentratie van 20 µg/mL. Verbind de spuit met een roestvrijstalen naald van 24 gauge en slang. Klem de niet gebruikte inlaatpoort af met een klem.Plaats de slang in de inlaatpoort van het apparaat. Injecteer avadon met een stroomsnelheid van 1 µL per minuut gedurende 10 minuten om volledige perfusie van het apparaat mogelijk te maken. Aan het einde van de stroomtijd.Klem alle slangetjes af met klemmen en plaats het apparaat een nacht bij vier graden. Laat het apparaat op kamertemperatuur komen. Plaats het apparaat vervolgens op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde tafel en een hogeresolutiecamera.Bereid een oplossing van biotinyleerbare deeltjes van twee micron voor met een concentratie van 5 miljoen deeltjes per milliliter in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Laad de deeltjes in een spuit van één milliliter. Bereid een tweede spuit van één milliliter met PBS.Plaats elke spuit op een spuitpomp en verbind deze vervolgens met de naald en slang menggunakan een pipetspuit. Plaats een druppel water rond de basis van de slang van de inlaatpoort en verwijder voorzichtig de slang die is gebruikt om het apparaat te coaten. Voeg voorzichtig de slangen voor de gebiotineerde deeltjes en voor PBS toe aan elke inlaatpoort.Begin vervolgens met het injecteren van gebiotinylerde deeltjes met een stroomsnelheid van 2,5 µL per minuut. Controleer de inlaatpoort onder de microscoop bij de eerste tekenen van deeltjes. Start de timer en handhaaf de stroom gedurende drie minuten.Stop na drie minuten de stroom van gebiotinyleerde deeltjes terwijl u gelijktijdig de stroom PBS start met een debiet van 2,5 µL per minuut. Laat de PBS gedurende drie minuten door het device stromen om ongebonden deeltjes weg te spoelen. Om te beginnen met de acquisitie, gebruikt u de functie 'scan large image' in de imaging-software om een afbeelding van het gehele device te maken; nummer vervolgens opeenvolgend de vertakkingen in het device en creëer een circulair interessegebied met een diameter die tweemaal die van de kanalen bedraagt.Stel in dit geval de diameter van het interessegebied in op 200 micron, aangezien de diameter van het kanaal 100 micron is. Gebruik de geautomatiseerde tel-functie in de imaging-software om het aantal deeltjes in elk interessegebied naar een spreadsheet te exporteren. Gebruik op dezelfde manier de geautomatiseerde tel-functie om het aantal deeltjes in het gehele device te exporteren.CFD-simulaties worden uitgevoerd en de resultaten worden opgeslagen in een database voor verdere analyse. De informatie in de resultaten bevat wandafschuifsnelheden, de flux van snelheidspartikels en de adhesie aan het device. Deze informatie wordt gebruikt om het aantal particuall die hechten in elk gebied van belang te bepalen, uitgaande van een gedefinieerde input voor de partikelconcentratie.Om een afschuifadhesiekaart te genereren, berekent u als laatste stap het adhesiepercentage zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Zet de afschuifadhesiekaart uit met de afschuifsnelheid bij elke vertakking van de netwerken en de waarden voor het adhesiepercentage. Deze afbeelding toont een typisch avidan-gecoat syn vivo SMN-apparaat na binding van twee micron biotinylated particles.Let op dat deeltjes bij voorkeur hechten nabij de vertakkingen in het netwerk. De genummerde vertakkingen in het syn vivo SMN-netwerk zijn hier te zien. Deze afbeelding is de voorbeeldkaart van de wandschuifspanning gegenereerd door het CFD-model van het apparaat.De afschuifsnelheid varieert in het apparaat van 250 s⁻¹ tot 15 s⁻¹, zoals waargenomen in de microvasculatuur in vivo. Merk op dat deze variërende afschuifsnelheden niet gelijktijdig kunnen worden bereikt in lineaire microfluïdische kanalen, aangezien deze een constante afschuifsnelheid bieden voor elke debietwaarde. De hier getoonde grafiek van de afschuifsnelheidswaarden bij elke vertakking van het netwerk laat zien dat de patronen van de afschuifsnelheid complex zijn en, in tegenstelling tot lineaire stroomkanalen, niet via een eenvoudige analytische relatie kunnen worden verkregen.Bovendien zijn er meerdere vertakkingen in het netwerk aanwezig die in dezelfde shear-bin vallen, wat bijdraagt aan de statistische betrouwbaarheid van de getoonde gegevens. Hier volgen voorbeeldresultaten van de CFD-analyse voor partikelstromen in het netwerk, die worden gebruikt om de partikelstromen in de takken en vertakkingen van het experimentele netwerk te berekenen.De afschuifadhesiekaart die is berekend uit een enkel syn vivo SMN-experiment volgt de omgekeerde relatie zoals waargenomen in afschuifadhesiekaarten verkregen uit lineaire kanaalexperimenten. Echter, met een SynVivo-assay maakt één enkel experiment de generatie van deze afschuifkaart mogelijk, terwijl voor de lineaire kanalen meerdere experimentele runs worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe SynVivo SMN-apparaten kunnen worden gebruikt voor het genereren van de gedeelde adhesie uit een enkel experiment.Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om te onthouden dat er na de ontwikkeling geen luchtbellen in het SynVivo SMN microfluïdische apparaat mogen komen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van inflammatie om de interactie tussen leukocyten en het endotheel bij verschillende afschuifsnelheden in één enkel experiment te bestuderen. In de volgende generatie apparaten kunnen onderzoekers de rolling, adhesie en migratie van leukocyten in een enkele assay bestuderen, iets wat momenteel nog niet mogelijk is.Na deze procedure kunnen andere methoden voor het onderzoeken van de adhesie van geneesmiddelen, drug-delivery-systemen en cellen worden uitgevoerd om vragen te onderzoeken zoals het fysiologische effect van stroming op cel-cel-, cel-geneesmiddel- en geneesmiddel-voertuigadhesie.

generation-shear-adhesion-map-using-synvivo-synthetic-microvascular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Dit protocol beschrijft de implementatie van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om vasculair-afgeleide, biomimetische microfluïdische netwerken te fabriceren die zijn ingebed in poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogels. Deze biomimetische microfluïdische systemen kunnen nuttig zijn voor weefselengineering toepassingen, generatie van in vitro ziektemodellen en fabricage van geavanceerde "on-a-chip" apparaten.

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Ontkiemende angiogenese, fundamenteel voor ontwikkeling en ziekte, omvat complexe moleculaire en mechanische processen. We presenteren een veelzijdig 2.5D ex vivo model dat cellulaire ontspruiting uit de halsslagaders van varkens analyseert, waarbij stijfheidsafhankelijke angiogenese en verschillende leider-volgercelmechanica worden onthuld. Dit model helpt bij het bevorderen van strategieën voor weefselmanipulatie en benaderingen van kankertherapie.

2.5D-model voor ex vivo mechanische karakterisering van kiemende angiogenese in levend weefsel

Leer een efficiënte methode voor het genereren van afschuifhechtingskaarten met synthetische microvasculaire netwerken. Deze technologie bespaart tijd en reagentia door één enkel experiment te gebruiken in plaats van meerdere conventionele stromingskamers.

Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Meer video's verkennen