VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Het algemene doel hier is om de methodologie van virus-geïnduceerde gen-silencing te demonstreren voor het identificeren van genen die betrokken zijn bij de resistentie van niet-gastheren, om zo VIGS van de endogene plant te bereiken. Inoculeer voor het doelgen Nicotiana hamama-planten met een tobacco rattle virus-vector die een fragment van het doelgen bevat; bereid vervolgens culturen van de pathogenen van de niet-gastheren voor die het groen fluorescerend proteïne tot expressie brengen en inoculeer deze op de bladeren van de planten met gene silencing. Beoordeel daarna de groen fluorescerende kolonies van de pathogenen van de niet-gastheren onder UV-licht in het donker.

Om gen-gesilencete planten te identificeren die de resistentie van niet-gastheren compromitteren, wordt het doelgen geïdentificeerd door het insert in de virusvector te sequensen. Over het algemeen stelt deze methodologie van VIX-gemedieerde forward genetische screening onderzoekers in staat om eenvoudig genen te identificeren die betrokken zijn bij de resistentie van niet-gastheren van planten tegen bacteriële pathogenen. In een korte periode hebben we vastgesteld dat het essentieel is om virus-geïnduceerde gen-silencing gemedieerde forward genetica te combineren met GFP-UV-expresserende pathogenen om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de non-ST-resistentie.

Voorheen hebben we een arbeidsintensieve forward genetische screen uitgevoerd door te scoren op door hyperrespons geïnduceerde celdood en door ziekte geïnduceerde celdood. Zaai nicotiana Ben-zaden in een potgrondmengsel zonder bodem en laat de zaden ontkiemen in een groeikamer. Na drie weken worden de zaailingen overgeplant in individuele potten en ten minste twee tot drie dagen in een kas gekweekt voordat ze worden besmet met het tobacco rattle virus.

Voor de inoculatie met de vijgenvector worden de bevroren stengels die de agrobacterium met de cDNA-klonen bevatten, geleidelijk ontdooid. Inoculeer onder steriele omstandigheden de individuele agrobacterium-culturen op Luria-BertI agro-platen. Incubeer de platen bij 28 °C gedurende maximaal twee dagen.

Kweek vier replica-kolonies voor elke kloon, zodat er voldoende agrobacterium-inoculum beschikbaar is voor de inoculatie van twee planten. Inoculeer TRV one in vloeibaar Luria-Berti-medium. Oogst de overnight-gekweekte culturen door centrifugatie, resuspendeer de bacteriën in inoculatiebuffer en incubeer deze gedurende drie uur bij kamertemperatuur op een schudmachine bij 50 RPM.

Nadat de cellen door centrifugatie zijn geoogst, wordt de optische dichtheid gemeten en worden de bacteriële pellets geresuspendeerd in vijf millimolaire MES-buffer pH 5.5. Inoculeer vervolgens de TRV1-bacteriecultuur met een OD 600 van 0.3 in de abaxiale zijde van drie tot vier Nicotiana hamama-bladeren met een naaldloze spuit op de plaats van de TRV1-inoculatie. Prik de bladeren gedurende twee weken met inoculum van de respectievelijke TRV2-kolonies met behulp van een tandenstoker. Houd de planten onder een lage temperatuur met adequate voeding, aangezien een krachtige groei belangrijk is voor een efficiënte gene silencing door PGS.

Als voorbeeld wordt Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in dit experiment gebruikt. Pathogenen moeten een plasmide dragen dat GFP kan tot expressie brengen. Kweek de GFP-stammen in King's B vloeibaar medium, aangevuld met 10 µg/mL rifampicine en 50 µg/mL kanamycine bij 28 °C gedurende 12 uur.

Oogst de bacteriële culturen door middel van centrifugatie en bevestig vervolgens de aanwezigheid van groene fluorescentie met een UV-lamp met een lange golflengte in het donker. Na twee wasbeurten in steriel water worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in steriel water tot de gewenste concentratie en wordt de OD 600 aangepast. Inoculeer vervolgens de respectievelijke pathogenen op de axiale zijde van het doelwit.

Indien nodig, knip gen-gesilenceerde bladeren in cirkels van ongeveer 1,5 centimeter diameter. Test gelijktijdig verschillende niet-gastheerpathogenen op hun groei in de doelwit-gen-gesilenceerde planten en voeg ook een vectorcontrole toe ter vergelijking. Implanteer een bacteriële groei tussen twee en vijf dagen.

Stel de geëntlocaties op de bladeren bloot aan UV-licht met een lange golflengte in het donker. Zorg dat u huid- en oogbescherming draagt. Controleer de bacteriële koloniën als groen fluorescerende vlekken aan de axiale zijde van het blad tegen de achtergrond van rode fluorescentie die door het bladoppervlak wordt uitgezonden.

Verifieer de groene fluorescentie die wordt uitgezonden door het gastheerpathogeen dat als positieve controle dient. Observeer de groei van het pathogeen dagelijks van twee tot vijf dagen na inoculatie. Maak een lijst van de klonen bij welke silencing resulteerde in de groei van één of meer niet-gastheerpathogenen.

Om de fout-positieven van de eerste screening te verwijderen, worden de VIG's voor geselecteerde klonen herhaald en wordt opnieuw de respons van gen-gesilencete planten op niet-cost-pathogenen getest. Gebruik kolonie-PCR op de geselecteerde kloon om het insert te amplificeren met de A TTB one en TB two primers in de T RV twee vector of primers die flankeren aan de kloonplaats.

Voer de PCR-producten uit op een agarosegel en verifieer de amplificatie van de enkele band. Sequenseer vervolgens het plantgen-insert in de T RV two-vector met behulp van ofwel de A TTB-primers of primers die flankeren aan de klooningssite. Voer een blast uit met de sequentie en identificeer de details van het gen.

Een gegeneraliseerd protocol voor het uitschakelen van grote aantallen genen met behulp van vectoren op basis van het tobacco rattle virus in Nicotiana hamana wordt in dit stroomschema getoond. Sommige van de planten met gen-silencing vertoonden diverse fenotypische veranderingen, waaronder groeiremming, vergeling en fotobleaching-fenotypes.

Deze gegevens tonen de groene fluorescentie van pathogenen die in het donker zijn blootgesteld aan UV-licht vóór inoculatie van de plant en hun groei-implantaten drie dagen na inoculatie; hetzelfde blad dat is blootgesteld aan wit licht wordt als controle getoond. Dit experiment volgt de groei van G-F-P-U-V-expresserende bacteriën in drie niet-gastheren.

Pathogenen werden gebruikt om het proces van identificatie van de gen-gesilencte plant aan te tonen die vatbaar is voor non-host pathogenen in de wild-type niet-gesilencte Nicotiana hamama planten met immuniteit. Deze pathogenen groeiden niet. Echter, ten minste twee non-host pathogenen groeiden op NB sgt.

Bladeren met één uitgeschakeld gen. Kwantitatieve gegevens over bacteriële groei demonstreren het proces van het identificeren van gen-gesilencte planten met een verminderde non-ST-resistentie. Met behulp van deze figs-gemedieerde forward genetics-benadering hebben we ongeveer 5.000 genen in Nicotiana hamana uitgeschakeld en planten geïdentificeerd met een verminderde non-ST-resistentie over een periode van ongeveer anderhalf jaar.

Als voorbeeld wordt hier de groei van niet-gastheerpathogenen getoond in twee gen-gestilte planten die via deze screening zijn geïdentificeerd. We hopen hiermee te hebben overgebracht hoe virus-geïnduceerde gen-stilte voor honderden genen kan worden uitgevoerd, en hoe de gestilte planten vervolgens kunnen worden beoordeeld door de groei van niet-gastheerpathogenen in planta te observeren om niet-gastheerresistentie te analyseren. Door dit virus-geïnduceerde gen-stilte-protocol te gebruiken, kan men honderden genen stilzetten in een periode van ongeveer twee tot drie weken, om vervolgens de groei van met GFP UV gelabelde niet-gastheerpathogenen te beoordelen in ongeveer twee tot drie uur per dag, verspreid over ongeveer twee tot vijf dagen.