What temperature conditions are best for growing C. elegans in the lab?

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending on experimental requirements. Temperature directly affects life cycle speed: at 25 °C, worms complete their life cycle 2.1 times faster than at 16 °C. Faster growth means worms mature quicker, lay more eggs, and consume more food, making temperature selection critical for experimental design.

What do C. elegans eat and how are they fed in the laboratory?

C. elegans are fed OP50, a standardized strain of E. coli used in every worm lab worldwide. In the wild, worms feed on decomposing plant matter, but in the lab they consume OP50 cultured on nematode growth media (NGM) plates or in liquid media. This standardized diet ensures consistent experimental conditions across research facilities.

How do you make and prepare NGM plates for C. elegans culture?

Combine nematode growth media ingredients with deionized water, autoclave for at least 15 minutes, then cool to 55 °C. Add aseptic additives if needed, pipette into Petri plates until 2/3 full, and dry overnight. Inoculate with OP50 E. coli resuspended to 10X concentration, dry overnight, then expose to UV light for sterilization before use.

What is a worm pick and how is it constructed?

A worm pick is a tool made from 30 gauge platinum-iridium wire sealed into a Pasteur pipet tip. The wire is flattened at the end and bent upward to form a scoop, then sanded smooth. The pick allows researchers to individually manipulate and transfer worms under a dissection microscope without damaging them or the agar surface.

How are C. elegans frozen and recovered for long-term storage?

Wash freshly starved larvae in M9 Buffer, transfer to a cryotube, add equal volume of 30% glycerol in M9 Buffer, and store at -80 °C. To recover, thaw at room temperature, pipette onto fresh NGM plates with OP50, and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer animals to new plates and allow one generation of reproduction before scoring phenotypes.

What happens to C. elegans when they experience stress or overcrowding?

When starved or overcrowded, C. elegans enter the dauer stage, a stress-resistant larval stage where worms do not age. This survival mechanism allows populations to persist under adverse conditions until resources become available again, making dauer larvae useful for long-term storage and experimental manipulation.

How is RNA interference used to study gene function in C. elegans?

Researchers prepare plates with E. coli expressing target gene dsRNA, which worms consume. Fourth larval stage worms are transferred to RNAi plates to lay eggs, then progeny are collected at desired developmental stages and scored for phenotypes. This approach silences specific genes to determine their function, leveraging insights from development and reproduction of caenorhabditis elegans for disease research.

Onderhoud van C. elegans

0 weergaven10:54 min.

Correcte zorg en het onderhoud van Caenorhabditis elegans is essentieel voor succesvolle experimenten.

Ze nemen zeer weinig ruimte in beslag, zijn goedkoop om te huisvesten, hebben een hoge fecunditeit en zijn gemakkelijk te manipuleren. Maar het feit dat ze eenvoudig te houden zijn, betekent niet dat de wetenschap erachter simpel is. In feite noemde Sydney Brenner C. elegans beroemd "het geschenk van de natuur aan de wetenschap," en sinds de introductie in 1974 is de worm betrokken geweest bij een aantal experimenten die een Nobelprijs hebben gewonnen.

In deze video demonstreren we basismethoden voor het onderhouden van C. elegans in het laboratorium, waaronder: huisvesting en voeding, hantering, evenals het invriezen en ontdooien van wormen.

In het wild komen C. elegans voor in de bodem en voeden ze zich met ontbindend plantmateriaal. In het laboratorium is het belangrijk om nematoden zo gelukkig mogelijk te houden, en daarom huisvesten en voeden we ze met zeer specifieke methoden.

C. elegans kan worden gekweekt bij 16, 20 of 25 °C, afhankelijk van de vereisten van het experiment, en kan worden gekweekt op vaste of in vloeibare media. In beide gevallen worden ze gevoed met OP50, een gestandaardiseerde stam van E. coli die specifiek wordt gebruikt voor nematodeculturen in wormlaboratoria wereldwijd.

Wanneer ze bij 25 °C worden gekweekt, voltooien C. elegans hun levenscyclus 2,1 keer sneller dan wanneer ze bij 16 °C worden gekweekt. Een snellere levenscyclus betekent dat de wormen sneller volwassen worden, meer eieren leggen en meer voedsel consumeren. Als wormen uithongeren of te dicht op elkaar zitten, gaan ze over in een larvaal stadium dat het dauer-stadium wordt genoemd. Dauer-larven zijn stressbestendig en verouderen niet.

Bij onderhoud op vaste media worden C. elegans gekweekt op agarplaten die zijn bereid met nematode growth media of NGM-media. Inoculeer de dag voordat de platen worden gemaakt vloeibaar LB-medium met een enkele kolonie OP50 E. coli. Incubeer het medium gedurende de nacht bij 37 °C onder schudcondities.

Om vaste media te maken, meet u de juiste hoeveelheden van deze ingrediënten af en combineert u deze met gedeïoniseerd water in een Erlenmeyer-kolf.

Laat de agar na autoclaveren van ten minste 15 minuten afkoelen tot 55 °C in een waterbad. Zodra het medium is afgekoeld tot 55 °C, zou u de glazen container met blote handen moeten kunnen vasthouden. Met behulp van de juiste aseptische techniek kunnen op dit moment additieven zoals geneesmiddelen of antibiotica worden toegevoegd. Draai de kolf om te mengen. Pipetteer vervolgens gesmolten NGM in Petri-schalen totdat deze voor 2/3 gevuld zijn. Laat de nieuw gemaakte platen gedurende de nacht op de werkbank drogen.

Pelleteer de volgende ochtend de OP50 bij 3500 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de bacteriën vervolgens in LB-medium tot een 10X concentratie. Pipetteer nu een centraal gazon op elke plaat. Vermijd dat de pipetpunt het oppervlak van de NGM raakt en zorg ervoor dat de cultuur de wanden van de plaat niet raakt. Laat de platen gedurende de nacht op de werkbank drogen. Stel de platen vervolgens bloot aan UV-licht om ze te steriliseren. Ze zijn nu klaar voor gebruik bij het kweken van wormen.

C. elegans worden individueel gemanipuleerd met behulp van een instrument dat bekendstaat als de wormpick. De pick is gewoonlijk gemaakt van 30 gauge draad bestaande uit 90% platina en 10% iridium, hoewel sommige onderzoekers de voorkeur geven aan iets andere metaalsamenstellingen. Om een pick te maken, begint u met het afbreken van de punt van een Pasteurpipet tot de gewenste lengte.

Knip ongeveer 3 tot 4 cm draad af en plaats 0,5 cm hiervan in de punt van de pipet. Versmelt de draad aan het glas boven een Bunsenbrander. De lengte van de draad die uit het glas steekt is ongeveer 3 tot 3,5 cm, maar dit kan variëren afhankelijk van persoonlijke voorkeuren.

Druk het uiteinde van de draad plat met behulp van een harde rand. Buig vervolgens het platgedrukte gedeelte omhoog om een schepvorm te creëren. Schuur tot slot de randen van de pick om beschadiging van de worm of de agar te voorkomen.

Om wormen te picken, steriliseert u de draad van de pick in een vlam. Bedek de punt vervolgens met dikke, kleverige OP50 E. coli van een NGM-plaat. Wees voorzichtig om het agaroppervlak niet te doorboren of te bekrassen.

Schep de worm terwijl u door een dissectiescoop kijkt voorzichtig op de platte, kleverige pick totdat de worm aan de pick hecht.

Zodra de worm op de pick zit, brengt u deze direct over door de punt lichtjes tegen het oppervlak van een nieuwe plaat te houden en over de bacteriële lawn te schuiven. De worm zou van de pick af moeten kruipen. De worm mag niet te lang op de pick blijven, anders kan deze uitdrogen.

Een van de redenen waarom C. elegans een populair onderzoeksmodel is, is dat culturen gedurende lange perioden kunnen worden bewaard zonder nadelige effecten.

Was eerst vers uitgehongerde larven met 0,5 ml M9-buffer, draai voorzichtig om alle larven en volwassen dieren los en breng ze vervolgens over naar een microcentrifugebuis of cryotube. Voeg daarna een gelijke hoeveelheid 30% glycerol in M9-buffer toe. Plaats tot slot de vial in een geïsoleerde doos en bewaar deze bij -80 °C.

Om de wormen te herstellen, haal je de buis uit een vriezer van -80 °C en laat je deze op kamertemperatuur ontdooien tot de inhoud volledig is gesmolten. Pipetteer de vloeistof op een verse NGM-plaat met een OP50-gazon en incubeer bij 20 °C. Breng na 2-3 dagen 10-15 dieren over naar een nieuwe plaat en laat ze zich gedurende één generatie voortplanten. Verzamel de nakomelingen en beoordeel deze op het juiste fenotype.

Nu we hebben gezien hoe C. elegans in het laboratorium wordt onderhouden, kijken we naar hoe de voeding-, huisvestings- en hanteercondities worden aangepast voor experimenten.

De Nobelprijs-winnende ontdekking van RNA-interferentie stelde onderzoekers in staat om elk C. elegans-gen uit te schakelen om de functie ervan te bepalen.

We kunnen RNAi induceren in C. elegans door eerst platen voor te bereiden met E. coli die dsRNA van het doelgen tot expressie brengen, welke de wormen vervolgens eten.

Vervolgens worden wormen in het vierde larvale stadium overgezet naar de RNAi-platen en krijgen ze de gelegenheid om eitjes te leggen. Op het gewenste ontwikkelingsstadium worden de nakomelingen verzameld en gescoord op fenotypes. Aangezien we ongeveer de helft van ons genoom delen met de worm, zijn veel van de verkregen inzichten toepasbaar op menselijke ziekten.

Vanwege de korte levenscyclus is C. elegans bijzonder geschikt als model voor veroudering.

Eerst wordt een tijdgesynchroniseerde populatie C. elegans gegenereerd door volwassen hermafrodieten eitjes te laten leggen op NGM-platen. De wormen leggen gedurende 6-8 hr eitjes en worden daarna verwijderd.

Wanneer de wormen het gewenste stadium hebben bereikt, worden ze overgebracht naar nieuwe NGM-platen die ampicilline bevatten om bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om voortplanting te voorkomen.

Vanaf dit punt worden volwassen wormen elke 2-3 dagen geobserveerd totdat alle wormen zijn gestorven. Dode wormen worden van de plaat verwijderd en het aantal levende en dode wormen wordt genoteerd.

Het analyseren van de levensduur in de context van genetische of omgevingsfactoren kan significante inzichten opleveren in het verouderingsproces.

Met behulp van lasers is het mogelijk om axotomieën uit te voeren — het doorsnijden van individuele axonen — in levende C. elegans om te bestuderen hoe zenuwcellen regenereren.

Omdat wormen echter nooit stilzitten, worden ze op 10% agarose-pads geplaatst in een oplossing van microbeads. Hierboven wordt een dekglas geplaatst. De microbeads verhogen de wrijvingscoëfficiënt van de interactie tussen de pad en het dekglas, waardoor de worm effectief op zijn plaats wordt gefixeerd.

Het preparaat is nu klaar voor het uitvoeren van axotomieën. De neuronen worden in beeld gebracht en gecentreerd in de microscoop. De laser wordt vervolgens afgevuurd met het voetpedaal. De optimale lasersterkte zal het neuron doorsnijden zonder aangrenzende structuren te beschadigen. Er worden zoveel mogelijk axonen per dier doorgesneden.

De agarose-pad wordt vervolgens voorzichtig van het glasplaatje verwijderd, waarna de wormen mogen herstellen op een geënt NGM-plaat bij 20 °C. Tussen 8-48 hr na de axotomie kunnen de neuronen worden voorbereid om te scoren op regeneratie. Aan het distale deel van de snede vormt het neuron een stomp. Echter, aan het proximale deel regenereert het neuron waarbij verlengde neurieten worden gevormd.

U heeft zojuist de benadering van JoVE voor het basisbeheer van Ceanorhabditis elegans bekeken. In deze video hebben we het volgende besproken: de huisvesting en voeding van C. elegans, het hanteren ervan, en het invriezen en herstellen van nematoden.

We hebben ook een kort overzicht gegeven van enkele toepassingen die C. elegans tot zo'n krachtig onderzoeksinstrument maken. Hoewel C. elegans op veel vlakken verschillen van zoogdieren, maken hun vergelijkbare genetische opbouw, het gemak van onderhoud en de eenvoudige manipulatie hen tot een belangrijk model in de zoektocht naar een beter begrip van de biologie en ziekten van zoogdieren. Bedankt voor het kijken!

Ceanorhabditis elegans is met groot succes gebruikt, en wordt nog steeds gebruikt, als modelorganisme voor het bestuderen van uiteenlopende ontwikkeli…