Name: De Xenopus Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer de cut-open Vaseline gap-techniek voor elektrofysiologische metingen van ionkanalen in Xenopus oöcyten met hoge temporele resolutie. Deze methode maakt nauwkeurige registratie van ionische stromen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle leden van de Washington University in St. Louis Cardiac Molecular Engineering Lab. Een Burroughs Welkom Fonds Career Award op het Wetenschappelijk Interface - 1010299 (JS).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
<li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li>
<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf">http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf</a> (1999).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+a+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents.</a> J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).</li>
<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De opengesneden eicel Vaseline kloof voltage clamp techniek zorgt voor een snelle oplossing van gegevens, lage ruis, meer controle over interne oplossing en externe oplossing compositie en stabiele opnames over relatief lange protocollen 19. Deze voordelen stellen deze techniek naast de standaard twee-elektrode voltage clamp en patch clamp technieken. Hoewel gespecialiseerde apparatuur nodig is en het protocol is relatief moeilijk, heel weinig problemen optreden zodra het systeem is geoptimaliseerd. Dit maakt...

Gespecialiseerde spanning klem technieken toestaan ​​dat de opname van de ionische stromen bij een gecontroleerde membraanpotentialen. Wijd gebruikt twee-elektrodespanning klem (TEVC) en patch clamp technieken betrouwbare elektrofysiologische informatie over de eigenschappen van vele ionkanalen. Echter, beide methoden hebben nadelen die het verkrijgen van betrouwbare gegevens voor snelle spanningsafhankelijke natriumkanalen en andere snelle activerende kanalen in membranen zoals die van Xenopus oöcyten voorkomen. De Bezanilla en Stefani laboratoria dus ontwikkelde de opengesneden Vaseline kloof voltage clamp techniek (COVG) voor eicellen 2. De techniek is algemeen toegepast opnemen, Na +, K + en Ca2 + kanalen 3-8. Tijdens COVG opname wordt een heterologe-eiwit tot expressie brengen eicel membraan verdeeld in drie regio&#39;s. De ionische stroom gegevens worden opgetekend uit de topgebied van de eicel alsbad rond het topgebied geklemd om een ​​commando potentieel, dat gemakkelijk en snel kan worden veranderd. Het middengebied waakt tegen lekstromen door klemming dezelfde potentiaal als de bovengebied 9. Het onderste gebied is waar eicel opening (opengesneden) gebeurt door middel van een saponine-oplossing of canule. Chemisch of handmatig openen van het membraan in het bodemgebied controle mogelijk van de interne potentieel, dat wordt vastgeklemd aan de grond en maakt de cel inwendige grenzen aan de onderste kamer oplossing. Perfusie van oplossingen in de onderste kamer kan de eigenschappen van de interne omgeving aan te passen, terwijl oplossing uitwisseling in de bovenste kamer verandert de externe omgeving. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Figuur 1. Eicel opengesneden Voltage-Clamp Bath Installatieblad. (A) Topdown view van de drie baden van elkaar gescheiden. De afmetingen van de kamers voor COVG worden weergegeven op de figuur. (B) Zijaanzicht van de baden setup in het testen positie. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . De voordelen van de COVG techniek zijn lage stroomruis (1 nA 3 kHz), de controle van de ionische samenstelling van het externe medium, de mogelijkheid om de interne media, snelle tijdsresolutie (20-100 usec tijdconstante van verval van het moduleren capaciteit voorbijgaande) en stabiele opnamen gedurende enkele uren 9. De nadelen zijn dat het vereist speciale apparatuur en het is moeilijker uit te voeren vergeleken met electrodes voltage klem (TEVC) 10. Terwijl de COVG benadering vereist zeer gespecialiseerde apparatuur en ingewikkelde procedurele elementen, kan het mogelijk maken voor de verwerving van waardevollekunnen elektrofysiologische gegevens. Deze gegevens, zoals het poorten stromen met snelle kinetiek en staart stromingen 4, kan worden opgenomen zonder een aantal van de kwesties in verband met andere spanning klem protocollen waaronder kanaal vervallen. Kleine aanpassingen aan de COVG setup kunnen zorgen voor het gebruik van de temperatuurregelaars en spanningsklem fluorometrie (VCF). De opname van spanningsklem fluorometrie elementen binnen de COVG montage kan data output te vergroten door het verlenen van de mogelijkheid om eiwit conformationele veranderingen te monitoren, terwijl het gelijktijdig opnemen van de huidige 11-13.

<table><tbody><tr><td>External Solution</td><td>Merk</td><td>Catalogusnummer</td><td>[Final], gewicht of volume</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH tot 7.4)</td></tr><tr><td>Internal Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N'-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH tot 7.4)</td></tr><tr><td>Depolarizing Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1.5mM</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Caisson</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Pipet Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Saponin Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>Internal Solution</td><td>Zie hierboven</td><td></td><td>50mL</td></tr><tr><td>Agar Bridge Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100ml van 1M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1.2g</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH tot 7.4)</td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Research Products International</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG Storage Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMDG, HEPES, MES Hydrate oplossing</td><td>zie hierboven</td><td></td><td>40ml</td></tr><tr><td>Water</td><td></td><td></td><td>60ml</td></tr><tr><td>Naam van materiaal/ apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp;Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Rack Power Filter</td><td>APC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Heating/Cooling Bath Temperature Controller</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Vibration Control TableTop Platform</td><td>TMC</td><td>64 SERIES</td><td></td></tr><tr><td>TMC Vibration Control Air Table</td><td>TMC</td><td><a name="RANGE!C10">20 Series&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Electrode Data Collector</td><td>Dagan</td><td>part of CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bath/Guard (I/V) Headstage (met geschikte connectoren)</td><td>Dagan</td><td>part of CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Control Bath</td><td>Custom of Dagan</td><td>Custom of HE-204C</td><td>Custom kamer gemaakt van materialen van Cool Polymers (D-serie). Dagan biedt ook een prefabricated stage (HE-204C).</td></tr><tr><td>Custom AgCl Pellet Container</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>Custom gemaakt</td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>External Oocyte Bath</td><td>Custom of Dagan</td><td>Custom of CC-1-T-LB</td><td>Custom gemaakt of gekocht bij Dagan</td></tr><tr><td>Internal Oocyte Bath</td><td>Custom of Dagan</td><td>Custom of CC-TG-ND</td><td>Custom gemaakt of gekocht bij Dagan</td></tr><tr><td>Capillaries voor Agar Bridges en getrokken Elektrodes</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Rotatable Mounts voor de Microscoop, Micromanipulator en Bath</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Regular Bleach</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis Oocytes</td><td>Nasco</td><td>LM535M (seksueel volwassen vrouwtjes)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ External Solution</td><td>Zie Solutions sheet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 Na+ Internal Solution</td><td>Zie Solutions sheet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Zie Solutions sheet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Storage Solution</td><td>Zie Solutions sheet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL transfer pipetten</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Gemodificeerde KCl elektrode injector</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Kunststof spuittip gesmolten om het injecteren van oplossing in de elektroden mogelijk te maken. Als alternatief kan een Microfil van WPI worden gekocht.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Deionized Water Squirt Bottle</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline Petroleum Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aanvullende materialen vereist voor VCF-opnames:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VCF Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW NIR Objectief</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Translator System voor Fixed-Stage Upright Microscopes</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>External VCF Oocyte Bath</td><td>Custom</td><td></td><td>Custom gemaakt. De afmetingen van de kamer zijn 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.</td></tr><tr><td>Internal VCF Oocyte Bath</td><td>Custom</td><td></td><td>Custom gemaakt. De afmetingen van de kam

de<em&gt; xenopus</em&gt; eicel opengesneden vaseline gap voltage-clamp techniek met fluorometrie

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

De opengesneden eicel Vaseline gap (COVG) voltage clamp techniek maakt het mogelijk voor de analyse van elektrofysiologische en kinetische eigenschappen van heterologe ionkanalen in eicellen. Opnames van de opengesneden setup zijn vooral nuttig voor het oplossen van lage magnitude gating stromen, snelle ionenstroom activering en deactivering. De belangrijkste voordelen via twee elektroden spanningsklem (TEVC) techniek omvatten een toename klemsnelheid, verbeterde signaal-ruisverhouding en het vermogen om de intracellulaire en extracellulaire milieu moduleren. Hier maken we de menselijke cardiale natrium kanaal (HNA V 1.5), uitgedrukt in Xenopus oöcyten, de opengesneden setup en protocol alsook over eventuele wijzigingen die nodig zijn om spanningsklem fluorometrie mogelijkheden toe te voegen aan te tonen. De eigenschappen van snelle activerende ionkanalen, zoals HNA V 1.5, niet volledig kan worden opgelost in de buurt van kamertemperatuur met behulp TEVC, in which het geheel van de eicel membraan geklemd, waardoor spanningsregeling moeilijk. Echter, in de opengesneden techniek, isolatie van slechts een klein deel van het celmembraan zorgt voor de snelle klemmen die nodig zijn om nauwkeurig registreren snelle kinetiek terwijl het voorkomen kanaal vervallen in verband met patch clamp technieken. In combinatie met de COVG techniek kinetiek van ionkanalen en elektrofysiologische eigenschappen kunnen verder worden getest door voltage clamp fluorometrie, waar eiwithoudende beweging wordt gevolgd via cysteïneconjugatie van extracellulair toegepaste fluoroforen, insertie van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen, of de opname van onnatuurlijke aminozuren in het gebied van belang 1. Deze extra gegevens levert kinetische informaties spanningsafhankelijke conformationele herschikkingen van het eiwit via veranderingen in de micro-omgeving rond het fluorescent molecuul.

Figuur 4 toont de verandering in permeabiliteit van de eicel als saponine-oplossing wordt aangebracht op het onderste gedeelte van de eicel. Figuur 5 toont de snelheid van intracellulaire oplossing uitwisseling door diffusie saponine na permeabilisatie. 20-40 min zijn verplicht om een steady-state 2,18 te komen. Figuur 6A toont sporen gegenereerd vanuit de opname-protocol. De figuur toont ionische stromen (na P/-8 lek aftrekken) i...

De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.

De<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Het algemene doel van deze procedure is om ruisarme opnames te verkrijgen van ionen- en gatingstromen van spanningsafhankelijke ionkanalen die tot expressie komen in zapcytes, met een hoge temporele resolutie van de snelle kanaalkinetiek. Dit wordt bereikt door eerst het geïsoleerde ionkanaal-mRNA in kikkeroocyten te injecteren. De tweede stap is het maken van agarbruggen door de capillaire buisjes te vormen en deze vervolgens te vullen met een zouthoudende agaroplossing.Vervolgens wordt de opengesneden opstelling klaargemaakt voor experimenten door alle componenten, inclusief de UO-plaats en agarbruggetjes, op de aangewezen locaties te plaatsen. De laatste stap is het inbrengen van de micro-elektrode in de UO-plaats om voltage-clamp-metingen mogelijk te maken. Uiteindelijk wordt het meetprotocol gebruikt om ionenstromen van de ionkanalen in het oocytenmembraan aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van de "cut open voltage clamp"-techniek is dat deze stabiele registraties met weinig ruis mogelijk maakt van een zeer grote populatie ionkanalen. Bovendien maakt het een snelle resolutie van de kinetiek van de kanalen mogelijk. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aa

the-xenopus-oocyte-cut-open-vaseline-gap-voltage-clamp-technique-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Ter aanvulling gebruikte methoden bestuderen TRPV4's worden twee methoden beschreven: De mechanische gevoeligheid kan worden bestudeerd door Ca 2 +-aequorine luminometrie in transgene gist bij hypo-osmotische uitdaging. Het kan ook in TRPV4-RNA worden onderzocht geïnjecteerd Xenopus oöcyten door whole-cell twee-elektrode voltage clamp of patch klem in op cel-of uitgeschakelde modus.

Gist luminometrische en Xenopus Eicel Elektrofysiologische Examens van de Moleculaire mechanische gevoeligheid van TRPV4

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .

Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Leer de cut-open Vaseline gap-techniek voor elektrofysiologische metingen van ionkanalen in Xenopus oöcyten met hoge temporele resolutie. Deze methode maakt nauwkeurige registratie van ionische stromen mogelijk.

De

Meer video's verkennen