Name: Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Leer een microscopische methode om cellulaire infectie door Listeria monocytogenes te kwantificeren met fluorescent gelabeld InlC. Deze techniek maakt high-throughput siRNA-screening mogelijk om gastheercelfactoren te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in P. Cossart laboratorium wordt ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, het Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), de Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), de Louis-Jeantet Foundation en de Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK is een ontvanger van een beurs van het Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies infectieuses. Wij danken Jason Mercer voor het optimaliseren van de cellulaire transfectieprotocol.

1. Voorbereiding van Cellulaire en bacterieculturen, Transfection Gereedschap en Primaire antilichamen <ol><li> Bereid een frisse agar plaat te isoleren individuele L. monocytogenes kolonies van een bacteriële glycerol voorraad (50% glycerol/50% verzadigd bacteriële vloeibare overnachtkweek) bewaard bij -80 ° C. <ol><li> Met een aluminium rek (bij -80 ° C gehouden) een bacteriële bevroren glycerolvoorraad, strook bacteriën op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat vervoeren. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 48 uur (of tot individuele bacteriële kolonies worden geïsoleerd). </li><li> Bewaar deze werken plaat daarna bij 4 ° C gedurende een maximale tijd van 1 maand (het zal worden gebruikt om de vloeibare kweken zaad). </li><li> In ons protocol, gebruiken we de L. monocytogenes serotype 1/2a EGDe.PrfA * stam, maar zoals weergegeven in figuur 1, de L. monocytogenes serotype 4b P14.PrfA * soort geeft vergelijkbare resultaten. </li></ol></li><li> HijLa ATCC CCL2 cellen worden gekweekt in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in afwezigheid van antibiotica. </li><li> Onafhankelijk pools scrambled (controle) en anti-Met siRNAs zijn zwart 384 putjes microscopie celkweek platen geladen. <ol><li> Verdun 160 pmol siRNA in 500 pi van RNase-vrij water en voeg 5 ul van deze oplossing per goed (uiteindelijke concentratie: 1,6 pmol). </li><li> Bewaar deze plaat bij -20 ° C gedurende een periode van maximaal 1 jaar. </li></ol></li><li> Polyklonale konijnen antilichamen tegen het bacteriële eiwit InlC zijn verkregen door immunisatie met een InlC-GST recombinante proteïne zoals eerder 25 beschreven. </li></ol> 2. Reverse siRNA celtransfectie <ol><li> 72 uur vóór infectie brengen op kamertemperatuur een zwarte 384-wells microscopie celkweek plaat met 1,6 pmol siRNA in 5 pi van RNase-vrij water in elk putje. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 300RCF bij kamertemperatuur siRNA die kunnen worden afgezet op de wanden van de putjes neer te halen. </li><li> Bereid kamertemperatuur DMEM aangevuld met 0,4% Lipofectamine RNAiMAX. </li><li> Voeg 25 ul van de DMEM / RNAiMAX transfectiemedium aan elk putje (niet de transfectiemedium niet langer dan 20 min incuberen voordat u deze aan de siRNA). </li><li> Zet de plaat heen en weer naar de siRNA transfectie mengen met de oplossing, dan houden de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om siRNA-Lipofectamine complexen te vormen. </li><li> Wash HeLa cellen van een confluente-of sub-confluente kolf eenmaal met 10 ml 37 ° C voorverwarmde PBS. </li><li> Trek HeLa-cellen door toevoeging van 1 ml 37 ° C voorverwarmde trypsine aan de celkweek kolf en incubeer gedurende 3 tot 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in 10 ml 37 ° C voorverwarmde DMEM gesupplementeerd met 16% FBS. </li><li> Tellen cellen en bereiden een celsuspensie van 12.000 cellen per ml in DMEM aangevuld met16% FBS. </li><li> Voeg 50 ul van de celsuspensie aan elk putje in 384-wells plaat. </li><li> Verplaats de plaat snel heen en weer om de cellen te verdelen en laat cellen settelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dicht de plaat met Parafilm en bewaar deze voor 72 uur in een bevochtigde 5% CO 2-bevattende atmosfeer bij 37 ° C. </li></ol> 3. Cellulaire Infectie en kleuring <ol><li> De dag voor infectie, neem een enkele kolonie van L. monocytogenes uit de BHI agar plaat en resuspendeer in 5 ml vloeistof BHI medium in een 15 ml polystyreen buis. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in een shacking bediening om voor bacteriële groei. </li><li> De dag van de infectie, was 1 ml van de overnacht L. monocytogenes cultuur door centrifugeren 2 min bij 10.600 RCF op een tafelblad centrifuge. </li><li> Verwijder het supernatant (dat de uitgescheiden cytotoxine listeriolysine O bevat) en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS (Repeat de wasstap 3 keer). </li><li> Lees de bacteriële optische dichtheid bij 600 nm en schat het aantal bacteriën (OD = 1 komt overeen met 1E9 bacteriën / ml). </li><li> Bereid de adequate L. monocytogenes verdunning in DMEM aangevuld met 1% FBS: met sterk invasieve stammen zoals EGDe.PrfA *, stellen we het gebruik van 5E4 bacteriën in 30 pl medium per putje (de multipliciteit van infectie wordt geschat 25 2.000 cellen). </li><li> Verwijder het celkweekmedium in elk putje (80 pl) en vervangen door het toevoegen van 30 pi van de L. monocytogenes-bevattend medium. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 200 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het infectieproces te synchroniseren. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een bevochtigde 5% CO2-atmosfeer bij 37 ° C op een voorverwarmd aluminium blok. </li><li> Verwijder de L. monocytogenes-bevattend medium uit elk putje en voeg 30 ul van voorverwarmde DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en40 ug / ml gentamicine extracellulaire L. doden monocytogenes. </li><li> Incubeer gedurende 4 uur in een 5% CO2-atmosfeer bij 37 ° C op een voorverwarmde metalen blok. </li><li> Bereid een oplossing van PBS aangevuld met 8% formaldehyde (de oplossing moet vers worden bereid zodat de monomeren formaldehyde, paraformaldehyde in plaats van de polymeren worden gebruikt). </li><li> Zonder Werp het celkweekmedium, voeg 30 ul PBS aangevuld met 8% formaldehyde (eindconcentratie: 4%) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het fixeermiddel en was de cellen driemaal met 80 pi PBS per putje (houd de cellen in een eindvolume van 80 pi PBS per well). </li><li> Bereid een 1:250 verdunning van het konijn anti-InlC in PBS aangevuld met 0,2% saponine. </li><li> Voeg 10 ul van het primaire antilichaam oplossing in elk putje na verwijdering van de PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Gooi de primaireantilichaam-oplossing en was vier keer met 40 ul PBS per putje. </li><li> Verdun de secundaire Alexa Fluor 546-gekoppelde anti-konijn-antilichaam (1:250), de DAPI oplossing (1:1,500) en phalloidin-Dy647 (1:150) in PBS aangevuld met 0,2% saponine. </li><li> Voeg 10 ul van deze secundaire kleuring oplossing in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Gooi de secundaire kleuring oplossing en was vier keer met 40 pi PBS per well (laat een eindvolume van 40 pi in elk putje en sluit de plaat). </li><li> De plaat kan onmiddellijk worden afgebeeld of kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht (aluminiumfolie) voor verdere analyse. </li></ol> 4. Image Acquisition and Analysis <ol><li> Acquire beelden in drie verschillende kanalen (350 nm, 546 nm en 647 nm) met een 10X objectief gemonteerd op een geautomatiseerde microscoop (verwerven bij voorkeur 9 beelden per well). </li><li> De InlC signaal kan worden gemeten met behulp van beeldanalyse software zoals CellProfiler dat automatische segmentering van kernen en cellichamen met de DAPI en de phalloidin vlekken, respectievelijk toelaat. </li></ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
<li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resistance+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li>
<li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+and+the+growth%2C+movement%2C+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite%2C+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li>
<li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes%3A+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li>
<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
<li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product%2C+a+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li>
<li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Listeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape%3A+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
<li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin%2C+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li>
<li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li>
<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li>
<li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li>
<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Verschillende parameters zijn cruciaal voor het succes van onze InlC detectie protocol, inclusief het gebruik van gezonde cellijnen weergeven van een voldoende groot cytoplasma een eenduidige detectie van de InlC signaal mogelijk. In de test geven we in dit artikel stellen we het gebruik van CCL2 HeLa-cellen, die bijzonder geschikt voor onze assay door de uitbreiding van de cytosolische ruimte zijn, andere HeLa klonen zoals HeLa-cellen Kyoto een kleiner cytoplasma maar kan worden gebruikt met onze infectieprotocol (HeLa...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

De Gram positieve bacterie Listeria monocytogenes is een voedsel overgedragen pathogeen dat gastheercellen valt, verstoort de internalisatie vacuole en repliceert in het cytoplasma van gastheercellen 1. L. monocytogenes gemak van manipulatie in het laboratorium context (snelle groei, een lage toxiciteit voor gezonde personen) in verband met het voortbestaan ​​van bacteriële virulentie eigenschappen waargenomen in cellulaire en diermodellen (hemolytische activiteit, leukocytose) toegestaan ​​het eerste gebruik in de jaren 1960 als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasitisme en voor de oprichting van de theoretische grondslagen van cellulaire immuniteit tegen infectie 2. In de late jaren 1980 en begin jaren 1990, de ontleding van de intracellulaire bacteriële cyclus 3 en de moleculaire karakterisatie van de belangrijkste bacteriële virulentiefactoren 4-7 voorkeur het gebruik van L. monocytogenes als een belangrijke moleculaire tool voor de manipulatie en study gastheercel functies. De aanwezigheid van avirulent (L. innocua) en virulente (L. monocytogenes) soorten in het geslacht Listeria de weg vrijgemaakt voor comparative genomic studies 8 die, samen met de recente oprichting van de volledige L. monocytogenes Transcriptome 9, ons begrip van de evolutie van L. zijn toegenomen monocytogenes als een menselijk pathogeen en als een modelsysteem voor infectie studies 10. L. monocytogenes induceert de internalisatie in gastheercellen na interactie van de bacteriële oppervlakte-eiwitten sture en InlB met hun gastheercel receptoren E-cadherine en Met respectievelijk 11-12. Eerste-kandidaat gebaseerde studies leidden tot de identificatie van de α / β-actine catenins verbinding als een belangrijk onderdeel van de inla-invasie route 13 en de fosfoinositide 3-kinase (PI3-K) als een kritische effector van InlB- afhankelijke invasie Cascade 14-15. Proteomics en functionele assays op basis daarna kon de identificatie van nieuwe cytoskelet elementen 16 en lipide second messengers 17 vereist gastheercel invasie. Transcriptionele studies 18 en massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics 19 hebben onlangs een nieuw licht werpen met betrekking tot de activering van gastheer signaleringscascades en de onderdrukking van de immuunrespons tijdens L. monocytogenes infectie. Systeembiologie aanpak gebaseerd op de inactivatie van grote sets van genen (kinomes, complete genomen) door kleine interfererende RNA (siRNA) silencing hebben onlangs nieuwe wegen geopend voor de analyse van de wereldwijde gastheer signaleringscascades in het kader van specifieke cellulaire functies, met inbegrip van fagocytose en pathogeen internalisatie 20. Genoom-brede siRNA schermen zijn eerder uitgevoerd om cellulaire cascades die nodig zijn voor infectie van L. onderzoeken monocytogenes in fagocytaire Drosophila </em&gt; S2 cellen 21-22, maar dit type analyse is niet uitgevoerd in niet-fagocytische cellen, die kritisch doelstellingen voor infectie in vivo vertegenwoordigen. We hebben een protocol geoptimaliseerd voor de microscopische detectie van late stadia van de infectie door L. monocytogenes die geschikt is voor hoge-doorvoer siRNA studies van bacteriële binnenkomst epitheelcellen. Onze test maakt gebruik van een zeer invasieve L. monocytogenes-stam die een puntmutatie in PRFA, de belangrijkste transcriptionele regulator van L. presenteert monocytogenes virulentiefactoren 6: deze mutatie (genaamd PRFA *) maakt PRFA constitutief actief 23 en leidt tot een verhoogde expressie van de invasie eiwitten ing en InlB derhalve de voorkeur bacteriële binnenkomst in zich moeilijk geïnfecteerde niet-fagocytische cellen. De uitlezing voor infectie is gebaseerd op de detectie van de cytosolische accumulatie van de uitgescheiden bacteriële eiwitten InlC: Dit molecuuleen pleiotroop effector die bij voorkeur wordt uitgedrukt door intracytoplasmatische L. monocytogenes 9 en die participeert niet alleen in de bacteriële cel-cel verspreiding 24 maar ook moduleert gastheer immuunreacties 25. De fluorescente labeling van InlC secretie door intracellulaire bacteriën kan niet alleen duidelijk onderscheid geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde cellen, maar vertegenwoordigt een eindpunt uitlezing die gebruikt kan worden om vervolgens ontleden infectie bij de verschillende stappen: ingang, vacuolaire ontsnappen, cytosolische bacteriële proliferatie en cel-naar-cel verspreiding. Deze microscopie protocol kan worden gekoppeld met siRNA schermen derhalve cellulaire routes betrokken bij de infectie van gastheercellen door L. bestuderen monocytogenes.

<table><tbody><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td>Voor vloeibare BHI-voorbereiding</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Aanvulling op vloeibare BHI voor BHI-agarplaten </td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>Maak vers klaar voor elk experiment</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Dy647</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Scramble</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Met</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Black 384-well microscopy cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver Z1 microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>Openbare software beschikbaar op <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming inlc afscheiding to cellular infectie onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; listeria monocytogenes</em

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacteriële intracellulaire pathogenen kan worden opgevat als moleculaire technieken om cellulaire signaaltransductie cascades vanwege hun vermogen om prachtig te manipuleren en te ondermijnen cel functies die nodig zijn voor de infectie van gastheer doelwitweefsels ontleden. Onder deze bacteriële pathogenen, Listeria monocytogenes is een Gram-positieve micro-organisme, dat is gebruikt als een paradigma voor intracellulaire parasitisme in de karakterisering van cellulaire immuunrespons, en die instrumentele rol heeft gespeeld bij de ontdekking van de moleculaire pathways cytoskelet en membraantransport dynamiek beheersen van. In dit artikel beschrijven we een robuuste microscopische test voor de detectie van cellulaire infectie late stadia van L. monocytogenes basis van de fluorescente labeling van InlC, een uitgescheiden bacteriële eiwit dat accumuleert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, deze assay kan worden gekoppeld met geautomatiseerde high-throughput kleine interfererende RNA schermen om characterize cellulaire signaalwegen betrokken bij het up-of down-regulatie van infectie.

Fluorescentielabelling van cytoplasmatische InlC biedt een robuuste uitlezing voor cel infectie door L. monocytogenes, zoals in figuur 1: de centrale cel in de microfoto is sterk besmet door de stam P14.PrfA * 23 zoals kan worden waargenomen in fase contrast beeld (pijlpunten figuur 1A) en wordt bevestigd door de DAPI signaal waar individuele bacteriën duidelijk onderscheiden (Figuur 1B). De InlC kleuring (gesuperponeerd op de DAPI kleuring in figuur...

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cellulaire invasie door het pathogeen listeria monocytogenes te kwantificeren binnen de context van siRNA-assays, om zo nieuwe celfuncties te ontdekken die vereist zijn voor bacteriële infectie. Dit wordt bereikt door in eerste instantie een cellulaire siRNA-reversetransfectie uit te voeren om specifieke functies van de gastheercel te inactiveren. In een tweede stap worden de cellen geïnoculeerd met listeria monocytogenes, die de cellen differentieel zal infecteren op basis van de cellulaire functies die door de siRNA-behandeling zijn beïnvloed.Vervolgens worden de geïnfecteerde cellen verwerkt middels immunofluorescentie om de celkernen te labelen. De actine-cytoskelet en het bacteriële eiwit INLC worden geanalyseerd om geïnfecteerde cellen te identificeren en te onderscheiden van niet-geïnfecteerde cellen, op basis van microscopische analyse van de distributie van het INLC-eiwit in individuele cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Gentamycine-invasie-assays, is dat deze op een FU-manier kan worden toegepast.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bi

imaging-inlc-secretion-to-investigate-cellular-infection-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Listeria monocytogenes is een modelorganisme voor het bestuderen van immuunreacties en de genetische gevoeligheid voor bacteriën intracellulaire bij muizen. Deze methode stelt je in staat om bacteriële lading te meten en single-cell suspensies van de lever en de milt van de muizen voor het genereren van FACS-analyse van veranderingen in het immuunsysteem van cellen als gevolg van Listeria-infectie te bepalen.

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Source: Chetrit, D., et al. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the preparation and imaging of fluorescently labeled pathogenic bacteria. Agarose pads are first prepared and positioned within an adhesive frame. A suspension of genetically modified bacteria expressing a fluorescent protein is applied to the pad to immobilize the cells. The...

Sample Preparation and Imaging of Fluorescently Labeled Bacteria

In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

This video demonstrates a technique for detecting local and global calcium ion response upon Shigella infection of human epithelial cells. Shigella invades host cells and releases invasion effectors, impacting intracellular calcium levels. The amplitude and frequency of the local and global cytosolic calcium are studied using a fluorescent indicator.

An Imaging Technique to Study the Calcium Response in Bacteria-Infected Cells

Dit document beschrijft een nieuwe werkwijze voor orale infectie van muizen...

Mondelinge transmissie van<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Muizen via inname van besmet voedsel

Listeria monocytogenes veroorzaakt foetale infecties bij zwangere vrouwen en meningitis bij gevoelige populaties.  Subpopulaties van bacteriën kunnen hartweefsel koloniseren, waardoor myocarditis ontstaat bij patiënten en proefdieren.  Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe L. monocytogenes cardiale celinvasie in vitro en cardiale kolonisatie bij geïnfecteerde dieren te beoordelen.

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Hier beschrijven we een eenvoudige confocale beeldvormings methode om de in-situ lokalisatie van cellen die het cytokine interferon gamma in Murine secundaire lymfoïde organen afscheidende te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de visualisatie van andere cytokines in diverse weefsels.

Beeldvorming van in situ interferon gamma productie in de muis milt na Listeria monocytogenes infectie

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Leer een microscopische methode om cellulaire infectie door Listeria monocytogenes te kwantificeren met fluorescent gelabeld InlC. Deze techniek maakt high-throughput siRNA-screening mogelijk om gastheercelfactoren te identificeren.

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen

Meer video's verkennen