Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets
October 3rd, 2014
Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.
Het algemene doel van deze procedure is om celvellen te gebruiken om een weefselgeënginnerd pleister te construeren. Dit wordt bereikt door eerst het celcultuuroppervlak te behandelen met het thermogevoelige polymeer polypropylacrylamide, ook wel p nipam genoemd. De tweede stap is om de cellen van belang in een hoge dichtheid op het met polymeer beklede oppervlak te kweken om celvellen te creëren.
Vervolgens worden de vellen opgetild door de temperatuur van de plaat te verlagen, waardoor de cellen zich als een celblad losmaken van de plaat. De laatste stap is om de intacte celvellen zonder ze te scheuren naar een construct voor implantatie te verplaatsen. Uiteindelijk kan eenvoudige lichtmicroscopie worden gebruikt om te tonen dat het celblad is gecreëerd en gehandhaafd tijdens de manipulatie ervan terwijl een implanteerbaar, weefselgeënginnerd materiaal wordt gecreëerd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, die cellen in matrixachtige hydrogels zullen inbedden, is dat in deze techniek de laterale randen van de cellen kunnen worden gegenereerd en gehandhaafd als een functioneel weefsel. Deze methoden kunnen ook verdere studies op het gebied van weefselengineering mogelijk maken. Bijvoorbeeld, hoe goed overleven de cellen na transplantatie wanneer ze zich in deze georganiseerde toestand bevinden?
Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Dr. William Turner, een postdoctoraal medewerker in mijn laboratorium en Ms. Snapshot Sand Do. Om deze procedure te beginnen, lost u 2,6 gram P nipam op in twee milliliter van een 60% tolueen, 40% hexaan oplossing. Vervolgens verwarmt u het mengsel gedurende 10 minuten tot 60 graden Celsius en roert u totdat de P nipam is opgelost.
Snijd vervolgens het filterpapier in een cirkel met een diameter van 60 millimeter en plaats het in een Buchner-trechter. Filter de oplossing door de Buchner-trechter in een vooraf gewogen glazen beker. Bewaar de beker en inhoud in een belvacuüm overnacht.
Daarna weegt u de beker met p nipam. Voeg vervolgens isopropylalcohol toe aan P nipam om een 50 50 gewichtsgewichtsoplossing te creëren. Plaats vervolgens twee milliliter van de oplossing op het oppervlak van de weefselcultuurplaat en bedek het gedurende vijf minuten onder UV-licht.
Was vervolgens de plaat twee keer met twee milliliter warm PBS voordat u het voor celcultuur gebruikt. In deze procedure isoleert u eerst de rat aorta gladde spiercellen door de cellen te wassen met twee milliliter warm PBS. Voeg vervolgens drie milliliter trypsine of een andere splitsende dissociatieoplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten.
Voeg vervolgens drie milliliter van het kweekmedium of PBS met 10% FBS toe aan de cellen. Verzamel daarna de cellen in een conische buis en tel ze. Draai vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 1000 RPM.
Zuig de supernatant af en suspendeer de cellen in het groeimedium. Plaats vervolgens het medium met de cellen op een 35 millimeter thermogevoelige plaat met een concentratie die 100% confluency zal bereiken, en incubeer vervolgens overnacht bij 37 graden Celsius om de celadhesie aan de plaat te behouden. Verzamel nu de endotheelcellen en verspreid ze in een enkele celoplossing.
Het gebruik van een x trypsine, acuate of celdissociatiebuffer zou ook kunnen worden gebruikt voor enkele celdispersie. Deactiveer vervolgens het trypsine-enzym met een gelijke hoeveelheid sojatrypsine-remmer of 10% FBS in PBS. Verzamel vervolgens de cellen in een 15 milliliter conische buis.
Tel de cellen met een hemo cytometer en bereken het volume dat nodig is voor de patchafmetingen voor een vier millimeter patch, 2 miljoen endotheelcellen worden gebruikt. Extraheer vervolgens 2 miljoen cellen en plaats ze in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten, zuig de supernatant af en laat de cellen als pellet in de conische buis. Bereid nu de hoge aurin hydrogel voor volgens het bedrijfsprotocol.
Meng hoge aurin en vloeibare gelatine in een verhouding van één op één. Breng vervolgens 80% van het totale eindvolume over in de conische buis met het pellet, suspendeer de endotheelcellen in de hoge aurin gelatine mengsel. Breng vervolgens de gesuspendeerde cellen over in de vezelige matrix.
Voeg 20% van het totale eindvolume van de crosslinker toe en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius. In deze stap verwijdert u de 35 millimeter P nypa-behandelde plaat met de cellen uit de incubator en plaatst u deze in een celcultuur kap. Bij kamertemperatuur zuigt u snel het medium van de cellen af.
Voeg vervolgens twee milliliter van 37 graden Celsius, 6% normale gelatine toe aan de plaat terwijl de gelatine nog warm is, plaats de metalen raster in de gelatine en dompel hem onder in het oppervlak van de normale gelatine. Plaats vervolgens de hele plaat gedurende vijf tot zeven minuten op ijs, waardoor de gelatine kan uitharden. Na zeven minuten scheidt u voorzichtig de gelatine randen van de zijkant van de plaat met een spatel.
Til vervolgens het metalen raster van de plaat op met pincetten. Breng het celblad over in de schotel en plaats het bovenop de vezelige matrix hydrogel combinatie. Voeg twee milliliter 37 graden Celsius medium toe aan de weefselcultuurplaat en incubeer overnacht om de celblad zich te hechten aan het hydrogeloppervlak.
Ondertussen verwijdert u het metalen raster nadat de oplossing is opgewarmd. Hier werden cellen gekweekt op een Pippa-gecoat oppervlak en vervolgens als een blad naar het oppervlak van de vezelige matrix verplaatst. Vroege proeven die niet werden overgebracht met de gelatine metalen raster resulteerden in kleine versleten pleisters.
Deze afbeelding vertegenwoordigt een vroeg ontwerp van een samengestelde foto van de pleister, die de mito tracker, rood geverfde rat aorta gladde spiercellen, calcium am groen fluorescerende humane navelstrengvene endotheelcellen en de overgebrachte lichtafbeelding combineert. En dit is de samenstelling van het celblad gecombineerd met de sterkere basis vezelige matrix hydrogel combinatie. Deze samengestelde afbeelding is genomen vanaf de onderkant van de pleister door een sterkere
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de constructie van een weefsel-geëngend plaatje met behulp van celvellen. Het proces omvat het behandelen van een celcultuuroppervlak met een thermogevoelig polymeer en het kweken van cellen om intacte vellen voor implantatie te creëren.
Belangrijkste Onderdeel van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Weefseltechniek
- Celcultuurtechnieken
- Biomaterialen
Achtergrond
- Het creëren van georganiseerde structuren van complex weefsel vereist meerdere materiaal- en celtypen.
- Het gebruik van orgaanspecifieke gelaagde celvellen verbetert de weefselintegratie.
- Biologisch afgeleid materiaal kan de vorming van nieuwe vaten ondersteunen.
- Thermogevoelige polymeren vergemakkelijken het loslaten van celvellen.
Doel van het Onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het construeren van een weefsel-geëngend plaatje.
- Om celvellen te gebruiken voor verbeterde implantatietechnieken.
- Om de haalbaarheid van het behoud van celintegriteit tijdens manipulatie aan te tonen.
Gebruikte Methoden
- Behandelen van celcultuuroppervlakken met poly propyl acrylamide (pNIPAM).
- Kweken van cellen op hoog dichtheid op het polymeer-gecoate oppervlak.
- Opheffen van celvellen door de temperatuur te verlagen om ze los te maken.
- Overbrengen van intacte celvellen naar een construct voor implantatie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle creatie van celvellen die kunnen worden gemanipuleerd zonder te scheuren.
- Lichtmicroscopie bevestigde de integriteit van de celvellen tijdens het proces.
- De methode maakt de constructie van implanteerbare weefsel-geëngend materiaal mogelijk.
- Toonde het potentieel voor verbeterde vasculaire vorming in geëngend weefsel aan.
Conclusies
- De studie presenteert een haalbare methode voor het creëren van weefsel-geëngend plaatjes.
- Het gebruik van thermogevoelige polymeren is effectief voor celvellmanipulatie.
- Deze aanpak zou het veld van weefseltechniek aanzienlijk kunnen bevorderen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables the construction of multicellular 3D scaffolds using layered cell sheets, addressing a key challenge in regenerative medicine: delivering organized, multi-cellular constructs with preserved cell-cell interactions and vascular potential. By preserving lateral cell borders and enabling sheet transfer onto biomatrix composites, the technique supports predictive confidence in preclinical models of tissue integration and function. It offers a scalable, off-the-shelf approach for therapeutic tissue design applicable across multiple organ systems beyond cardiac tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining cell sheet integrity and lateral adhesions during manipulation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through organized cell delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized, implantable tissue constructs.
- Operational Value: Supports assay readiness through temperature-dependent sheet detachment and transfer, enabling scalable workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by combining organ-specific cells with neovascular-permissive hydrogels and endothelial cells.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation via off-the-shelf, implantable patches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in tissue engineering applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled delivery of layered cell types with preserved interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible cell sheet formation and transfer onto biomatrix platforms.
- Analytics: Generates quantitative outputs via light microscopy and fluorescence tracking to assess sheet integrity and vascular integration.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by constructing implantable patches with vascular potential for functional tissue assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for generating off-the-shelf tissue constructs across multiple organ targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell-cell interactions and organized tissue architecture.
- Operational Value: Standardization and scalability via temperature-sensitive polymer coating and sheet lifting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in tissue integration and survival.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through enhanced predictive value in preclinical tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, biomaterials handling, and temperature-sensitive polymer techniques.
- Depends on UV crosslinking, hydrogel preparation, and precise temperature control for sheet detachment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sheet quality and transfer efficiency.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or organ-specific matrices.
- Includes practical limitations such as solvent hazards during pNIPAM preparation and the need for aseptic handling throughout.
