Name: Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer hoe je een weefsel-geïnspireerde patch bouwt met behulp van celbladen op een thermo-gevoelig polymeer. Deze methode maakt intacte celbladen voor implantatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een New Faculty Award II van het California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), NIH-gefinancierde National Research Award (F32-HL104924) en CIRM Training Grant (TG21163). Materialen werden geleverd door: Glycosan Biosystems Inc / BioTime en Dr. Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

1 Oprichting van PNIPAAm-gecoate platen <ol><li> Los op in 2 ml van een 60% tolueen / 40% hexaanoplossing de 2,6 g PNIPAAm. </li><li> Verwarm het mengsel tot 60 ° C gedurende 10 minuten geroerd, totdat de PNIPAAm opgelost. </li><li> Snijd filtreerpapier in een 60 mm cirkel met een diameter en plaats papier in de Buchner-trechter. </li><li> Filtreer de oplossing door Buchner trechter in de vooraf gewogen glazen beker (gebruik geen kunststof, als hexaan kunststoffen smelten). </li><li> Plaats het bekerglas en de inhoud in een bel vacuüm (24 psi) O / N (16 uur). Let op: Tot het residu wordt omgezet met isopropyl zal oxideren dus zorg ervoor dat het niet in contact komt met zuurstof komen. </li><li> Weeg het bekerglas om het gewicht van de PNIPAAm vast. </li><li> Voeg isopropylalcohol aan de PNIPAAm, waardoor een 50/50 w / w oplossing. </li><li> Breng 2 ml van de oplossing op het oppervlak van de weefselkweekplaat en laag gedurende 5 minuten onder UV licht. </li><li> Was de plaat met 2 ml warm PBS tweemaalvoordat u voor celcultuur. </li></ol> 2 Oprichting van de Cel Sheets Opmerking: Cell vellen primaire cellen voor het doelorgaan kan worden gemaakt met een aantal verschillende methoden, of door het bekleden weefselcultuuroppervlakken met thermo-responsieve polymeer zoals hier beschreven. Pre-coated thermo-gevoelige platen worden ook bij een aantal leveranciers. Opmerking: Dit protocol is voor cultuur met behulp van een 35 mm schaal. In het kort worden cellen eerst geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ten minste 24 uur bij samenvloeiing zijdelingse verbindingen tussen aangrenzende cellen vastgesteld. Om celvellen vrijgeven, worden de platen blootgesteld aan temperaturen onder 32 ° C. De cellaag wordt dan overgebracht naar de sterke base vezelige matrix die een neovasculair permissieve hydrogel met vasculaire endotheelcellen. <ol><li> Isoleer de celpopulatie. Opmerking: Deze methode is afhankelijk van de individuele procedures afleiding en het type cellen. Rat aorta gladde muSCLE cellen (RASMC) worden in dit voorbeeld. Dit zijn primaire gladde spiercellen geïsoleerd uit de abdominale aorta van een rat. </li><li> Was de cellen met 2 ml warm PBS. </li><li> Voeg 3 ml trypsine (of andere splitsen / disassociating oplossing) aan de cellen gedurende 5 minuten. </li><li> Remmen de trypsine door de toevoeging van 3 ml van het kweekmedium of fosfaatbufferoplossing (PBS) bevattende 10% foetaal runderserum (FBS). </li><li> Verzamel de cellen in een conische buis en telt een aliquot. </li><li> Draai de cellen bij 1000 rpm (228 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in hun groei media (SmGM2 plus kogel kit kweekmedium wordt gebruikt voor RASMC). </li><li> Plaats het medium dat de cellen op een 35 mm thermisch gevoelige plate - PNIPAAm beklede plaat bij een concentratie die 100% confluentie te bereiken. Opmerking: Voor RASMCs werd dat aantal bepaald op 100.000 cellen / cm 2 is. Vanwege celverlies tijdens het passeren, 120% van die va<html> lue wordt gebruikt. </li><li> Plaatst in een incubator bij 37 ° CO / N. Opmerking: Het is belangrijk om de cellen te handhaven op 37 ° C om de celadhesie aan de plaat te handhaven. </li></ol> 3 Voorbereiding van Foundational Matrix Opmerking: Verschillende 3D vezelachtige matrices kunnen worden gebruikt om sterke vezelachtige matrix laag tussen de delicate celvellen. Enkele voorbeelden zijn: Gelfoam, bioglas, natuurlijke materialen acellularized 26 of nanospun materialen 27,28 De varkens urineblaas matrix (UBM) die in deze studies werd royaal voorzien van onze medewerker, Dr Badylak 29. <ol><li> Voor gebruik bepalen matrix kenmerken, waaronder het gebrek aan cellulaire gehalte voor ontceld matrix wordt gebruikt, 27,28 celspecifieke levensvatbaarheid en lege ruimte. 22 </li><li> Snijd de vooraf gesteriliseerde matrix in een gewenste grootte en vorm. Opmerking: Hier wordt een hole-punch gebruikt om een ​​4 mm cirkel diameter gesneden. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. Zaaien endotheelcellen in een Neovasculaire Tolerante Hydrogel Opmerking: Endotheliale cellen kunnen worden verkregen uit diverse bronnen, waaronder differentiatie van stamcellen en progenitorcellen. Hier HUVEC gebruikt. <ol><li> Gebruik een permissieve hydrogel (fibrine, collageen gels) zolang de verknoping is kort genoeg om de cellen levensvatbaar blijft. Opmerking: Hier, een hyaluronan (HA) gel verknoopt met een disulfidebrug wordt gebruikt. </li><li> Bereid de HA hydrogel overeenkomstig de vennootschap protocol. </li><li> Verzamel de endotheelcellen en verspreiden in een enkele cel oplossing met 1x trypsine. Opmerking: Accutase of Cell Dissociation Buffer kan ook worden gebruikt voor enkele cel dispersie. </li><li> Schakel de trypsine enzym met gelijkmatige sojaboon trypsine remmer (als het belangrijk dat cellen niet in contact met serum kan komen) of 10% FBS in PBS, het verzamelen van de oplossing / cellen in een 15 ml conische buis. </li><li> Conteer de cellen, en bereken de hoeveelheid die nodig is voor de patch afmetingen (voorheen gekwantificeerd). Opmerking: Voor een 4 mm patch, zijn hier 2 miljoen endotheelcellen gebruikt. </li><li> Extraheer 2 miljoen cellen en plaats in een nieuwe 15 ml conische buis. </li><li> Draaien op (228 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant, waardoor de cellen een pellet in een conische buis. </li><li> Meng de HA en gelatine vloeibare materialen in een 1: 1 verhouding. Voeg dan 80% van het totale volume in de conische buis met de pellet. </li><li> Resuspendeer de endotheelcellen in het 1: 1 HA / Gelatine mengsel </li><li> Plaats de gesuspendeerde cellen in de HA / gelatine mengsel in de basis vezelige matrix uit stap 2. </li><li> Voeg 1/5 (20 procent) van de totale gewenste van de verknoper volume </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li></ol> 5 Isolatie van de Cel Sheets <ol><li> Verwijder de 35 mm PNIPAAm-behandelde platen die de cellen uit de incubator en in een celkweek kap bijRT. </li><li> Snel zuigen de media uit de cellen, en voeg 2 ml van 6% normale gelatine die tot 37 ° C is verhit. </li><li> Terwijl het nog warm gelatine, zet de metalen rooster in de gelatine, onder te dompelen onder het oppervlak van de normale gelatine (Film 1). </li><li> Plaats het gehele bord op ijs gedurende 5 tot 7 minuten, waardoor de gelatine uitharden. </li><li> Na 7 min, met een spatel de gelatine randen nauwkeurig scheiden van de zijkant van de plaat, en een tang om het metaalrooster van de plaat Opmerking lift: de 6% gelatine en de cellaag moet tillen met het rooster. </li><li> Verplaats de cellaag aan de schaal en boven op de basis vezelachtige matrix-hydrogel combinatie voorzichtig waarin het rooster bovenop het construct. Opmerking: de apicale zijde van de cellaag nog steeds in de bovenste positie. </li><li> Voeg 2 ml warm medium (37 ° C). </li><li> Incubeer O / N zodat het vel van de cellen om zich te houden aan de hydrogel oppervlak. </li><li> Verwijder thij metaalrooster na de oplossing opwarmt (ongeveer 1 uur) of de volgende dag. </li></ol>

<ol><li>Ohashi, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+the+liver+and+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of the liver and islets.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).</li>
<li>Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+cardiac+tissue+engineering%3A+Ten+years+of+research+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Mat+Sci+Eng+R%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey.</a> Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).</li>
<li>Jakob, P., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+cell-based+therapy+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Heart+Fail+Rep%22%5BJournal%5D)">Current status of cell-based therapy for heart failure.</a> Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).</li>
<li>Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+in+ischaemic+heart+disease%3A+promise%2C+uncertainties%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges.</a> Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).</li>
<li>Etzion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+embryonic+cardiomyocyte+transplantation+on+the+progression+of+heart+failure+in+a+rat+model+of+extensive+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).</li>
<li>Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering for heart tissue repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).</li>
<li>Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interv+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Strategies for myocardial repair.</a> J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).</li>
<li>Li, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bioengineered+cardiac+graft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Construction of a bioengineered cardiac graft.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).</li>
<li>Muller-Ehmsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+a+damaged+heart%3A+long-term+survival+of+transplanted+neonatal+rat+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction+and+effect+on+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function.</a> Circulation. , 105-1720 (2002).</li>
<li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+integration%2C+and+differentiation+of+cardiomyocyte+grafts%3A+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. , 100-193 (1999).</li>
<li>Roell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+cardiomyoplasty+improves+survival+after+myocardial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury.</a> Circulation. 105, 2435-2441 (2002).</li>
<li>Soonpaa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+approaches+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Potential approaches for myocardial regeneration.</a> Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).</li>
<li>Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+tissue+engineering+mend+broken+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Can tissue engineering mend broken hearts.</a> Circ Res. 90, 120-122 (2002).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity+in+muscle+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).</li>
<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transplantation+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Myoblast transplantation for heart failure.</a> Lancet. 357, 279-280 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myoblast+transplantation+for+repair+of+myocardial+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis.</a> J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).</li>
<li>Orlic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+adult+bone+marrow+cells+repair+myocardial+infarcts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).</li>
<li>Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-hyaluronan-based+composite+hydrogels%3A+a+novel%2C+securable+vehicle+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Appl%22%5BJournal%5D)">Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery.</a> J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).</li>
<li>Kai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-loaded+nanofibrous+patch+promotes+the+regeneration+of+infarcted+myocardium+with+functional+improvement+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model.</a> Acta Biomater. , (2014).</li>
<li>Hong, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+chondrocytes+seeded+on+a+poly%28l-lactic-co-glycolic+acid%29-fibrin%2Fhyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan.</a> J Biomed Mater Res A. , (2014).</li>
<li>Serpooshan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bioengineered+acellular+collagen+patch+on+cardiac+remodeling+and+ventricular+function+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).</li>
<li>Turner, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+development+for+delivery+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+and+cardiac+cells+in+natural+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).</li>
<li>Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+regeneration+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage regeneration using cell sheet technology.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).</li>
<li>Sawa, Y., Miyagawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+perspectives+on+cell+sheet-based+myocardial+regeneration+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy.</a> Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).</li>
<li>Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+therapies+with+and+without+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Advanced cell therapies with and without scaffolds.</a> Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+the+partial+replacement+of+functional+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium.</a> Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+alignment+and+biaxial+mechanical+behavior+of+porcine+urinary+bladder+derived+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix.</a> Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).</li>
<li>Luna, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+biomimetic+topography+for+the+alignment+of+neonatal+and+embryonic+stem+cell-derived+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De kritische stappen in het protocol zijn onder meer: ​​het coaten van de plaat oppervlakken met de warmteresponsieve polymeer en het manipuleren van de cel vellen na het afkoelen van de platen. Omdat verschillende cellen vertonen verschillende fysische eigenschappen, zoals kleefkracht, het opheffen tijd worden geoptimaliseerd voor elk ander celtype. De tweede, en meest significant uitdagende onderdeel van dit protocol, draait om het manipuleren van de cellaag, een cruciaal aspect van de methoden voor het weefsel montag...

Injectie van cellen en/of enkele materialen alleen heeft variabel succes getoond in andere orgaansystemen en beperkt succes in hartregeneratie.5,7-12 Momenteel worden stamcel-afgeleide cellen afgeleverd aan beschadigd weefsel met behulp van verschillende afleveringsmethoden, inclusief: directe celinjectie in weefsel en perfusie in de bloedtoevoer.13-17 Anderen hebben cellen alleen, materialen alleen en/of in combinatie met materiaaldragers geïmplanteerd om beschadigde organen te helpen regenereren.18-21 Dit ontwerp combineert meerdere strategieën die materiaalsterkte, patterning in meerdere materialen en meerdere celtypen bieden. 
Specifiek, de basis geacellulariseerde vezelige matrix biedt de fundamentele fysieke sterkte aan de constructie, waardoor deze geschikt is om indien nodig in de patiënt te worden genaaid. De lege ruimtes in de basismatrix worden gevuld met endotheelcellen in een neovasculair permissieve hydrogel22 voor het snel vestigen van vascularisatie van het geïmplanteerde construct. Dit composiet wordt vervolgens geïntegreerd met voorgepatternde cellagen die verbeterde cel-tot-cel communicatie toestaan, die het natuurlijke weefsel dichter benaderen.1,23-25 Het algemene productieproces voor de gelaagde cellulaire patch wordt geschetst door de stroomdiagram in Figuur 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Cell tracker / live dye</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell dye</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Rat Aortic Smooth Muscle Cells</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Smooth Muscle Media</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Human Venous Endothelial Cells</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan/Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Specific Equipment</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buchner trechter&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UpCell Plates&nbsp;</td><td>Nunc&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV-licht</td><td>Jelight Company&nbsp;</td><td>UVO Cleaner Model No.42</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering: bouw van een meercellige 3d steiger voor de levering van layered cell sheets

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Vele weefsels, zoals de volwassen menselijke harten, zijn niet in staat om na schade adequaat te regenereren. 2,3 Strategies in tissue engineering stellen innovaties om het lichaam te helpen bij het ​​herstel en reparatie. Bijvoorbeeld kan TE benaderingen kunnen hart remodeling na myocardiaal infarct (MI) verzwakken en kunnen verhogen totale hartfunctie een bijna normale pre-MI niveau. 4 Zoals met alle functionele weefsel succesvolle regeneratie van hartweefsel omvat de aanlevering van meerdere celtypen met omgevingsfactoren gunste integratie en het voortbestaan ​​van de geïmplanteerde cellen / weefsel transplantaat. Gemanipuleerde weefsels moeten aanpakken meerdere parameters, waaronder: oplosbare signalen, cel-cel interacties, en matrix materialen geëvalueerd als bestelauto&#39;s, hun effecten op overleving van de cel, materiaal sterkte, en faciliteren van cel-weefsel organisatie. Onderzoeken waarin de directe injectie van transplantaat cellen alleen deze essentiële elementen te negeren. 2,5,6Een weefsel ontwerp combineert deze ingrediënten moet nog worden ontwikkeld. Hier presenteren we een voorbeeld van geïntegreerde ontwerpen middels lagen van patroon celvellen met twee verschillende types van biologisch afgeleide materialen die het type doelorgaan cellen en endotheelcellen voor het verhogen nieuwe vaartuigen formatie in het &quot;weefsel&quot;. Hoewel deze studies richten zich op het genereren van hart-achtige weefsel, kan dit weefsel ontwerp worden toegepast op andere dan hart met minimalistisch design en materiële veranderingen veel organen, en is bedoeld om een ​​off-the-shelf product voor regeneratieve therapieën. Het protocol bevat vijf gedetailleerde stappen. Een temperatuurgevoelige poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) wordt gebruikt voor het bekleden weefselkweekplaten. Dan, weefselspecifieke cellen gekweekt op het oppervlak van de beklede platen / micropattern oppervlakken celvellen sterke laterale verklevingen vormen. Ten derde wordt een basismatrix gemaakt voor het weefsel door het combineren poreuze matrix met neovasculaire permissive hydrogels en endotheelcellen. Tenslotte worden de celvellen vanop PNIPAAm beklede schotels en naar het basiselement, waardoor het volledige construct.

Het stroomschema (figuur 1) toont de algemene werkwijze voor het maken het meerlagige patch. Cell vellen los van de PNIPAAm behandelde plaat laat vallen de temperatuur onder 32 ° C. Toen de cellaag wordt bovenop de verknoopte hydrogel die de endotheelcellen gezaaid in de onderliggende vezelachtige matrix (figuur 1). De voorbehandelde thermo-gevoelige platen kunnen ook worden gebruikt voor het maken van de celvellen. Speciale topologische oppervlakken worden gebruikt om specifiek patroon...

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Het algemene doel van deze procedure is om celvellen te gebruiken voor de constructie van een tissue-engineered patch. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van de celcultuur te behandelen met het thermosensitieve polymeer polypropylacrylamide, ook wel aangeduid als p nipam. De tweede stap is om de betreffende cellen in een hoge dichtheid op het polymeergecoate oppervlak te kweken om celvellen te creëren.Vervolgens worden de vellen opgetild door de temperatuur van de plaat te verlagen, waardoor de cellen als een cellaag van de plaat loslaten. De laatste stap is om de intacte cellagen, zonder ze te scheuren, over te brengen naar een construct voor implantatie. Uiteindelijk kan eenvoudige lichtmicroscopie worden gebruikt om aan te tonen dat de cellaag is gevormd en behouden is gebleven tijdens de manipulatie bij het creëren van een implanteerbaar weefseltechnisch materiaal.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, waarbij cellen in een matrix zoals hydrogels worden ingebed, is dat bij deze techniek de laterale grenzen van de cellen kunnen worden gevormd en behouden als functioneel weefsel. Deze methoden kunnen ook verdere studies in het veld van tissue engineering mogelijk maken. Bijvoorbeeld: hoe goed overleven de cellen na transplantatie wanneer ze zich in deze georganiseerde staat bevinden?Deze procedure wordt gedemonstreerd door dr. William Turner, een postdoctoral fellow in mijn laboratorium, en mevrouw Snapshot sand do. Los voor het begin van deze procedure 2,6 gram P nipam op in twee milliliters van een oplossing bestaande uit 60% toluene en 40% hexaan. Verwarm vervolgens het mengsel gedurende 10 minuten tot 60 °C en roer tot het P nipam volledig is opgelost.Snijd vervolgens het filterpapier in een cirkel met een diameter van 60 millimeter en plaats deze in een Buchner-trechter. Filtreer de oplossing via de Buchner-trechter in een vooraf gewogen glazen bekerglas. Bewaar het bekerglas en de inhoud gedurende de nacht in een vacuümklok.Weeg daarna het bekerglas met p nipam. Voeg vervolgens isopropylalcohol toe aan P nipam om een 50 50 gewicht-gewicht oplossing te maken. Plaats vervolgens twee milliliters van de oplossing op het oppervlak van de weefkweekplaat en laat dit vijf minuten uitharden onder UV-licht.Was vervolgens de plaat twee keer met twee milliliter warme PBS voordat deze wordt gebruikt voor celkweek. In deze procedure worden eerst de gladde spiercellen van de rattenaorta geïsoleerd door de cellen te wassen met twee milliliter warme PBS. Voeg daarna drie milliliter trypsine of een andere splitsende dissociatie-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten.Voeg vervolgens drie milliliter van het kweekmedium of PBS met 10%FBS toe aan de cellen. Verzamel daarna de cellen in een conische buis en tel ze. Centrifugeer de cellen vervolgens 5 minuten bij 1000 RPM.Zuig het supernatant af en resuspendeer de cellen in het groeimedium. Plaats vervolgens het medium met de cellen op een thermosensitieve plaat van 35 millimeter bij een concentratie die een confluentie van 100% zal bereiken, en incubeer dit vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C om de celadhesie aan de plaat te behouden. Verzamel nu de endotheelcellen en dispergeer deze tot een enkelcel-suspensie.Voor de dispersie van enkelvoudige cellen kan ook 1x trypsine, Accutase of een cel-dissociatiebuffer worden gebruikt. Deactiveer vervolgens het trypsine-enzym met een gelijke hoeveelheid soja-trypsine-inhibitor of 10% FBS in PBS. Verzamel de cellen daarna in een conische buis van 15 milliliter.Tel de cellen met een hemocytometer en bereken het volume dat nodig is voor de afmetingen van de patch; voor een patch van vier millimeter worden 2 miljoen endotheelcellen gebruikt. Extraheer daarna 2 miljoen cellen en plaats deze in een nieuwe conische koker van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten en aspireer het supernatant, zodat de cellen als pellet in de conische koker achterblijven. Bereid nu de high aurin-hydrogel voor in overeenstemming met het protocol van de fabrikant.Meng high aurin en vloeibare gelatine in een verhouding van één-op-één. Draag vervolgens 80% van het totale eindvolume over naar de conische buis met het pellet en resuspendeer de endotheelcellen in het high aurin-gelatinemengsel. Draag daarna de gesuspendeerde cellen over naar de fibreuze matrix.Voeg 20% van het totale eindvolume van de crosslinker toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Haal in deze stap de 35 millimeter P nypa-behandelde plaat met de cellen uit de incubator en plaats deze in een celkweekkast. Zuig het medium bij kamertemperatuur snel van de cellen af.Voeg vervolgens twee milliliter 6% normale gelatine van 37 °C toe aan de plaat terwijl de gelatine nog warm is, plaats het metalen rooster in de gelatine en dompel het onder het oppervlak van de normale gelatine. Plaats daarna de gehele plaat gedurende vijf tot zeven minuten op ijs, zodat de gelatine kan stollen. Gebruik na zeven minuten een spatel om de randen van de gelatine voorzichtig los te maken van de zijkant van de plaat.Til vervolgens het metalen rooster met een pincet van de plaat op. Breng de cellaag over naar de schaal en plaats deze bovenop de combinatie van de fibreuze matrix en de hydrogel. Voeg twee milliliters medium van 37 °C toe aan de kweekplaat en incubeer dit gedurende de nacht om de cellaag aan het hydrogeloppervlak te laten hechten.Verwijder ondertussen het metalen rooster zodra de oplossing is opgewarmd. Hierbij werden cellen gekweekt op een Pippa-gecoat oppervlak en vervolgens als een vel naar het oppervlak van de vezelmatrix verplaatst. Eerdere pogingen waarbij geen overdracht met het gelatinemetalen rooster plaatsvond, resulteerden in kleine, gerafelde stukjes.Deze afbeelding is een samengestelde weergave van een vroeg patch-ontwerp, waarin de mito tracker, roodgekleurde gladde spiercellen uit de rat aortae, calcium am green fluorescerende endotheelcellen uit de menselijke navelstrengader en het beeld bij doorgelaten licht zijn gecombineerd. En dit is het composiet van de celvellen gecombineerd met de sterkere vezelige matrix hydrogel-combinatie. Dit composietbeeld is vanuit de onderkant van de patch door de sterkere vezelige matrix genomen, en deze composietafbeelding van de celvellen is bovenop de vezelige matrix genomen.De hydrogelcombinatiecellen in de laag bedekken de basisvezelmatrix-hydrogelcombinatie, waarbij aan de randen een verhoogde fluorescentie zichtbaar is door clustering van de cellen. Dit is een transmissiebeeld van het construct, en de autofluorescerende natuurlijke vezelige basismatrix wordt hier in DPI getoond. Na deze procedure kunnen andere weefseltechnologische experimenten vragen beantwoorden zoals de manier waarop celuitlijning en communicatie het transplantatiesucces beïnvloeden.Deze techniek stelt onderzoekers in de weefseltechniek in staat om complexe manieren voor het transplanteren van meerdere celtypen te verkennen. Houd er rekening mee dat het werken met oplosmiddelen uiterst gevaarlijk kan zijn. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van geschikte maskers en het werken in chemische zuigkappen.

tissue-engineering-construction-multicellular-3d-scaffold-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

In dit werk werden poly(melkzuur)/polyethyleenglycol (PLA/PEG) scaffolds bereid door gebruik te maken van een combinatie van smeltmengen en selectieve uitloging. De hier besproken methode maakte het mogelijk om drie-laags scaffolds te ontwikkelen door zowel de porositeit als de poriëngrootte nauwkeurig te beheersen. De mechanische eigenschappen werden ook geëvalueerd in een fysiologische omgeving.

Een Facile en Eco-vriendelijke Route naar Poly (melkzuur) Steigers met Graded Pore Size Fabriceer

We laten zien een nieuwe methode voor de bouw van een enkele cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergadering zonder een kunstmatige steiger.

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Dit artikel biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de opbouw van meerdere lagen stamcel bladen met de cel van de stam van de gunstige eigenschap.

Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

Hierin demonstreren we een organoïdemodel in drie stappen (tweedimensionale [2D] expansie, 2D-stimulatie, driedimensionale [3D] rijping) dat een veelbelovend hulpmiddel biedt voor fundamenteel peesonderzoek en een potentiële steigervrije methode voor peesweefselmanipulatie.

Demonstratie van zelf-geassembleerde celbladcultuur en handmatige generatie van een 3D-pees/ligament-achtige organoïde met behulp van menselijke dermale fibroblasten

We ontwierpen een nieuwe mechanische belasting bioreactor die eenassige of bi-axiale mechanische spanning voorafgaand aan de transplantatie kan toepassen op een kraakbeen biocomposite in een gewrichtskraakbeendefect.

Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering

Leer hoe je een weefsel-geïnspireerde patch bouwt met behulp van celbladen op een thermo-gevoelig polymeer. Deze methode maakt intacte celbladen voor implantatie mogelijk.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Meer video's verkennen