Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Het algemene doel van deze procedure is om celvellen te gebruiken voor de constructie van een tissue-engineered patch. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van de celcultuur te behandelen met het thermosensitieve polymeer polypropylacrylamide, ook wel aangeduid als p nipam. De tweede stap is om de betreffende cellen in een hoge dichtheid op het polymeergecoate oppervlak te kweken om celvellen te creëren.

Vervolgens worden de vellen opgetild door de temperatuur van de plaat te verlagen, waardoor de cellen als een cellaag van de plaat loslaten. De laatste stap is om de intacte cellagen, zonder ze te scheuren, over te brengen naar een construct voor implantatie. Uiteindelijk kan eenvoudige lichtmicroscopie worden gebruikt om aan te tonen dat de cellaag is gevormd en behouden is gebleven tijdens de manipulatie bij het creëren van een implanteerbaar weefseltechnisch materiaal.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, waarbij cellen in een matrix zoals hydrogels worden ingebed, is dat bij deze techniek de laterale grenzen van de cellen kunnen worden gevormd en behouden als functioneel weefsel. Deze methoden kunnen ook verdere studies in het veld van tissue engineering mogelijk maken. Bijvoorbeeld: hoe goed overleven de cellen na transplantatie wanneer ze zich in deze georganiseerde staat bevinden?

Deze procedure wordt gedemonstreerd door dr. William Turner, een postdoctoral fellow in mijn laboratorium, en mevrouw Snapshot sand do. Los voor het begin van deze procedure 2,6 gram P nipam op in twee milliliters van een oplossing bestaande uit 60% toluene en 40% hexaan. Verwarm vervolgens het mengsel gedurende 10 minuten tot 60 °C en roer tot het P nipam volledig is opgelost.

Snijd vervolgens het filterpapier in een cirkel met een diameter van 60 millimeter en plaats deze in een Buchner-trechter. Filtreer de oplossing via de Buchner-trechter in een vooraf gewogen glazen bekerglas. Bewaar het bekerglas en de inhoud gedurende de nacht in een vacuümklok.

Weeg daarna het bekerglas met p nipam. Voeg vervolgens isopropylalcohol toe aan P nipam om een 50 50 gewicht-gewicht oplossing te maken. Plaats vervolgens twee milliliters van de oplossing op het oppervlak van de weefkweekplaat en laat dit vijf minuten uitharden onder UV-licht.

Was vervolgens de plaat twee keer met twee milliliter warme PBS voordat deze wordt gebruikt voor celkweek. In deze procedure worden eerst de gladde spiercellen van de rattenaorta geïsoleerd door de cellen te wassen met twee milliliter warme PBS. Voeg daarna drie milliliter trypsine of een andere splitsende dissociatie-oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten.

Voeg vervolgens drie milliliter van het kweekmedium of PBS met 10%FBS toe aan de cellen. Verzamel daarna de cellen in een conische buis en tel ze. Centrifugeer de cellen vervolgens 5 minuten bij 1000 RPM.

Zuig het supernatant af en resuspendeer de cellen in het groeimedium. Plaats vervolgens het medium met de cellen op een thermosensitieve plaat van 35 millimeter bij een concentratie die een confluentie van 100% zal bereiken, en incubeer dit vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C om de celadhesie aan de plaat te behouden. Verzamel nu de endotheelcellen en dispergeer deze tot een enkelcel-suspensie.

Voor de dispersie van enkelvoudige cellen kan ook 1x trypsine, Accutase of een cel-dissociatiebuffer worden gebruikt. Deactiveer vervolgens het trypsine-enzym met een gelijke hoeveelheid soja-trypsine-inhibitor of 10% FBS in PBS. Verzamel de cellen daarna in een conische buis van 15 milliliter.

Tel de cellen met een hemocytometer en bereken het volume dat nodig is voor de afmetingen van de patch; voor een patch van vier millimeter worden 2 miljoen endotheelcellen gebruikt. Extraheer daarna 2 miljoen cellen en plaats deze in een nieuwe conische koker van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten en aspireer het supernatant, zodat de cellen als pellet in de conische koker achterblijven. Bereid nu de high aurin-hydrogel voor in overeenstemming met het protocol van de fabrikant.

Meng high aurin en vloeibare gelatine in een verhouding van één-op-één. Draag vervolgens 80% van het totale eindvolume over naar de conische buis met het pellet en resuspendeer de endotheelcellen in het high aurin-gelatinemengsel. Draag daarna de gesuspendeerde cellen over naar de fibreuze matrix.

Voeg 20% van het totale eindvolume van de crosslinker toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Haal in deze stap de 35 millimeter P nypa-behandelde plaat met de cellen uit de incubator en plaats deze in een celkweekkast. Zuig het medium bij kamertemperatuur snel van de cellen af.

Voeg vervolgens twee milliliter 6% normale gelatine van 37 °C toe aan de plaat terwijl de gelatine nog warm is, plaats het metalen rooster in de gelatine en dompel het onder het oppervlak van de normale gelatine. Plaats daarna de gehele plaat gedurende vijf tot zeven minuten op ijs, zodat de gelatine kan stollen. Gebruik na zeven minuten een spatel om de randen van de gelatine voorzichtig los te maken van de zijkant van de plaat.

Til vervolgens het metalen rooster met een pincet van de plaat op. Breng de cellaag over naar de schaal en plaats deze bovenop de combinatie van de fibreuze matrix en de hydrogel. Voeg twee milliliters medium van 37 °C toe aan de kweekplaat en incubeer dit gedurende de nacht om de cellaag aan het hydrogeloppervlak te laten hechten.

Verwijder ondertussen het metalen rooster zodra de oplossing is opgewarmd. Hierbij werden cellen gekweekt op een Pippa-gecoat oppervlak en vervolgens als een vel naar het oppervlak van de vezelmatrix verplaatst. Eerdere pogingen waarbij geen overdracht met het gelatinemetalen rooster plaatsvond, resulteerden in kleine, gerafelde stukjes.

Deze afbeelding is een samengestelde weergave van een vroeg patch-ontwerp, waarin de mito tracker, roodgekleurde gladde spiercellen uit de rat aortae, calcium am green fluorescerende endotheelcellen uit de menselijke navelstrengader en het beeld bij doorgelaten licht zijn gecombineerd. En dit is het composiet van de celvellen gecombineerd met de sterkere vezelige matrix hydrogel-combinatie. Dit composietbeeld is vanuit de onderkant van de patch door de sterkere vezelige matrix genomen, en deze composietafbeelding van de celvellen is bovenop de vezelige matrix genomen.

De hydrogelcombinatiecellen in de laag bedekken de basisvezelmatrix-hydrogelcombinatie, waarbij aan de randen een verhoogde fluorescentie zichtbaar is door clustering van de cellen. Dit is een transmissiebeeld van het construct, en de autofluorescerende natuurlijke vezelige basismatrix wordt hier in DPI getoond. Na deze procedure kunnen andere weefseltechnologische experimenten vragen beantwoorden zoals de manier waarop celuitlijning en communicatie het transplantatiesucces beïnvloeden.

Deze techniek stelt onderzoekers in de weefseltechniek in staat om complexe manieren voor het transplanteren van meerdere celtypen te verkennen. Houd er rekening mee dat het werken met oplosmiddelen uiterst gevaarlijk kan zijn. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van geschikte maskers en het werken in chemische zuigkappen.