Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:

Het algemene doel van het volgende experiment is om de reactieve veranderingen van perifere neuronen in verschillende pancreasmicro-omgevingen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst weefsellysaten te genereren van een normale menselijke pancreas en van ziek pancreasweefsel. In een tweede stap worden DRG-cellen geïsoleerd uit pasgeboren ratten, die vervolgens worden behandeld met de geïsoleerde weefsellysaten.

Vervolgens worden de cellen, na een incubatie van 48 uur, gefixeerd voor een daaropvolgende dubbele immunofluorescentiekleuring. De resultaten tonen de verschillen in het vertakkingspatroon van de neurietdichtheid van neuronen en de glia-dichtheid van neuronen die zijn gekweekt in verschillende weefselextracten. Deze methode kan studies in het veld van de neuro-gastroenterologie faciliteren, zoals onderzoek naar de rol van moleculaire mediatoren bij neuroplastische veranderingen bij verschillende gastro-intestinale aandoeningen.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de verschillende neurotrofe eigenschappen van pancreasziekten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals kanker of inflammatoire toestanden van het gehele maagdarmkanaal. We kregen voor het eerst het idee om deze methode te gebruiken toen we onze samenwerkingen startten met onderzoekers op het gebied van neuropathische ziekten in het pediatrische systeem, zoals de ziekte van Ong, en pasten dit toe voor onze doeleinden om het menselijke pancreasweefsel te homogeniseren. Verplaats blokjes pancreasweefsel van 5 bij 5 bij 5 millimeter direct van -80 °C naar vloeibare stikstof.

Plaats de bevroren blokjes vervolgens eerst in homogenisatiebuisjes waarin een metalen dissociatiebal past, en homogeniseer deze daarna in de weefselhomogenisator zonder het weefsel direct na dissociatie te laten ontdooien. Resuspendeer het vaste poederachtige homogenaat in 300 tot 500 µL ijskoude 0.1 X PBS. Gebruik geen lysisbuffer, aangezien dit kan.

Lyseer de neuronen en centrifugeer het homogenaat vervolgens bij 21.130 ×g bij vier graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten. Verzamel het heldere supernatant, dat het weefselextract bevat, om cellijn-supernatant van humane pancreascellijnen te verkrijgen. Kweek de cellen tot ten minste 70 tot 80% confluentie in normaal groeimedium.

Wanneer ze klaar zijn, was de cellen ten minste drie keer met celluultuur-grade PBS en kweek ze tot 48 uur in serumvrij medium. Meet vervolgens de proteïneconcentratie van het weefselhomogenaat of de supernatanten van de cellijn via de Bradford-proteïneassay. Verdeel daarna de weefselextracten en de supernatanten van de cellijn in aliquoten, zodanig dat de uiteindelijke concentratie van het extract of supernatant in het neuronale medium 100 µg/mL is.

En bewaar deze bij -80 °C. Snijd met een gedecapiteerde P2 tot P12 pasgeboren rat de huid open en leg de wervelkolom bloot. Voer vervolgens een anterieure laminectomie uit om het ruggenmerg bloot te leggen.

Leg vervolgens de dorsale wortelknoppen (DRG) bloot en verwijder deze. Plaats de DRG in ijskoud MEM aangevuld met Gentamicine en metronidazol. Ga door met het verzamelen van DRG's, beginnend bij de caudale DRG's en werkend naar de bovenste cervicale DRG's.

Wanneer er voldoende is verzameld, zijn 52 DRG's genoeg voor een plaat met 24 wells. Gebruik vervolgens microschaartjes om de DRG's te scheiden van hun wortels en zenuwen. Snijd daarna alle overgebleven perifere en centrale projecties weg.

Incubeer de verzamelde DRG's in HBSS aangevuld met collagenase type twee bij 37 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Tritureer de DRG's na incubatie door spuiten met een afnemende diameter.

Let op dat een overmaat aan tri neuronen kan vernietigen, maar minder destructief is voor glia. Zodra het medium met de DRG's troebel is geworden, centrifugeert u de suspensie bij 93.9 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het medium en resuspendeer.

Suspendeer de cellen in neurobasaal medium om de cellen voorbereid te maken voor kweek. Gebruik een hemocytometer om het totale aantal neuronen en glia te schatten. Zaai de cellen vervolgens uit op vooraf gecoate dekglasplaatjes van 13 millimeter.

In een plaat met 24 wells hangt de gebruikte coating af van de experimentele doelstellingen. Vul de wells vervolgens aan met neurobasaal medium en laat de cellen een nacht hechten aan de wells. Ontdooi de volgende dag het medium aangevuld met weefselextract of het medium aangevuld met het supernatant van de cellijn.

Aspireer vervolgens het zaaimedium van de DRG's en voer optioneel een zeer voorzichtige wasbeurt uit met PBS. Pipetteer daarna langzaam het weefselextract-gesupplementeerde medium of het met cellijn-supernatans gesupplementeerde medium op de cellen om een concentratie van 100 µg/mL te verkrijgen. Laat de cellen nu 48 uur groeien bij 37 °C in het medium met weefselextract of cellijn-supernatans.

Zuig het medium af en fixeer in 4%paraformaldehyde voor immunokleuring. Gebruik voor dubbele immunofluorescentiekleuring neuron-specifieke en glia-specifieke markers voor morphometrie. Gebruik een omgekeerde lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera in combinatie met geautomatiseerde software om de neuritendichtheid te meten bij een 200 x vergroting.

Meet de neuritendichtheid van neuronale culturen door een raster van 50 bij 50 micron over de afbeeldingen te leggen en de vezeldichtheid per vierkant te tellen in de snijpunten van de vezels. Herhaal deze analyse voor vier verschillende regio's met de dichtste groei op vier tot vijf representatieve fotomicrografieën per dekglas. Meet de gemiddelde uitgroei van neurieten, het gemiddelde aantal vertakkingen per neuron, de gemiddelde taklengte en de grootte van het pericellulaire gebied bij 30 willekeurig geselecteerde solitaire neuronen per dekglas door de neurieten en het pericellulaire gebied te markeren; DRG-neuronen gecultiveerd met een weefselextract van een normale pancreas worden hier getoond.

In tegenstelling hiermee vertonen DRG-neuronen die zijn gekweekt met weefselextracten van chronische pancreatitis of pancreaskanker een grotere neurietdichtheid. Hier zijn myenterische plexusneuronen die zijn gekweekt met verschillende humane pancreasweefselextracten.

Myenterische plexusneuronen die zijn gekweekt in extracten van chronische pancreatitis of pancreaskanker vormen langere neuronen en vertonen een complexer vertakkingspatroon dan neuronen die zijn gekweekt in extracten van een normale pancreas. Wanneer DRG-neuronen werden gekweekt met het supernatant van pancreaskankercellen, werd eveneens een toename in neurondichtheid waargenomen, vergelijkbaar met wat werd gezien bij weefselextracten. Deze toename was echter omkeerbaar wanneer geselecteerde neurotrofe factoren, zoals our tein of nerve growth factor, werden uitgeput of geblokkeerd.

Ggl-cellen reageren bovendien verschillend op verschillende extracten van pancreasteweefsel; extracten van chronische pancreatitis of pancreaskanker verhoogden de gliale groei en het aantal gliacellen in gliale culturen afgeleid van DRG. Hoewel het effect sterker was bij pancreaskanker dan bij extracten van chronische pancreatitis. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vier tot vijf uur worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast na de ontwikkeling ervan.

Deze methode heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de neurogastroenterologie om mechanismen van neuroplasticiteit bij verschillende maagdarmziekten te onderzoeken, waaronder inflammatoire en maligne gastro-intestinale aandoeningen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u perifere neuronen kunt isoleren om pancreatische neuroplasticiteit te bestuderen, en hoe u dat systeem en andere neurale veranderingen en andere neuroplasticiteitsassays bij maagdarmziekten kunt implementeren.