Name: Simuleren Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticiteit Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer een in vitro-assay voor het simuleren van pancreasneuroplasticiteit met DRG- en myenterische plexusneuronen van ratten. Deze methode maakt morfologische en elektrofysiologische analyse van neuronale en gliareacties op weefselextracten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle auteurs bijgedragen aan de totstandkoming en validatie van de gepresenteerde analyse en het ontwerp van het manuscript.

Alle dierlijke experimentele procedures in het protocol volgen het dier zorg richtlijnen van Technische Universität München, Duitsland. 1. Media / Extract Voorbereiding <ol><li> Tissue homogenisering De kwaliteit van het weefsel homogenisering is cruciaal voor de daaropvolgende detectie van plastische veranderingen in de gekweekte neuronen. Hier wordt een homogenisator aanbevolen waardoor weefsel dissociatie mogelijk maakt zonder grote toename van de weefseltemperatuur. <ol><li> Transfer 5 mm x 5 mm x 5 mm blokjes pancreas weefsel direct van -80 ° C tot vloeibare stikstof en in een vaste fase in het weefsel homogenator. De ideale homogenator zou het weefsel snel genoeg distantiëren, zonder dat het te ontdooien. </li><li> Onmiddellijk na dissociatie, resuspendeer de vaste, poedervormige homogenaat in 300-500 gl 0,1 x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Hier, gebruik geen lysis buffer (zoals RIPA) aangezien dit kan de neuronen lyseren.</li><li> Centrifugeer de homogenaten gedurende ten minste 15 minuten op de maximale snelheid van uw bank centrifuge (bijv. 21.130 xg). Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof, die het weefsel extract vertegenwoordigt. </li></ol></li><li> Cellijn supernatanten <ol><li> Laat de cellen van belang ten minste 70 te bereiken - 80% samenvloeiing in normale groeimedium. </li><li> Meestal zijn deze media bevatten serumcomponenten en kunnen oncontroleerbare effecten uitoefenen op de groei van neuronen. Daarom, na het bereiken van de gewenste cel dichtheid, was uw cellen minstens 3x met celcultuur graad PBS en plaats ze in serum-vrij medium (SFM) voor maximaal 48 uur. Opmerking: Hier, van mening dat sommige cellen (zoals alvleesklier stellaatcellen) serum kan nodig zijn in hun groei media om hun normale toestand en structuur te behouden. In dat geval voeren seriële verdunningen van het serum in het medium van de cel van belang om een ​​zo laag mogelijke serumgehalte noodzakelijk intacte cel functio voorbeeldn. </li><li> Meet de eiwitconcentratie van het weefsel homogenaat of celsupernatanten via Bradford eiwittest. Hoewel deze waarden afhankelijk van het weefsel en celtype, voor alvleesklier weefselextracten, zou een concentratiebereik van 5-12 ug / ul verwacht, en cellijn supernatanten van 3-8 ug / ul. </li></ol></li></ol> 2. Aliquot Extracten en celsupernatanten Afhankelijk van de concentratie voor gebruik in de test, moet de uiteindelijke concentratie van het extract of supernatant in neuronale medium 100 ug / ml 5,8. Opmerking: Voor een test met neuronen groeien in 500 pi medium in elk putje van een 24-well plaat, moet men 50 ug eiwit uit elk extract of supernatant per putje. Bij een typische extract concentratie van ongeveer 10 ug / ul, zou een 5 pl extract / supernatant nodig voor elke wel. In elke setting uitgevoerd als een drievoud, zou dit overeenkomen met 15 ul extract / supernatant. Voor verschillende weefsel of celtypen, voeren seriële verdunningen van het uiteindelijke extract of de concentratie supernatant en de waargenomen neurotrofe effecten tussen verschillende concentraties extract / supernatant vergelijken. 3. Isolatie van neuronen Zodra de collectie extract / supernatant klaar is, doorgaan met isolatie van neuronen. <ol><li> Voor DRG neuronen, het verzamelen van de cervicale lumbale DRG van pasgeboren ratten tussen postnatale dag (P) 2-12 na onthoofding en stereomicroscopic dissectie van DRG (figuur 1A). Om voldoende DRG neuronen hebben voor een 24-well plaat, verzamel alle cervicale lumbale DRG van een pasgeboren rat (gelijk aan 52 DRG) per plaat. <ol><li> Knip de perifere (neurale) en centrale projecties (wortels) van DRG door middel van microscissors. Het verlaten van de projecties in plaats belemmert aanwrijven en verhoogt thij contaminatie risico van cultuur door de fibroblasten. </li></ol></li><li> Voor MP neuronen, weggesneden het mesenterium van de dunne darm en de hand voorzichtig strip uit de seromuscular laag van de dunne darm (voor een gedetailleerd protocol op MP isolatie, zie Schäfer et al.. 9, figuur 1B). Voor MP, het verzamelen van de plexus van twee ratten per 24-well-plaat. Opmerking: Probeer zo zacht mogelijk zijn om scheuren in de seromuscular laag te vermijden, omdat zij de succesvolle scheiding van de dunne darm te belemmeren. </li><li> Verzamel de DRG en seromuscular laag in ijskoud minimaal essentieel medium (MEM) met gentamicine (20 mg in 500 ml medium) en metronidazol (2.5 mg in 500 ml medium) geleverd. </li><li> Na verzameling van DRG, broeden ze in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met collagenase type II gedurende 20-30 min. geleverd. Voor MP isolatie incuberen bij type collagenase tussen 1-3 uur, afhankelijk van de leeftijdvan het dier (figuur 1C). </li><li> Voor MP, het verzamelen van de netto-achtige MP stukken onder stereomicroscoop en transfer naar ijskoude MEM. </li><li> Vermaal dan de DRG en MP door spuiten met afnemende diameter. Opmerking: Overmatige fijnwrijving kan de neuronen vernietigen, maar minder de gliacellen. </li><li> Zodra het medium dat de DRG of MP is geworden bewolkt, centrifuge de suspensie bij 93,9 g gedurende 5 min, gooi het medium en resuspendeer in Neurobasal medium (aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27). </li><li> Tel het aantal cellen (bijvoorbeeld neuronen en glia) door middel van een hemocytometer. Opmerking: Het aantal benodigde cellen is afhankelijk van de parameter meting. Voor de kwantificering van neurieten dichtheid, moet men dichter culturen en dus een groter aantal cellen dan voor het meten van neuriet uitgroei perikaryonal maaten vertakking van individuele neuronen. Voor metingen neuriet dichtheid, gebruik bijv. 10.000 cellen (neuron + glia) / goed of 1500 neuronen / goed. Voor morfometrie op individuele neuronen, kort (1 minuut lang) trypsinatie van cellen en het zaaien van 2500 cellen / putje of 400 neuronen / goed wordt aanbevolen. De typische opbrengst van cellen verkregen van een rat is ongeveer 300.000-500.000 cellen. </li><li> Zaad de cellen op 13 mm dekglaasjes die eerder bekleed nacht en boven de putjes met Neurobasal medium (gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27) (Fig. 1D). Opmerking: Gebruik poly-D-lysine (40 mg / m 2) OR-ornithine en laminine beklede (1 mg / ml elk) beklede dekglaasjes. Cellen hechten aan poly-D-lysine zeer snel, waardoor het geschikt is voor experimenten waarin vele cellen nodig (bijvoorbeeld neurieten dichtheidsmetingen). Gehechtheid aan laminin is in het algemeen een aantalwat zwakker, maar laminine is een sterke promotor van neuriet uitgroei. Daarom, voor metingen op neuronale vertakking en neurieten lengte liever ornithine / laminine-coating. </li><li> Toestaan ​​dat de cellen hechten aan de putjes &#39;s nachts. Op de volgende dag bereiden extract aangevuld medium (in een eindconcentratie extract / supernatant van 100 ug / ml). </li><li> Zuig het zaaien medium, en het uitvoeren van een optionele, zeer zacht wassen met PBS, en dan langzaam pipet het extract /-supernatant aangevuld media (figuur 1E). </li><li> Laat de cellen groeien voor 48 uur. Zuig de media en vast te stellen in 4% paraformaldehyde voor immuunkleuring (Figuur 1F). </li><li> Voer dubbele immunofluorescentiekleuring behulp neuron-specifieke (bijv. beta III-tubuline) en glia-specifieke (bijv. gliale fibriallary zure eiwit / GFAP) markers (figuur 1G). </li><li> Voor morfometrie, gebruiken een omgekeerde lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera in combinatie with geautomatiseerde software die meting van neuriet dichtheid mogelijk maakt (zie tabel). </li><li> De neurite dichtheid van neuronale culturen wordt gemeten op 4-5 representatieve microfoto bij 200x vergroting van 4 verschillende regio&#39;s van dichtste groei op elke dekglaasje door overlappen een 50 micrometer x 50 micrometer raster en het tellen van de vezel dichtheid per vierkante gemeten in de kruisende vezels. Neurietuitgroei, gemiddeld aantal takken per neuron, kan de gemiddelde tak lengte en perikaryonal maat worden gemeten van willekeurig geselecteerde 30 solitaire neuronen uit elke dekglaasje door het markeren van de neurieten en perikarya (Figuur 1H). </li></ol>

<ol><li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract%3A+chronic+inflammation%2C+neurotrophic+signals%2C+and+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li>
<li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li>
<li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li>
<li>Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li>
<li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li>
<li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li>
<li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li>
<li>Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin%2FGFRalpha2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li>
<li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen en geen financiële informatie.

Het huidige protocol is bedoeld om de methode te illustreren achter de in vitro alvleesklier neuroplasticiteit test die onlangs werd ontwikkeld door onze groep om de mechanismen van neuroplasticiteit te bestuderen in PCa en CP 5. Het protocol omvat een driedaagse procedure die gemakkelijk kan worden aangebracht nadat de uitvoerder voldoende ervaring in de isolatie en de cultuur van DRG en MP neuronen heeft opgedaan. Bovendien vormt het een waardevol instrument voor het bestuderen van de gelijktijdige...

Veranderingen in gastro-intestinale (GI) zenuw morfologie en dichtheid hebben de aandacht van gastro-enterologen en pathologen gevangen voor een lange tijd, maar het belang daarvan voor de pathofysiologie van GI-aandoeningen blijft onbekend 1-3. Sterker nog, een aantal zeer gemeenschappelijke GI aandoeningen zoals gastritis, refluxoesofagitis, colitis, diverticulitis en appendicitis worden geassocieerd met een verhoogde innervatie dichtheid in ontstoken weefsel gebieden 1. Er is echter geen echte aandacht tot nu toe besteed aan de mechanismen en de betekenis van neuroplasticiteit in het maag-darmkanaal. Heeft morfologisch veranderde GI zenuwen afwijken van de normale GI zenuwen, dat wil zeggen de normale toestand van het enterische zenuwstelsel, in termen van hun functie? Wat zijn de gevolgen van veranderde neuropeptide / neurotransmitter inhoud in plastic enterische zenuwen? Ofwel perifere neuroplasticiteit brengen altijd veranderde signalering naar het centrale zenuwstelsel? En waar zijn de centrale projecties van plastic extriNSIC GI zenuwbanen? Een lange reeks van dergelijke belangrijke vragen kunnen eenvoudig worden gegenereerd als we kijken naar het gebrek aan kennis over de functionele aspecten van GI neuroplasticiteit. De studie van GI neuroplasticiteit op functioneel niveau vereist geldige, reproduceerbare en nog steeds gemakkelijk toepasbaar experimentele modellen. In een tijdperk van toenemende populariteit en acceptatie van genetisch gemanipuleerde conditionele muismodellen (GECoMM), zoals in vivo instellingen dragen het potentieel om voorheen onbekende facetten van GI neuroplasticiteit te ontrafelen in een realistische manier 1. Echter, het ontwerp en de productie van GECoMM blijft duur, arbeidsintensief en vooral tijdrovend. Bovendien, ze vereisen het a priori selectie van de doelstelling om voorwaardelijk worden gemoduleerd in de genetisch veranderde muis (zoals transgene overexpressie van zenuwgroeifactor / NGF in enterische epitheelcellen). Vandaar dat voor de desIGN van een succesvolle GECoMM, onderzoekers moeten sommige indicatoren (bv. vorige experimentele gegevens) van een waardevol doel, dat wil zeggen dat het molecuul van belang (hier NGF) ten minste kan worden verwacht om een aantal biologisch relevante effecten op de GI zenuwen uitoefenen. Dergelijke indicatoren kunnen eenvoudig worden afgeleid uit geschikte in vitro modellen waarin geïsoleerde cel subtypes van het complex micromilieu van een in vivo systeem selectief kan worden gekweekt samen op heterotypische wijze 4-7. De modulatie van eiwitten in dergelijke heterotypische cultuur instelling gemiddeld minder technisch omslachtig, sneller, en derhalve helpen bij het ​​voorfilteren van nuttige doelen voor verificatie in vivo studies. Onlangs presenteerden we een in vitro neuroplasticiteit assay die werd ontworpen om te simuleren het verhoogde neurale dichtheid en hypertrofie van intrapancreatic nerves in menselijke alvleesklierkanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) weefsels. Hier neuronen afgeleid van pasgeboren rat dorsale wortel ganglia (DRG) of myenterische plexus (MP) werden blootgesteld aan weefselextracten van chirurgisch weggesneden PNA CP weefsels specimens en vergeleken met die gekweekt in normale humane pancreas (NP) weefselextracten 5. In plaats van weefsel extracten, kan men ook gebruik maken van cellijn bovenstaande vloeistoffen om de impact van geselecteerde celtypen op neuroplasticiteit te bestuderen. In combinatie met een gestandaardiseerde morfometrische meting de gepresenteerde neuroplasticiteit test kan bruikbaar en reproduceerbare beoordeling van neuronale plasticiteit in reactie op verschillende micro-omgevingen alvleesklier. In het bijzonder, kan de simulatie van 1) morfologische neuroplasticiteit, dus de veranderingen in de neuriet uitgroei, vertakking en neuronale maat, en 2) functionele neuroplasticiteit, dus veranderingen in de prikkelbaarheid van perifere neuronen. Bovendien zijn niet alleen randapparaat (dwz </em&gt; Enterische), maar ook centraal (bijv. DRG en tweede orde spinale) neuronen kunnen in de onderhavige bepalingsmethode hun morfologische en functionele reactie op verschillende inhoud GI weefsel te beoordelen. In de huidige video tutorial laten we zien het technisch protocol voor het uitvoeren van deze test en bespreken de voordelen en zwakke punten. In het bijzonder vestigen wij de aandacht op de toepasselijkheid van de fundamentele notie van deze test aan de studie van neuroplasticiteit in een GI orgel.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Ornithine/laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533/L4544</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Coverslips</td><td>Merck</td><td></td><td>Voor gebruik in 24-well platen</td></tr><tr><td>Dismembranator S</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-III-tubulin-antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB1637</td><td>1:200 concentratie</td></tr><tr><td>Anti-GFAP-antilichaam</td><td>DAKO</td><td>M0761</td><td>1:400 concentratie</td></tr><tr><td>RIPA buffer + protease remmer</td><td></td><td></td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>17504044</td><td>De kwaliteit van B-27 is bekend om afhankelijk te zijn van het lotnummer</td></tr><tr><td>Gentamicin/Metronidazol</td><td></td><td></td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>Minimal essential medium</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>24020133</td><td>Verbetert collagenase-activiteit wanneer het Ca/Mg bevat</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS-2</td><td>Verkrijg partij met minimaal 200 U/mg activiteit</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25%</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>analySIS docu software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simuleren pancreatic neuroplasticity:<em&gt; in vitro</em&gt; dual-neuron plasticiteit assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticiteit is een inherent kenmerk van het enterische zenuwstelsel en gastro-intestinale (GI) innervatie onder pathologische omstandigheden. Echter, de pathofysiologische rol van neuroplasticiteit in GI-aandoeningen blijft onbekend. Nieuwe experimentele modellen die simulatie en modulatie van GI neuroplasticiteit toe kunnen verbeterde waardering voor de bijdrage van neuroplasticiteit in het bijzonder GI ziekten zoals pancreaskanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) in te schakelen. Hier presenteren we een protocol voor de simulatie van de pancreas neuroplasticiteit onder in vitro omstandigheden met behulp van pasgeboren ratten ganglia (DRG) en myenterische plexus (MP) neuronen. Deze dual-neuron aanpak het mogelijk om niet alleen de monitoring van zowel orgel-intrinsieke en extrinsieke-neuroplasticiteit, maar vertegenwoordigt ook een waardevol instrument om neuronale en gliale morfologie en elektrofysiologie beoordelen. Bovendien maakt de functionele modulatie van de meegeleverde micro-omgeving van de inhoud voor het bestuderen van hun IMPACt op neuroplasticiteit. Eenmaal vastgesteld, de onderhavige neuroplasticiteit test draagt ​​de potentieel van toepassing op de studie van neuroplasticiteit in elk GI orgaan.

Morfologische neuroplasticiteit In de aangegeven leeftijd van pasgeboren ratten (P2-12) en het zaaien dichtheden, MP en DRG neuronen reeds zeer neuronale netwerken op te bouwen na 48 uur (Figuur 2A). Vergelijking van neuriet dichtheid tussen neuronen gekweekt in prostaatkanker, CP, en NP extracten onthult groter neurite dichtheid van DRG neuronen in APC of CP-extracten dan in NP extracten (Figuur 2A) 5. We hebben vooral de voorkeur MP neu...

Neuronale plasticiteit is een steeds meer erkend, maar onvoldoende duidelijk kenmerk van de gastro-intestinale (GI) stelsel. Hier, in het voorbeeld van menselijke pancreas aandoeningen presenteren we een in vitro assay neuroplasticiteit voor de studie van neuronale plasticiteit in het maagdarmkanaal, zowel morfologisch en functioneel niveau.

Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticiteit Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de reactieve veranderingen van perifere neuronen in verschillende pancreasmicro-omgevingen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst weefsellysaten te genereren van een normale menselijke pancreas en van ziek pancreasweefsel. In een tweede stap worden DRG-cellen geïsoleerd uit pasgeboren ratten, die vervolgens worden behandeld met de geïsoleerde weefsellysaten.Vervolgens worden de cellen, na een incubatie van 48 uur, gefixeerd voor een daaropvolgende dubbele immunofluorescentiekleuring. De resultaten tonen de verschillen in het vertakkingspatroon van de neurietdichtheid van neuronen en de glia-dichtheid van neuronen die zijn gekweekt in verschillende weefselextracten. Deze methode kan studies in het veld van de neuro-gastroenterologie faciliteren, zoals onderzoek naar de rol van moleculaire mediatoren bij neuroplastische veranderingen bij verschillende gastro-intestinale aandoeningen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de verschillende neurotrofe eigenschappen van pancreasziekten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals kanker of inflammatoire toestanden van het gehele maagdarmkanaal. We kregen voor het eer

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een drie-dimensionale Monogene assay die het mogelijk maakt de pancreas-achtige voorouders om te differentiëren in de insuline-expressie kolonies is beschreven. Deze methode maakt gebruik van semi-vaste media met methylcellulose, Matrigel en groeifactoren, waarin de afzonderlijke progenitors prolifereren en...

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een...

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

This video demonstrates in vitro neuroplasticity assay to study the morphological changes in dorsal root ganglia and myenteric plexus neurons exposed to healthy and cancerous human pancreatic tissue extracts. This assay allows us to study the neurite outgrowth, branching pattern and neuronal size.

In Vitro Pancreatic Neuroplasticity Assay: Studying Changes in GI Tract Neurons Exposed to Healthy and Cancerous Human Pancreatic Tissue Extracts

This video demonstrates the neural precursor cell neurosphere migration assay—an in vitro assay to study the migratory response of neural precursor cells from the neurosphere—via microscopic analysis.

NPC Neurosphere Assay: An In Vitro Assay to Assess the Migratory Response of Neural Precursor Cells from the Neurosphere

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Hier gebruiken we HD-MEA om ons te verdiepen in de computationele dynamica van grootschalige neuronale ensembles, met name in hippocampussen, olfactoriusbolcircuits en menselijke neuronale netwerken. Het vastleggen van spatiotemporele activiteit, gecombineerd met computationele tools, geeft inzicht in de complexiteit van neuronale ensembles. De methode verbetert het begrip van hersenfuncties en identificeert mogelijk biomarkers en behandelingen voor neurologische aandoeningen.

Vastleggen en analyseren van multimodale grootschalige neuronale ensembledynamiek op CMOS-geïntegreerde micro-elektrode-array met hoge dichtheid

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer een in vitro-assay voor het simuleren van pancreasneuroplasticiteit met DRG- en myenterische plexusneuronen van ratten. Deze methode maakt morfologische en elektrofysiologische analyse van neuronale en gliareacties op weefselextracten mogelijk.

Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:

Meer video's verkennen