RNAi in C. elegans

RNA-interferentie, of RNAi, is een veelgebruikte techniek waarbij dubbelstrengs RNA in een organisme wordt geïntroduceerd, wat leidt tot gerichte gen-silencing. De met een Nobelprijs bekroonde ontdekking van RNA-interferentie stelde onderzoekers in staat om elk C. elegans-gen uit te schakelen om de functie ervan te bepalen. We kunnen RNAi induceren in C. elegans door eerst platen voor te bereiden met E. coli die dsRNA van het doelgen tot expressie brengen, welke door de wormen worden geconsumeerd. Vervolgens worden wormen in het 4e larvale stadium overgeplaatst naar de RNAi-platen en gelaten om eieren te leggen. In het gewenste ontwikkelingsstadium wordt het nageslacht verzameld en gescoord op fenotypes.

RNAi-technologie wordt in C. elegans vaak gebruikt voor het uitvoeren van reverse genetic screens, geautomatiseerde high-throughput screens en als instrument om ontwikkelingsprocessen te bestuderen. In deze video leggen we het concept van RNA-interferentie uit, demonstreren we hoe de RNAi-techniek in C. elegans wordt toegepast en bespreken we hoe wetenschappers RNAi gebruiken als hulpmiddel om wijdverspreide biologische processen beter te begrijpen.

Laten we beginnen met een uitleg over hoe RNA-interferentie werkt. In het geval van C. elegans worden de wormen gevoed met bacteriën die zijn getransformeerd met plasmiden die coderen voor dubbelstrengs RNA dat complementair is aan het gen dat men wil uitschakelen. Zoals eerder vermeld, voedt C. elegans zich met de getransformeerde bacteriën. Via een momenteel onbekend mechanisme dringt dsRNA na inname het weefsel van C. elegans binnen.

Eenmaal in de cel splitst het enzym Dicer het dubbelstrengs RNA in short interfering RNA, of siRNA, met een lengte van 21 tot 23 nucleotiden. Vervolgens associeert het siRNA zich met het RNA-induced silencing complex, ook wel bekend als "RISC", waarna het wordt ontwound. Daarna bindt het siRNA/RISC-complex aan het doel-mRNA via complementaire baseparing. Dit leidt tot de degradatie van het mRNA, waardoor dat gen wordt teruggedrongen.

Voordat de procedure wordt gestart, moeten de bacteriën die het dubbelstrengs RNA van belang tot expressie brengen, worden voorbereid. Bibliotheken van bacteriën die dsRNA-coderende plasmiden voor duizenden genen bevatten, zijn commercieel verkrijgbaar. Anders moet de doelgensequentie met standaard kloontechnieken in een plasmide worden gekloond. Het plasmide bevat een gen voor resistentie tegen het antibioticum ampicilline, dat kan worden gebruikt om bacteriële kolonies te selecteren die het plasmide bevatten.

Gebruik vervolgens standaardtechnieken om het plasmide dat uw dsRNA van belang codeert, te transformeren in de (DE3)-stam van E. coli-bacteriën die het dubbelstrengs RNA zullen tot expressie brengen. Transformeer de bacteriën daarnaast met een leeg plasmide als controle. Belangrijk is dat de E. coli-stam die in deze experimenten wordt gebruikt, RNA-polymerase III mist, dat anders het dubbelstrengs RNA zou afbreken. Deze bacterie bevat ook een IPTG-induceerbaar gen voor T7 DNA-polymerase, dat het dsRNA in het plasmide transcribeert. Tot slot zijn de bacteriën (DE3) zowel tetracycline- als carbenicillineresistent om de expressie van RNA-polymerase III te handhaven en ongewenste bacteriële groei te voorkomen.

Uitplaat de getransformeerde HT115(DE3)-bacteriën op LB-agarplaten die 12,5 μg/ml tetracycline en 25 μg/ml carbenicilline bevatten. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C; de volgende ochtend zullen er bacteriële kolonies op de platen aanwezig zijn. Selecteer vervolgens een enkele bacteriële kolonie en voeg deze toe aan 1 ml LB-bouillon met 100 μg/ml ampicilline om bacteriën te selecteren die het plasmide bevatten. Incubeer gedurende de nacht bij 37 °C onder agitatie. Voeg na de nachtelijke incubatie 5 ml LB-bouillon met 100 μg/ml ampicilline toe aan de cultuur en incubeer nog eens 4-6 uur bij 37 °C.

Zodra de bacteriën gereed zijn, moeten de RNAi-wormplaatjes worden voorbereid voor voeding. RNAi-wormplaatjes bevatten: agar, water, carbenicilline, Worm medium mix en IPTG om de T7 DNA-polymerase in de bacteriën te induceren die het dsRNA in het plasmide transcribeert. Voeg 0,5 ml bacteriecultuur toe aan de RNAi-wormplaatjes en incubeer deze overnacht bij 37 °C om een bacterieel gazon te creëren.

Voordat de wormen aan de RNAi-plaatjes worden toegevoegd, is het belangrijk om het ontwikkelingsstadium van de worm te synchroniseren, zodat eventuele waargenomen verschillen in het fenotype geen artefact zijn van het ontwikkelingsstadium. Om de ontwikkelingsstadia te synchroniseren, moet eerst een platina draadpick worden vlamgesteriliseerd.

Gebruik de wormpick om L4-wormen aan elk RNAi-plaatje toe te voegen en incubeer deze overnacht bij 20 °C, zodat ze kunnen uitgroeien tot jonge, eierleggende volwassenen. Draag vervolgens de jonge volwassenen over naar een nieuw RNAi-plaatje en incubeer deze 6-8 uur bij 20 °C, gedurende welke periode de eieren worden gelegd. Zodra alle volwassenen zijn verwijderd, zijn deze eieren ontwikkelingsbiologisch gesynchroniseerd. Laat de wormen tot slot groeien op de RNAi-plaatjes totdat ze het ontwikkelingsstadium hebben bereikt dat relevant is voor de analyse.

Om de wormen te visualiseren, moet een preparaat worden gemaakt met een 4% agarpad. Plak eerst 2 glazen objectglazen af met labeltape om spacers te creëren die zorgen voor een uniforme dikte van het agarpad. Plaats een schoon objectglas tussen de twee spacers en pipetteer ongeveer 150 μl van de gesmolten 4% agar op het glas. Dek de gesmolten agar snel af met een extra objectglas loodrecht op de spacers. Scheid de glazen voorzichtig; het agarpad zal aan een van de glazen kleven.

Voeg vervolgens 10 μl van een anestheticum, zoals natriumazide, toe aan het agarpad om de dieren te immobiliseren. Breng met een platinanaald wormen over naar het agarpad met het anestheticum en plaats een dekglas. Observeer de wormen tot slot onder een microscoop. Vergelijk wormen die een RNAi-genknockdown hebben ondergaan met de controles en noteer verschillen in grootte, ontwikkelingsstadium, morfologie, lokalisatiepatronen van fluorescentie-gelabelde eiwitten en andere potentiële fenotypes.

Een van de meest waardevolle toepassingen van RNA-interferentie is de mogelijkheid om eenvoudig reverse genetische screens uit te voeren. Een reverse genetische screen is een benadering om genfuncties te ontdekken door een bekende verzameling genen uit te schakelen (knockdown) en het fenotypische resultaat te beoordelen. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld gebruikmaken van een bibliotheek van bacteriën die dsRNA tot expressie brengen voor bijna alle genen in het C. elegans-genoom. Deze bacteriën worden gekweekt op multi-wellplaten en aan de wormen gevoed. Vervolgens kunnen de fenotypische effecten van de RNAi-knockdown van vele genen worden beoordeeld, wat inzicht geeft in de normale in vivo genfuncties.

Geautomatiseerde genetische screens zijn een type reverse genetische screen met een extreem hoge doorvoersnelheid (high throughput). Bij geautomatiseerde genetische screens kan het gehele C. elegans-genoom zeer eenvoudig worden uitgeschakeld door robotische behandeling van duizenden bacteriële klonen en het gebruik van gespecialiseerde instrumenten voor kwantitatieve analyse.

Wormen die een transgene fluorescerende reporter tot expressie brengen voor het antimicrobiële peptidegen nlp 29, worden bijvoorbeeld onderworpen aan RNAi-knockdown van duizenden genen via bacteriële voeding. Tegelijkertijd worden de wormen blootgesteld aan schimmelsporen. Vervolgens kan de antimicrobiële peptiderespons op de schimmel worden beoordeeld.

De ontwikkeling van C. elegans wordt frequent bestudeerd met behulp van RNAi. Wetenschappers kunnen RNA-interferentie gebruiken om elk gen (of elke verzameling genen) van belang uit te schakelen en exact te beoordelen hoe dat gen processen tijdens de ontwikkeling en/of de timing van de ontwikkeling beïnvloedt. RNAi-knockdown kan bijvoorbeeld genen onthullen die de ontwikkeling vertragen wanneer ze worden uitgeschakeld, of genen die betrokken zijn bij de orgaanontwikkeling.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over RNA-interferentie in C. elegans bekeken. We hebben besproken hoe RNA-interferentie werkt en hoe RNA-interferentie kan worden toegepast in C. elegans via bacteriële voeding. RNA-interferentie is een waardevol instrument voor reverse genetische screens, inclusief geautomatiseerde high-throughput screens, en is daarnaast een nuttig instrument voor het bestuderen van ontwikkeling. Bedankt voor het kijken!