Name: Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Ontdek nieuwe intracellulaire pathogenen met amoeben-cocultuur en amoeben-verrijking. Deze innovatieve microbiologische methode isoleert strikt intracellulaire bacteriën en virussen uit milieu- of klinische monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Pr. Bernard La Scola naar nuttige technische adviezen en interessante discussie over amoebal coculture en amoebal verrijking. We danken ook Dr Vincent Thomas voor zijn hulp bij de uitvoering van de techniek in ons laboratorium.

1. Amoebal Coculture 1.1 Voorbereiding van het monster <ol><li> Milieumonster <ol><li> Watermonsters Filtreer het watermonster (500 ml tot 1 L) door een 0,22 urn poriegrootte membraan. Dan schud het membraan in Page&#39;s amoebe zoutoplossing medium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSÜ4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4, en 136 mg KH 2 PO 4 in 1 liter gedestilleerd water). </li><li> Vaste monsters Resuspendeer vaste monsters zoals grond of zand monsters en semi-vaste stoffen zoals geactiveerde slib in gedestilleerd water of PBS en te filteren door een 0,22 urn poriegrootte membraan. Dan schud het membraan in PAS. </li><li> Monsters sterk verontreinigd met endogene amoeben en protozoa Sediment eerst de monsters door de lage snelheid centrifugeren (180 xg) for 10 min of te filteren door middel van een 5 um poriegrootte membraan. Verdere verwerking van de supernatant (respectievelijk filtraat), zoals in 1.1.1. Opmerking: Andere ontsmetting kan worden gebruikt om verder te ontsmetten milieumonsters: Verwarm het monster bij 50 ° C gedurende 30 minuten of behandelen met zure of basische oplossingen 14. </li></ol></li><li> Klinische steekproef Proces klinische monsters afhankelijk van hun fysisch-chemische eigenschappen. Filter of centrifuge vloeistoffen grote onzuiverheden te verwijderen. Resuspendeer vaste monsters. Weefsels gebruiken, maal ze, bijvoorbeeld door een dounce homogeneiser of glazen kralen, en lyseren van de cellen om de intracellulaire bacteriën vrij. </li></ol> 1.2 Amoeben voorbereiding <ol><li> Bouillon voorbereiding Bereid de volgende media: een rijk medium dat pepton, gistextract en glucose (PYG, 100 g proteosepepton, 10 g gistextract, 4,9 g MgSO4 • 7H 2O, 5 g natriumcitraat • 2H 2 O, 0,1 g Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g KH 2PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g glucose en 0,295 g CaCl2 in 5 L gedestilleerd water) en een niet-voedende medium zoals PAS voor Acanthamoeba soorten. </li><li> Amoebal cultuur <ol><li> Cultiveren amoeben (bij voorkeur Acanthamoebacastellanii ATCC 30010 of A. Polyphaga Linc-Ap1) bij 25 ° C in celkweek kolven met 30 ml PYG medium. </li><li> Oogst de amoeben door krachtig schudden van de kolf en centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Was de pellet tweemaal met PAS medium. Tel de cellen in een Kova glijbaan en het volume aan te passen aan een suspensie van 5 x 10 5 cellen per ml te verkrijgen. </li><li> Breng de amoebal schorsing in microplates. Gebruik 1 ml per putje voor 12 - en 24-well platen, 500 ul van 48-well platen en 300 pi van 96-well platen. Incubeer de microplaat gedurende minstens 2 uur bij 25 ° C. Dit maakt sedimentatie en bevestiging van de amoeben onderaan elk putje. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol><li> Monster inenting <ol><li> Inoculeer de plaat 2.3.3 met seriële verdunningen van het monster van 1.1 of 1.2, meestal met 10-voudige verdunningsreeks, beginnend met 100 ul onverdund monster. </li><li> Centrifugeer de microplaat bij 1800 xg gedurende 10 min naar het sediment op de amoebal gazon de micro-organismen die aanwezig kunnen zijn in het monster. Dit verhoogt contact en fagocytose van micro-organismen door amoeben. </li><li> Incubeer de platen gedurende 45 min bij 25 ° C en was driemaal met PAS door vervanging van het medium met vers PAS. Voeg 1 ml per putje van PAS met of zonder toevoeging van antibiotica (streptomycine, penicilline, gentamicine en / of vancomycine), afhankelijk van de bacterial soorten die worden gezocht. </li><li> Incubeer de microplaat bij 32 ° C in een bevochtigde atmosfeer encystment van amoeben voorkomen. Observeer elk putje dagelijks met een 20X doelstelling om de aanwezigheid van bacteriën binnenvallen en lyseren amoeben detecteren. </li><li> Bij lysis Voer een subcultuur verse amoeben door inoculeren van 100 ul hulpkweken een monolaag van ongeveer 10 5 amoeben / cm 2. Om specifiek te isoleren een bepaalde bacteriesoort, te enten ook specifieke agar media ontworpen voor deze bacteriën (dwz BCYE agar voor Legionella spp.). </li><li> Bij afwezigheid van lysis, neem 100 ul hulpkweken 6:56 dagen na de eerste inoculatie en beënt een nieuwe amoebal cultuur van 900 pl in een 24-wells plaat. Als snelle lysis van amoeben waargenomen zonder proliferatie van bacteriën, kan een virus aanwezig zijn. In dit geval, filtreer de supernatant bij 0,22 micrometer en met de suspensie gefiltreerd verse amoeben infecteren. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 Bacteriële isolatie en karakterisering <ol><li> Bacteriële kleuring Voer cocultures direct op glas dekglaasjes in 24-putjes. Verwijder het medium en vlekken of immunofluorescentie voeren. <ol><li> Gemodificeerde Romanowsky kleuring <ol><li> Laat het dekglaasje droog. Dompel het dekglaasje vijf keer in het fixeermiddel oplossing (2 mg / L snel groen in methanol). </li><li> Dompel de dekglaasje vijf keer in de kleuring oplossing I (1,22 g / L Eosine G in fosfaatbuffer pH 6,6) </li><li> Tot slot, dompel de dekglaasje 5 keer in de kleuring oplossing II (1,1 g / L thiazine in fosfaatbuffer pH 6,6). </li><li> Spoel het monster met gedestilleerd water. Even laten drogen en te observeren met behulp van microscopie. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen <ol><li> Laat het dekglaasje droog. Bedek het monster met Ziehl fuchsine. Verhit de kleurstof met een vlam tot dampen verschijnen. </li><li> Koel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minutenen spoelen met gedistilleerd water. Bedek het monster met 3% zoutzuur oplossing in isopropanol gedurende 2 min en spoelen met gedestilleerd water. </li><li> Dekking voor 30 sec met methyleenblauw en spoelen met gedistilleerd water. Even laten drogen en te observeren door microscopie 22. </li></ol></li><li> Gimenez kleuring <ol><li> Bereid een basisch fuchsine voorraadoplossing door het mengen van 100 ml 10% basisch fuchsine (10 g basisch fuchsine in 100 ml 95% ethanol), 250 ml 4% waterige fenol en 650 ml gedestilleerd water. Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur voor gebruik. </li><li> Laat het dekglaasje drogen en door het door de vlam te repareren. Bedek het monster met vers gefiltreerd basisch fuchsine (4 ml basisch fuchsine voorraadoplossing in 10 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,45) gedurende 2 minuten. </li><li> Spoel het monster met water en incubeer in malachietgroen (0,8% in gedestilleerd water) gedurende 10 sec. Weer afspoelen met water en herhaal malachietgroen kleuring. Weer afspoelen met water. Laat het dekglaasje droog, mount het, en observeren door microscopie 23. </li></ol></li><li> Immunofluorescentie <ol><li> Bevestig het dekglaasje door incubatie in methanol gedurende 5 minuten of 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten. </li><li> Was driemaal met PBS en incubeer gedurende 2 uur in blokkeeroplossing (5% BSA, 0,1% saponine in PBS) bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer het dekglaasje gedurende 1 uur in blokkerende oplossing die antilichamen opgewekt tegen het micro-organisme plaats. </li><li> Was opnieuw drie keer in PBS en incubeer gedurende 1 uur met een secundair antilichaam tegen het primaire antilichaam en aan een fluorofoor. Spoel driemaal met PBS, monteer de dekglaasje en observeren met behulp van fluorescentie microscopie. </li></ol></li></ol></li><li> DNA detectie door PCR Extraheer DNA 100-200 ui amoebal coculture. Detecteren micro-organismen met universele primers gericht op de 16S rRNA-gen of specifieke primers voor soorten van belang, zoals mycobacteriën 24, Legionella 25 of leden van de Chlamydiales 26. </li></ol> 2. Amoebal Verrijking 2.1. Voorbereiding van het monster Resuspendeer vaste en semi-vaste monsters in PAS door vortexen. Centrifugeer de suspensie bij lage snelheid (180 x g) gedurende 10 minuten. Dit maakt verrijking van amoeben in de pellet. Het supernatant kan worden gebruikt voor amoebal coculture en de pellet gedurende amoebal verrijking 21. 2.2. Mediumbereiding <ol><li> Voeg 1,5 g agar 100 ml autoclaaf PAS en het medium 15 minuten bij 121 ° C. Giet de warme in petrischalen en laat stollen op kamertemperatuur. </li><li> Groei Escherichia coli (ATCC 25922) in LB of thioglycolaat bouillon overnacht bij 37 ° C. Was de bacteriën tweemaal met PBS en resuspendeer ze in PAS medium. Verdunnen 10x in PAS en verspreiden 2-3 ml van deze verdunning op een PAS agar plaat en laat drogen. </li></ol> Voeg een druppel monster (of een stukje filter) aan een zijde van de plaat en het laten stromen via petrischaal op een lijn in het midden van de schaal te vormen. 2.4. Amoebal groei en amoebal subcultuur <ol><li> Let op de petrischaal dagelijks. Als een amoebal migratie voorzijde wordt gedetecteerd, snijd een klein stukje van agar aan de migratie voor en te enten een frisse NNA petrischaal bedekt met een grasveld van E. coli. </li><li> Herhaal de reïnoculatie meermaals afhankelijk van de zuiverheid van het monster, om een ​​zuivere cultuur van een bepaalde amoebal stam hebben. </li></ol> 2.5. Amoeben en bacteriën karakterisering <ol><li> Schraap de cellen en resuspendeer ze in PAS. </li><li> Extraheer DNA en bepalen de identiteit van amoeben en / of bacteriële endosymbionten door PCR en sequencing (16S rRNA versterking voor bacteriën, resp. 18S rRNA voor amoeben en sequencing, bijvoorbeeld). </li> &lt;li&gt; Gebruik deze geschraapt cellen in PAS frisse amoeben te enten en het uitvoeren van een amoebal coculture om bacteriën mogelijk aanwezig zijn in het monster te detecteren. </li></ol>

<ol><li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+description+of+an+epidemic+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li>
<li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li>
<li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li>
<li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li>
<li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+between+protists+and+phages%3A+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li>
<li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li>
<li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms%3A+risks+for+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li>
<li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li>
<li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li>
<li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidatus+Odyssella+thessalonicensis%27+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criblamydia+sequanensis%2C+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li>
<li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li>
<li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li>
<li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li>
<li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+Vero+cells%2C+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria%3A+Waddlia+chondrophila%2C+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li>
<li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li>
<li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li>
<li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsenberg%2C+HD+%22Clinical+microbiology+procedures+handbook%22">Clinical microbiology procedures handbook</a>. , (1992).</li>
<li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li>
<li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li>
<li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li>
<li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li>
<li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hygiene+Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+drancourtii+sp.+nov.%2C+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li>
<li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li>
<li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrella+lausannensis%2C+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+virus+in+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033(2003).</li>
<li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li>
<li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lausannevirus%2C+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li>
<li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Internal+Med%22%5BJournal%5D)">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li>
<li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parachlamydia+acanthamoebae%2C+an+emerging+agent+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li>
<li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li>
<li>Lienard, J. G. Ch. 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLienard%2C+JG+%22Environmental+microbiology%2C+current+technology+and+water+applications%22">Environmental microbiology, current technology and water applications</a>. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li>
<li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks%2C+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn efficiënte methoden die de isolatie van veel nieuwe bacteriële en amoebal soorten toegestaan. Resultaten verkregen met deze methoden bevestigen de alomtegenwoordige aanwezigheid van zowel amoeben en-amoebe weerstand bacteriën in het milieu, en het meest interessant in de mens veroorzaakte water netwerken die worden geacht te zijn gecontroleerd door chemische behandelingen, zoals chloreren en ozonisatie. Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn essentiële instrumenten om t...

Vóór de komst van de moleculaire diagnostiek, werden micro-organismen in het milieu niches of in klinische monsters vaak gedetecteerd door het cultiveren van hen op verschillende selectieve media, vooral op agar in petrischalen. Het fenotype van de bacteriële kolonies en hun metabolische activiteit toegestaan ​​dan bacteriële classificatie op soortniveau. Bouillon kan ook worden gebruikt om de gevoeligheid van detectie te vergroten. Echter, beide technieken niet het herstel van de bacteriën die langzaam of niet groeien op alle op deze media toe te staan. Dit is de reden waarom moleculaire benaderingen zo wijd tegenwoordig gebruikt. Niettemin detectie van DNA geeft geen aanwijzing op de levensvatbaarheid van de bacteriën. Bovendien, in tegenstelling tot cultuur moleculaire benaderingen niet tot een stam die verder kan worden gekarakteriseerd. Studeren ziekteverwekkers die slecht groeien op vaste media of die moeten cellen om te groeien is ingewikkeld. De meeste van deze &#39;moeilijk te kweken&#39; bacteriën fastidious intracellulair bacteriën, vaak ontdekt en gekarakteriseerd volgende grote uitbraken zoals het geval was voor Legionella pneumophila was. Deze bacterie werd gekenmerkt na een uitbraak die is opgetreden tijdens een American Legion conventie. Maar liefst 182 mensen werden besmet en 29 overleden als gevolg van een ernstige longontsteking 1,2. Later werd aangetoond dat amoeben waren de natuurlijke gastheren van deze bacterie en dat hun aanwezigheid in het hotel airconditioning systeem en waternetwerken was aan de oorsprong van de uitbraak van de ziekte de zogenaamde veteranenziekte 3. Amoeben aanwezig wereldwijd en werden geïsoleerd uit grond, lucht, water en het neusslijmvlies van menselijke vrijwilligers (beoordeeld in 4). Deze &quot;free-living&quot; amoeben zijn over het algemeen verdelen autonoom in het milieu, maar kan af en toe binnenvallen tolerante systemen 5. Amoeben voeden zich met verschillende micro-organismen door middel van fagocytose en de daaropvolgende lysosomale vertering door hydrolases 6. Veel facultatieve of obligate intracellulaire bacteriën kunnen digestie weerstaan ​​en daardoor infecteren en verdelen amoeben bijvoorbeeld Legionella, Chlamydia verwante bacteriën of mycobacteriën (beoordeeld 7 en 8). Amoeben waarschijnlijk een belangrijke potentiële reservoir vormen voor intracellulaire bacteriën die nog niet zijn ontdekt. Dit leidde onze groep te implementeren in Lausanne twee belangrijkste technieken, genaamd amoebal coculture en amoebal verrijking, waardoor verschillende groepen een aantal nieuwe obligaat intracellulaire micro-organismen te isoleren van verschillende milieu-monsters 9-15. Aangezien amoeben zijn professionele fagocyten grazen op bacteriën, kan een bacterie in staat om fagocytose te weerstaan ​​en te groeien binnen deze protisten ook koloniseren menselijke fagocyten en pathogeen ten opzichte van mensen. Dit werd gedeeltelijk aangetoond voor enkele Chlamydia-verwante bacteriën, zoals Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan groeien, niet alleen in amoeben als in verscheidene celtypes zoals zoogdiercellen epitheelcellen, macrofagen, en vis cellijnen 16-18. De amoebal coculture wordt ook relevant voor het detecteren van intracellulaire bacteriën in klinische monsters 19,20, inclusief ontlasting die zwaar verontreinigd met verschillende bacteriesoorten 21. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen van amoebal coculture en amoebal verrijking, waaronder (a) behandeling van milieu of klinische monsters, (b) de groei van amoeben op axenic media en een bacteriedek van Escherichia coli en (c) de selectie en karakterisering van intracellulaire bacteriën.

<table><tbody><tr><td>Glucose monohydraat</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu;m poriegrootte membraan</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>proteose peptonen</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>gistextract</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurkolven</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova-schuif</td><td>Hycor, Indianapolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>celcultuur microplates</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik kleuringskit</td><td>Siemens Healthcare diagn., München, Duitsland</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsine</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>basis fuchsine</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td>Corrosief en mutageen</td></tr><tr><td>malachietgroenoxalaat</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door amoebal coculture en amoebal verrijking benaderingen

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellulaire pathogenen zoals Legionella, mycobacteriën en Chlamydia-achtige organismen moeilijk te isoleren omdat ze groeien vaak slecht of helemaal niet op selectieve media die gewoonlijk worden gebruikt om bacteriën te kweken. Om deze reden zijn veel van deze pathogenen zijn pas onlangs ontdekt of volgende belangrijke uitbraken. Deze pathogenen zijn vaak geassocieerd met amoeben, die als gastheer-cel en kan de overleving en groei van de bacteriën. We zijn van plan hier een demonstratie van twee technieken die isolatie en karakterisering van intracellulaire pathogenen aanwezig in klinische of milieu monsters laten leveren: de amoebal co-cultuur en de amoebal verrijking. Amoebal coculture maakt terugwinning van intracellulaire bacteriën door het enten van het te onderzoeken monster op een amoebal grasveld dat besmet kan en de intracellulaire bacteriën in het monster gelyseerd. Amoebal verrijking laat herstel van amoeben aanwezig zijn in een klinische of milieu-monster. Thwordt kan leiden tot de ontdekking van nieuwe amoebal soorten, maar ook van nieuwe intracellulaire bacterie die specifiek groeien in deze amoeben. Samen vormen deze twee technieken helpen om nieuwe intracellulaire bacteriën kunnen groeien in amoeben ontdekken. Vanwege hun vermogen om amoeben infecteren en tegen fagocytose, kunnen deze intracellulaire bacteriën ook ontsnappen fagocytose door macrofagen en dus pathogeen hogere eukaryoten.

Met behulp amoebal coculture en amoebal verrijking, werden een hele reeks milieu-en / of pathogene bacteriën ontdekt (tabel 1). Amoebal coculture werd gebruikt door onze groep en anderen om milieu-monsters, waterzuiveringsinstallaties en water distributie systemen te analyseren. Een breed scala aan micro-organismen kunnen worden geïsoleerd met deze techniek. De meest voorkomende bacteriën geïsoleerd door amoebal coculture zijn lid van de Mycobacterium genus die kunn...

Amoebal coculture is een celcultuur systeem met aanhangend amoeben om selectief te groeien intracellulaire pathogenen kunnen fagocytcellen zoals amoeben en macrofagen weerstaan. Het vormt dus een belangrijk instrument om nieuwe infectieuze agentia te ontdekken. Amoebal verrijking laat ontdekking van nieuwe amoebal soorten en hun specifieke intracellulaire bacteriën.

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het isoleren van nieuwe potentiële intracellulaire pathogenen die aanwezig zijn in milieu- of klinische monsters. Dit wordt bereikt door het monster van belang te inoculeren in een cultuur van AME om bacteriën te selecteren die in staat zijn om amoeben binnen te dringen en zich daarin te vermenigvuldigen. Vervolgens worden de amoeben die lyseren, of waarin een duidelijke intracellulaire groei wordt waargenomen, verder geanalyseerd om het micro-organisme op soortniveau te identificeren.Als er vervolgens geen bacteriële groei wordt verkregen met de amoebe-cocultuurmethode, wordt amoebe-verrijking uitgevoerd om endogene amoeben te detecteren die specifieke intracellulaire bacteriën kunnen bevatten. De verkregen resultaten zijn de isolatie van nieuwe bacteriële soorten en nieuwe virussen met deze innovatieve methode, die verder kunnen worden gekarakteriseerd met benaderingen zoals microscopie en genoomsequencing. De belangrijkste voordelen van deze technieken ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals axene culturen of zoogdiercelculturen, zijn dat ze kunnen worden toegepast voor de isolatie van strikt intracellulaire bacteriën en

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Microbiële eukaryoten zijn zowel een bron van fotosynthetisch afgeleide koolstof en top roofzuchtige soort in permanent met ijs bedekte Antarctische meren. Dit rapport beschrijft een verrijking cultuur benadering van het metabool veelzijdige microbiële eukaryoten isoleren van de Antarctische meer, Lake Bonney, en beoordeelt anorganische koolstof fixatie mogelijkheden met behulp van een radio-isotoop test voor ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RuBisCO) activiteit.

Oprichting van Microbiële Eukaryote Enrichment Culturen van een chemisch Stratified Antarctic Lake en Beoordeling van Carbon Fixatie Potentiële

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Hier presenteren we twee protocollen om te studeren fagocytensysteem -Mycobacterium abscessus interacties: de screening van een transposon mutant bibliotheek voor bacteriële intracellulaire deficiëntie en de gehaltebepaling van bacteriële intracellulaire transcriptome van RNA sequencing. Beide benaderingen inzicht geven in de genomische voordelen en aanpassingen van de transcriptomic verbetering van intracellulaire bacteriën fitness.

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de virulentie van de planktonische of oppervlak-ingeschrevenen bacteriën met behulp van D. discoideum (amoeba) als een host. Virulentie wordt gemeten over een periode van 1 h en host doden is gekwantificeerd aan de hand van de fluorescentie microscopie en beeld-analyse. We laten zien dat dit protocol met behulp van de bacterie P. aeruginosa.

Een snelle beeld-gebaseerde bacteriële virulentie Assay met behulp van Amoeba

Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

Ontdek nieuwe intracellulaire pathogenen met amoeben-cocultuur en amoeben-verrijking. Deze innovatieve microbiologische methode isoleert strikt intracellulaire bacteriën en virussen uit milieu- of klinische monsters.

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

Meer video's verkennen