Een Proboscis Extension Response Protocol voor het onderzoeken van Behavioral Plasticiteit in Insecten: Toepassing op Basic, Biomedische en Landbouwkundig Onderzoek

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe gedragsconditionering van een eenvoudige reflexmatige reactie op voedsel bij honingbijen kan worden geïmplementeerd. Dit wordt bereikt door eerst honingbijen te vangen, ze vast te zetten in tuigjes, ze een kleine hoeveelheid suikeroplossing te voeren en ze vervolgens te laten wennen aan de beperking. Vervolgens worden er bijen geselecteerd voor conditionering die voldoende motivatie tonen wanneer hun antennes worden aangeraakt met sucrose.

Tijdens de conditionering wordt de presentatie van de geur gekoppeld aan een sucrosebeloning om de geconditioneerde respons op te wekken. Vervolgens wordt in niet-versterkte trials de aanwezigheid of afwezigheid van de respons, de latentietijd van de respons en de duur van de respons gemeten. De laatste stap bestaat uit de data-analyse en de grafische presentatie van de conditionerings- en testtrials.

Deze techniek is met succes toegepast in studies naar de biologie en gezondheid van de honingbij; leergedrag is bijzonder gevoelig voor verstorende behandelingen zoals pesticiden, waardoor het mogelijk is om de impact van dit soort behandelingen op het gedrag van honingbijen op sublethale niveaus te beoordelen. Een visuele demonstratie van deze methode helpt bij het begrijpen van de timing van de stimulus die nodig is voor effectieve conditionering en de veelvoorkomende fouten die de effectiviteit verminderen. Iemand die nieuw is met deze methode zal moeite hebben met de aandacht voor detail die vereist is voor zowel het protocol als de omgevingsfactoren.

Begin met het verzamelen van werksters bij de ingang van de kolonie, terwijl ze pauzeren voordat ze vertrekken of wanneer ze terugkeren van het foerageren. Vang slechts één bij per flacon. Houd de opening van de flacon horizontaal of naar beneden gericht tijdens het vastdraaien van de dop om ontsnapping te voorkomen.

Nadat de bijen zijn verzameld, keert u terug naar het laboratorium en plaatst u telkens enkele vials in een ijs-watermengsel. Zodra een bij immobiel is, haalt u de vial onmiddellijk uit het ijs om overblootstelling te voorkomen en plaatst u de bij in een fixatieharnas. Fixeer de bij zodanig dat de dorsale thorax naar het uitgespaarde gedeelte van de houder is gericht en de kop net boven de bovenzijde uitsteekt.

Druk de bij voorzichtig aan zodat de monddelen over de rand van de houder steken. Schuif een strip ducttape tussen de kop en het borststuk aan de dorsale zijde en bevestig het vrije uiteinde stevig aan de zijkant van de houder. Zorg ervoor dat de tape van het tuigje glad en strak gespannen is.

Er mogen geen merkbare openingen zijn tussen de voorkant van de bijhouder en de tape. Als er openingen zijn, kan de bij mogelijk zijn per bois niet correct uitstrekken of kan hij ontsnappen. Geef de bijen ongeveer 30 minuten de tijd om te herstellen van het vastzetten voordat u begint met voeren.

Voed vervolgens, op een plek ver verwijderd van het trainingsgebied, elke bij ongeveer drie tot vier µL 0,5 M sucrose tijdens het interval tussen het voeren en de conditionering. Plaats de bijen in een rustig gedeelte van het laboratorium in een plastic container met natte papieren handdoeken. Tijdens deze periode, enkele minuten voordat de conditionering begint, wordt de motivatie van de bijen om te voeren gestimuleerd door hun antennes aan te raken met een kleine druppel 0,5 M sucroseoplossing.

Sta niet toe dat ze tijdens deze test voeden. Als ze reageren door hun psis uit te strekken, zijn ze waarschijnlijk voldoende gemotiveerd om te leren en kunnen ze voor het protocol worden gebruikt. Plaats, wanneer u klaar bent, de glazen geurspuit in een houder van boetseerklei en stel deze zo af dat de opening aan het brede uiteinde direct op de bijen is gericht en 10 E. Het uiteinde van de spuit moet zich één tot twee centimeter van de bij bevinden; plaats de koppeling die de cartridge met de Airstream-slangen en het kleppensysteem verbindt stevig over het smalle uiteinde van de spuit.

Plaats aan het begin van elke proef de vastgezetten bij op de pen in de conditioneringsarena, waarbij de antennes direct naar de geurcartridge zijn gericht. Laat de bij 15 tot 25 seconden rusten in de arena voordat de geurstimulus begint, zodat deze kan wennen aan de nieuwe omgeving. Druk op de startknop om het timingsmechanisme voor de geurafgifte te activeren.

Monitor de reactie van de bij op de geur na het begin van de stimulus en vóór de presentatie van de ongeconditioneerde stimulus. Laat de bij na elke trial nog 15 tot 25 seconden rusten in het conditioneringsgebied om de initiële geheugenvorming mogelijk te maken. Het te vroeg verplaatsen van de bij na de trial zal de effectiviteit van elke conditionerings-trial aanzienlijk verminderen.

Houd de naaldpunt twee tot drie centimeter van de bij vandaan terwijl de geur wordt gepresenteerd om de sucrose toe te dienen. Gebruik de rand van de trainingsarena om te voorkomen dat de spuit schudt, aangezien deze beweging de bij kan afleiden. Tijdens de presentatie van de geurstimulus zal er een voedingssignaal klinken.

Zodra het voersignaal klinkt, raak je de antennes lichtjes aan totdat de bij haar proboscis uitstrekt, en voer de bij vervolgens. De timing tussen de presentatie van de geur en de presentatie van de sucrose is kritisch. Idealiter moeten deze twee stimuli elkaar kort overlappen.

Als er meer dan enkele seconden verstrijken tussen de presentatie van de geur en de presentatie van de sucrose, zal de prestatie bij de conditionering afnemen. Gebruik na de conditionering niet-versterkte testproeven om vast te stellen hoe goed de bijen de geconditioneerde associatie onthouden. Plaats eerst een videocamera op een statief boven het trainingsgebied en focus de camera op de voorkant van de kop van de bij, zodat de antennes en de proboscis scherp in beeld zijn.

Zorg ervoor dat een klein LED-lampje, dat de presentatie van de geurstimulus aangeeft, zich in een gebied achter de bij bevindt waar het zichtbaar is op de video, maar niet voor de bij. Dit maakt het mogelijk om tijdens de analyse het tijdstip van het begin en het einde van de geur blootstelling vast te stellen. Gebruik voor de meest consistente resultaten vers bereide geurcartridges voor de tests zodra alles is opgezet.

Begin de test door de geur aan te bieden zoals eerder beschreven. Start de opname 20 seconden voordat de geur wordt aangeboden en neem nog ten minste 20 seconden daarna door. Gebruik na de test videobewerkingssoftware om de respons van elke bij op de stimulusconditie te scoren.

Gebruik een binair scoresysteem om de extensierespons van de psis te beoordelen door de responsen als positief of negatief te scoren. Score de respons van de B als positief. Wanneer de B de psis uitstrekt voorbij de lijn die wordt gevormd door de uiteinden van de geopende mandibels te verbinden, score dan alleen een positieve respons wanneer de B zijn prob bois uitstrekt na het begin van de geur, maar vóór het einde ervan. Score de respons van de B als negatief wanneer er tijdens de trial geen extensie van de prob bois plaatsvindt, of als de prob bois wordt uitgestrekt na het einde van de geurstof. Andere parameters kunnen worden verzameld, zoals de latentie tot extensie en het aantal en de totale duur van de extensieresponsen op de conditie.

De stimulus werd in opeenvolgende conditioneringstests verhoogd. Reacties op nieuwe testgeuren, die verschilden van de stimulus in koolstofketenlengte en/of de positie van de koolstof-koolstofbinding, waren proportioneel verminderd aan de mate van verschil tussen de conditioneringsstimulus en de nieuwe testgeur. Deze gegevens illustreren de variabiliteit en de succesvolle conditionering tussen nieuwe onderzoekers.

De reacties op octaal verschilden afhankelijk van de groep die de test uitvoerde. Tijdens de testproeven riep de geur die als geconditioneerde stimulus werd gebruikt de sterkste reactie op. Wanneer octaal als geconditioneerde stimulus werd gebruikt, was de reactie tijdens de test sterker in vergelijking met methylcycloon, een nieuwe geur.

Op dezelfde manier produceerde methylcycloon sterkere reacties wanneer het als geconditioneerde stimulus werd gebruikt. Wanneer achterwaartse koppeling werd toegepast, werd de geconditioneerde respons gereduceerd tot bijna het niveau van de nieuwe geur, wat het belang van een precieze timing voor een succesvolle conditionering illustreert. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de neurale basis van leren en geheugen te verkennen in insecten als modelorganismen, zoals de honingbij.

Vergeet niet dat werken met insecten, en in het bijzonder met honingbijen, gevaarlijk kan zijn. Zorg ervoor dat u passende beschermende kleding draagt bij het werken met deze dieren.