Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van

Het algemene doel van deze procedure is het ontleden en voorbereiden van oph-testikels voor microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de paren testikels uit het abdomen van mannelijke vliegen te ontleden. De tweede stap is om de testikels op het juiste ontwikkelingsniveau open te scheuren en de testikels te pletten om de aanwezige cellen vrij te maken.

Vervolgens worden de geplette testikels gefixeerd en daarna geïncubeerd in primaire en secundaire antilichamen. De laatste stap is het monteren van het weefsel op een objectglas voor beeldvorming. Tot slot wordt fasecontrast- of immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om cellen in verschillende stadia van spermatogenese op defecten en morfologie te controleren, en om de subcellulaire lokalisaties van diverse eiwitten te observeren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van kritieke rollen van eiwitten tijdens het verloop van de spermatogenese. Een visuele demonstratie van de dissectie van de testikels van RAs is essentieel, omdat iemand die onbekend is met deze procedure in eerste instantie moeite kan hebben met het lokaliseren van de testikels in het abdomen van de vlieg. Daarnaast is het eenvoudiger om de meest succesvolle manier om het weefsel plat te drukken te demonstreren dan om dit in woorden te beschrijven.

Om met de dissectie te beginnen, worden de vliegen in een fles of buisje geneaseerd met een stroom koolstofdioxide. Breng de geneaseerde vliegen vervolgens over naar een vliegenpad. Sorteer de vliegen onder een dissectiemicroscoop met een klein penseel om ongeveer zes tot acht oph-mannetjes van het gewenste genotype te verzamelen.

Verwijder vervolgens met een pincet de vleugels van elke vlieg. Dit voorkomt dat de vliegen in de vloeistof blijven drijven. Voeg tijdens de dissectie 500 microliters fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS in één druppel toe aan een met silicone gecoate dissectieschaal op een zwarte achtergrond.

Richt de pincet vervolgens naar het voorste uiteinde van een van de ongevleugelde vliegen. Pak de vlieg bij het thorax vast en dompel deze onder in de PBS-druppel. Identificeer de donkerbruine structuur aan het achterste uiteinde van de ventrale abdomen en gebruik een tweede pincet om de externe genitaliën naar achteren te grijpen en te trekken totdat deze loskomen van de abdomen.

In de meeste gevallen worden de testikels, zaadblaasjes en accessorische klieren samen met de externe genitaliën uit het abdomen verwijderd. Indien dit niet het geval is, dient er een pincet in het abdomen te worden ingebracht om de testikels voorzichtig vrij te maken. Scheid de testikels van de accessorische klieren en de externe genitaliën met behulp van twee pincetten.

Onderscheid wild-type testes van het omliggende witte weefsel aan hun gele kleur. Om het monster voor live imaging voor te bereiden, gebruik een pincet om voorzichtig twee tot drie paren testes in een druppel van 4 tot 5 µL PBS op een vierkant glazen dekglas te plaatsen. Scheur vervolgens.

Open elke testis met een pincet op een geschikte positie om de aanwezigheid van de gewenste kiemceltypen in de preparatie te maximaliseren. De inhoud van de testes zal vanuit het gescheurde gebied op het objectglas stromen. Scheur tijdens de squashing-stap, om spermatogonia en spermatocyten te verrijken, de testes open nabij de apicale tip voor verdere verrijking.

Scheur voor spermatocyten en spermatiden de teelballen open op een positie die iets basaal ligt ten opzichte van niveau één om de concentratie van rijpere kiemcellen te verhogen. Scheur de teelballen open dichter bij het begin van de kromming. De volgende stap is om de teelballen plat te drukken door voorzichtig een microscoopglaasje over het dekglas te plaatsen.

Oefen geen druk handmatig uit en voorkom het insluiten van luchtbellen. Gebruik het monster binnen 15 minuten na bereiding om levende cellen waar te nemen. Gebruik bij fasecontrastmicroscopie een schoonmaakdoekje om voorzichtig overtollige vloeistof van onder het dekglas weg te zuigen, zodat het preparaat kan afvlakken tot de kiemcellen duidelijk in focus zijn.

Bevries de voorbereide preparaten met geplette testikels snel door ze met een metalen pincet in vloeibare stikstof te dompelen totdat het vloeistof ophoudt met bubbelen. Verwijder onmiddellijk het dekglas met een scheermesje. Plaats de preparaten vervolgens met de metalen pincet in een vooraf gekoeld glazen objectglasrek gevuld met ijskoud 95%ethanol en bewaar het monster 10 minuten bij -20 °C.

Breng de geëquilibreerde objectglazen over naar een glazen objectglashouder gevuld met 4% formaldehyde in PBS plus 0,1% Triton X 100 of PBST en bewaar deze zeven minuten bij kamertemperatuur. Breng de objectglazen vervolgens over naar een houder gevuld met PBS. Was de objectglazen vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur door de oplossing in de houder weg te gooien en te vervangen door verse PBS-oplossing.

Herhaal de wasbeurt één keer. Gooi de PBS weg en dompel de objectglaasjes 30 minuten lang in PBST bij kamertemperatuur om de celmembranen te permeabiliseren. Was de objectglaasjes vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur. Trek met een hydrofobe barrierstift een cirkel rond het geplet weefsel op het objectglas om de antilichaamoplossingen in te perken en om het weefsel tijdens de gehele immunokleuring vochtig te houden.

Voeg vervolgens 30 tot 40 µL primaire antilichamen, verdund in PBST, toe aan het weefsel binnen de cirkel. Na de incubatie met het primaire antilichaam wordt de slide gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C geïncubeerd in een vochtige, donkere kamer. Was de slides drie keer gedurende vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 30 tot 40 µL van een fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund in PBS, toe aan het weefsel en incubeer dit gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de coupes daarna drie keer gedurende vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 30 tot 40 µL van de DAPI-oplossing toe aan het weefsel binnen de cirkel.

Plaats voorzichtig een glazen dekglas over het weefsel, waarbij extra zorg wordt besteed om te voorkomen dat er luchtbellen worden ingesloten. Als er luchtbellen verschijnen, verschuif het dekglas dan voorzichtig zonder het monster te beschadigen, totdat de bellen aan de zijkanten van het glas ontsnappen. Blot het overtollige vloeistof aan de randen van het objectglas weg met een reinigingsdoekje.

Verzegel vervolgens het dekglas met nagellak en bekijk de immuun-gekleurde cellen met een fluorescentiemicroscoop binnen drie tot vier uur. Deze illustratie toont de locatie van verschillende rijpingsstadia van cellen in drosophila-testikels. Niveau één bevat jongere cellen die zich in de vroege stadia van de spermatogenese bevinden en niveau drie bevat rijpere zaadcellen.

Niveau twee bevat een gemengde populatie van mitotische en post-mitotische kiemcellen. Een bijbehorend fasecontrastbeeld toont het vrijkomen van spermatogonia en vroege en late primaire spermatocyten wanneer de testis op niveau één wordt opengebroken. De gele pijl wijst daarnaast naar een fusie van twee of meer onderling verbonden cellen als gevolg van onvolledige cytokinese.

Een artefact van de hier getoonde squash-procedure is een bijbehorend fasecontrastbeeld dat de vrijgave laat zien van late primaire spermatocyten en post-miotische cellen, waaronder ronde spermatiden, verlengende spermatiden en mature zaadcellen wanneer de testes op niveau twee werd gescheurd. Fasecontrastbeeldvorming van gesquashte testes kan ook worden gebruikt om defecten in de overvloedige ronde spermatiden gemakkelijk te identificeren. Wildtype spermatiden met één fase-lichte nucleus worden hier getoond, gehecht aan een fase-donker enkel mitochondriaal aggregaat van ongeveer gelijke grootte.

In tegenstelling hiermee bevatten spermatiden uit Aun-testikels meerdere kleine kernen en één groot mitochondriaal aggregaat als gevolg van mislukte cytokinese en fouten bij de chromosoomsegregatie. De hier getoonde grijswaardenbeelden zijn afkomstig van een preparaat van geplette testikels, gekleurd met reagentia die microtubuli, DNA en centrosomen in kleur identificeren. De gecombineerde beelden tonen een delende spermatocyt, een groot veld met ronde spermatiden en een bundel rijpe zaadcellen. Zodra de preparatie van monsters voor fasecontrastmicroscopie onder de knie is, kan dit in 20 tot 30 minuten worden uitgevoerd.

De voorbereiding van monsters voor immunofluorescentiemicroscopie kan in zes uur worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd. Naast de verwerking van oph-testikels voor microscopie, kunnen gedissekeerde testikels alternatief worden gebruikt voor de biochemische analyse van eiwitten.