Name: Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van Drosophila Testes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer cytologische analyse van spermatogenese in Drosophila testes met dissectie, fixatie en immunofluorescentie. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van cellulaire structuren en eiwitlokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Michael Anderson bedanken voor het vaststellen van de Lee lab deze geaccepteerde methoden voor het bestuderen van spermatogenese met deskundig advies van Karen Hales. H. Oda en Y. Akiyama-Oda royaal de γ-tubuline-GFP vliegen stock. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 subsidie ​​aan LAL (GM074044).

1. Testikels Dissection <ol><li> Verdoven vliegen in een fles of flacon met een stroom van CO 2 en over te dragen aan een vlieg pad. </li><li> Sorteer vliegt onder een dissectie microscoop met een kleine penseel, en laat een passend aantal (afhankelijk van het experiment) van Drosophila mannetjes van de gewenste genotypen. Jonge mannen (0-2 dagen oud) zijn ideaal voor de behandeling van cellen in de vroegere stadia van de spermatogenese (bijv. spermatogonia, spermatocyten en vroege post-meiotische spermatiden), terwijl iets oudere mannen (2-5 dagen oud) zijn ideaal voor de behandeling van cellen in de laatste fase van de spermatogenese (met name volwassen sperma). </li><li> Gebruik een tang om de vleugels van elkaar vliegen te verwijderen (om te voorkomen dat de vliegen van zweven in vloeistof tijdens dissectie). </li><li> Voeg -500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2PO 4, PBS) in een druppel op een gesiliconiseerd dissectie schoteleen zwarte achtergrond. Andere waterige oplossingen zijn met succes gebruikt voor de testes dissectie 3. </li><li> Punt tang naar de voorste van de vlieg, pakt u het door de thorax, en dompel het in de PBS druppel. Tijdens het bekijken door de microscoop ontleden, gebruik een tang om achteren grijpen en trek de externe genitaliën (donkerbruin structuur bij het achterste uiteinde van de ventrale abdomen) totdat deze loskomt uit de buik. In de meeste gevallen zal de testes, zaadblaasjes en accessoire klier uit de buik, samen met de uitwendige geslachtsorganen worden verwijderd, zo niet, plaatst u een enkel paar tang in de buik en plagen uit de testes. </li><li> Aparte testes van accessoire klier en uitwendige geslachtsorganen gebruik van twee paar tang in de PBS daling (figuur 2). Wild-type testes zijn gemakkelijk te onderscheiden van naburige witte weefsels door hun gele kleur. Ga onmiddellijk naar stap 2. </li><li> Om testes isoleren uit pharate mannen (i.. E ingesloten in het popstadium geval), moet een extra stap eerst worden uitgevoerd, dat omvat het verwijderen van de vlieg van het popstadium, deze stap is eerder elders 31 beschreven. Ga verder met dissectie als voor de volwassen testes beginnen bij stap 1.2. </li><li> Om testes isoleren van larvale mannetjes, het uitvoeren van een wijziging van een protocol voor het isoleren van Drosophila larven eierstokken 32. In het kort kunnen mannetje larven worden onderscheiden van vrouwelijke larven door de aanwezigheid van een paar grote, duidelijke, ovaal structuren (larven testes) ingebed in het onderste derde van het vet lichaam. Om larvale testes isoleren gedeeltelijk villen opent de mannelijke larve de testes en het omliggende vet lichaam isoleren van de buik beschreven voor het isoleren van larvale eierstokken. Onmiddellijk over tot stap 2 van de hierin beschreven protocol, de testes kan later worden verwijderd uit het vet lichaam vlak voor bevestiging (stap 2.3 of 3,14) zoals beschreven voor de eierstokken 32. </li></ol><ol><li> Gebruik een pincet om voorzichtig te plaatsen 2-3 paar testikels in een daling van 4-5 ml PBS op een vierkante glazen dekglas. Merk op dat de verhouding van de testes nummer PBS volume moet mogelijk worden aangepast: te veel vloeistof wordt voorkomen dat cellen niet meer goed verspreidt wanneer geplet, terwijl er te weinig vloeistof zal veroorzaken cellen te barsten wanneer geplet. Optioneel: Gebruik gesiliconiseerde dekglaasjes om de naleving van het weefsel te minimaliseren slip in stap 3.2 dekken. </li><li> Gebruik een pincet open elke testis scheuren op een geschikte positie om de aanwezigheid van de gewenste kiemlijn celtypes in het preparaat maximaliseren (Opmerking: de inhoud van de testis zal meestal uitgang uit de verscheurde gebied op de dia tijdens de kneuzingen stap.) te verrijken voor spermatogonia en spermatocyten, scheur open de testis naast haar apicale tip (niveau 1, Figuur 2B). Te verrijken voor spermatocyten en spermatiden, scheur open de testis op een posnu bovendien iets basaal naar niveau 1 (niveau 2, Figuur 2B). Te verrijken voor rijpere germlinecellen, openscheuren de testis dichter bij waar de kromming begint (niveau 3, Figuur 2B). </li><li> Plaats voorzichtig een glazen objectglaasje over de dekglas aan de testikels te pletten, geen druk handmatig toepassen als het gewicht van het deksel slip alleen voldoende is om een ​​goed geplet monster te verkrijgen. Probeer te voorkomen dat luchtbellen. Optioneel: Gebruik poly-L-lysine beklede objectglaasjes om hechting van weefsel bevorderen schuiven in stap 3.2. </li><li> Gebruik voorbereiding onmiddellijk (idealiter binnen 15 minuten na de bereiding) om levende cellen te observeren door fase-contrast microscopie, voor transgene vliegen met expressie van fluorescent gelabelde eiwitten in de testes, kunnen levende cellen met behulp van fluorescentie microscopie onderzocht worden in deze stap. Als alternatief gaan met fixatie en antilichaamkleuring (Protocol nr. 3). </li><li> Zachtjes lont overtollige vloeistof uit onder het dekglaasje met behulp van een schoonmaak wipe tot afvlakking van de bereiding toe, totdat de kiemcellen zijn duidelijk in beeld. </li></ol> 3. Formaldehyde Fixatie en antilichaamkleuring <ol><li> Snap bevriezen elke dia met geplet testes (van Protocol nr. 2) met behulp van een paar metalen tang om het even onder te dompelen in vloeibare stikstof (tot vloeibare stikstof stopt borrelen). </li><li> Verwijder het deksel slip onmiddellijk met een scheermesje. </li><li> Gebruik metalen tang om dia&#39;s over te dragen aan een voorgekoeld glasplaatje rek gevuld met ijskoude 95% ethanol (spectrofotometrische rang,-methanol gratis). Bewaar bij -20 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Gebruik metalen tang om dia dragen aan een glasplaatje rek gevuld met 4% formaldehyde in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Bewaren bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten. </li><li> Gebruik metalen tang om dia&#39;s over te dragen aan een glasplaatje rek gevuld met PBS. Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. 1x herhalen. Voer alle wasbeurten door afdanking oplossing in het glaasje rack ( <em&gt; Dwz. door het gieten van het uit) en vervangen door verse oplossing. </li><li> Gooi de PBS en dompel glaasjes in PBS-T gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur celmembranen doorlaatbaar. </li><li> Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Herhaal 2x. </li><li> Blokkeringsstap (optioneel): Dompel dia&#39;s in PBS plus 1% BSA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Gebruik een hydrofobe barrière pen om een ​​cirkel op de dia rond geplette weefsel (goed zichtbaar op het oog) om het antilichaam oplossingen (toegevoegd in stappen 3.9 en 3.11) beperken trekken. Het weefsel moet vochtig gehouden worden ten alle tijden tijdens het uitvoeren immunostaining. </li><li> Voeg 30-40 ml primair antilichaam (verdund in PBS-T, 1:400 tot 1:50, afhankelijk antilichaam) om weefsel binnen de cirkel. Als het blokkeren werd uitgevoerd, verdunnen primaire antilichaam in PBS-T plus 1% BSA. Anti-gamma-tubuline antilichaam (voor kleuring van centrosomes in figuur 4) werd verdund 1:100. Incubeer in een vochtige, donkere kamer (bijv.. Gesloten plastic doosmet vochtige papieren handdoeken) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 3x. Als blokkeren werd uitgevoerd, twee keer wassen in PBS-T en eenmaal in PBS (5 min bij kamertemperatuur elk). </li><li> Voeg 30-40 ml fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (1:400 verdund in PBS) aan het weefsel en incubeer in het donker gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Herhaal 2x. </li><li> Voeg 30-40 ml DAPI oplossing (0,2 mg / ml in PBS) om het weefsel binnen de cirkel. </li><li> Plaats voorzichtig een dekglaasje over het weefsel, de zorg om te voorkomen dat luchtbellen. Als er luchtbellen moeten verschijnen, voorzichtig bewegen het dekglas zonder het vernietigen van de squash totdat de bellen ontsnappen uit de zijkanten van het dekglas. </li><li> Gebruik een schoonmaakdoekje te wissen overtollige DAPI van de randen van de glijbaan. </li><li> Dicht de dekglas naar de dia met behulp van duidelijke nagellak. </li><li> Gebruik deze voorbereidingbinnen de komende 3-4 uur om immuun-cellen bekijken door fluorescentie microscopie. Voor langere-termijn opslag van dia&#39;s (tot ten minste enkele weken), gebruik maken van een glycerol gebaseerde harde mount media met DAPI, en op te slaan dia&#39;s bij -20 ˚ C. </li><li> Alternatief fix monsters in methanol in plaats van formaldehyde (afhankelijk van het antigeen). Na het voltooien van het hele protocol tot en met stap 3.2, dompel slides van geplette testes in methanol gedurende 10 minuten bij -20 ° C en ga verder met stap 3.5 verder. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hoewel de testes van wildtype vliegen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door hun gele kleur (in tegenstelling tot de naburige witte weefsels), de testes witte mutantvliegen zijn wit en daardoor kan soms worden verward met de darm. De meeste transgene stammen, die typisch op een witte achtergrond, ook witte testikels omdat de mini-witte gen in P-elementen niet bevordert pigment accumulatie in de testes. Wanneer Drosophila testes niet kan worden onderscheiden door de kl...

Drosophila testes zijn een ideaal model voor de studie van vele biologische processen, waaronder de regulering van stamcellen, meiose en spermaontwikkeling 13-18. De spermatocyten en hun meiotische spindels zijn groot en dus handig voor cytologische analyse en ontspannen celcyclus checkpoints tijdens spermatogenese vergemakkelijken de studie van mutaties in genen van de celcyclus. Verschillende celtypen kunnen in geordende progressie worden genomen over de lengte van de testes en eventuele verstoring van spermatogenese kan leiden tot veranderingen in de algemene regeling. Deze eigenschappen, gecombineerd met Drosophila genetische hulpmiddelen hebben de mutatie-analyse van de spermatogenese 21-23 vergemakkelijkt. De stadia van Drosophila spermatogenese goed zijn afgebakend. Germlinecellen dat synchroon ontwikkelen binnen cysten vooruitgang achtereenvolgens door de stadia van spermatogenese langs de lengte van de testis. Tijdens both de mitotische en meiotische delingen van de mannelijke geslachtscellen, cytokinesis optreedt onvolledig, zodat de dochtercellen blijven verbonden door cytoplasmatische bruggen bekend als grachten (figuur 1). De apicale uiteinde van de testis bevat een bevolking van kiembaan stamcellen die aanleiding geeft tot spermatogonial cellen, die vier mitotische delingen ondergaan met onvolledige cytokinesis tot 16-cel cysten van primaire spermatocyten genereren. Na premeiotic S-fase, primaire spermatocyten voer G2, een langere groeiperiode van ~ 90 uur gedurende welke cellulaire volume toeneemt ~ 25-voudig. Progressie door meiose I en meiose II resulteert in de vorming van 32-cellen cysten secundaire spermatocyten en 64-cellen cysten haploïde spermatiden respectievelijk. De onvolwassen, ronde spermatiden ondergaan uitgebreide cellulaire verbouwing tot rijpe zaadcellen vormen. Post-meiotische cellen, in het bijzonder de bundels van het verlengen en volwassen spermatiden, bezetten een groot deel van het volume van de testis. Thij succesvol transport van functionele zaadcellen aan vrouwelijke vliegen vereist coördinatie tussen de verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem, die is samengesteld uit verschillende afgestemde structuren (de testes, zaadblaasjes, en accessoire klieren) en een enkele ejaculatie kanaal (figuur 2). Zaadcellen worden geproduceerd in de testes en opgeslagen in de zaadblaasjes tot copulatie 24. Het accessoire klieren bevatten secretoire cellen die zaadvocht produceren. Het sperma migreren van de zaadblaasjes gemengd met zaadvloeistof binnen de ejaculatie kanaal, die is aangesloten op de zaadblaasjes en de accessoire klieren. Dit mengsel van sperma en zaadvloeistof uiteindelijk uit de mannelijke gepompt in de vagina van het vrouwelijke vliegen door de ejaculatie lamp bij het ​​achterste uiteinde van de mannelijke buik 25. Eiwitten in het zaadvocht zijn essentieel voor de langdurige opslag van sperma binnen gespecialiseerde organen bekend als spermathecae in de reproductive darmkanaal van Drosophila vrouwen 26. Uitstekende werkwijzen voor de isolatie van Drosophila testes en visualiseren van cellen in verschillende stadia van spermatogenese zijn in de wetenschappelijke literatuur 3-12. We hierin toe te voegen aan dit lichaam van kennis door de presentatie van voorbeelden van deze protocollen met een begeleidende video demonstratie. Het protocol voor bereiding van levende testes monsters voor fase-contrast microscopie is gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 27. Het protocol voor formaldehyde fixatie en immunokleuring van testes is ook gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 28. De hierin beschreven methoden zijn gebruikt in vele studies van Drosophila spermatogenese (bijvoorbeeld de rollen van dynein beoordelen, een min-end gerichte microtubuli motor tijdens Drosophila spermatogenese). In aanvulling op de basis protocollen worden suggesties voorzien varying de dissectie om zo te verrijken voor spermatogonia, spermatocyten of rijpe zaadcellen. Verschillende methoden voor het verwerken van de testes zodat cysten ofwel intact blijven of worden verstoord behoefte beschreven. Een voordeel in het gebruik van Drosophila testes als modelsysteem is dat vergeleken met Drosophila eicellen en embryo&#39;s, antilichamen en kleurstoffen kunnen gemakkelijk cellen binnendringen na de verspreiding van de testes en minder wasstappen vereist, dus kan protocollen relatief uitgevoerd korte tijd.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Tweedelige siliconen elastomeer voor het maken van siliconen gecoate dissectie schotel van Kimax Petri schotel</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Clear nail protector</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagens met DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-gamma-tubuline antilichaam (kloon GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Geit Anti-Muis IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Gebruik volgens de richtlijnen van de fabrikant om dekglasjes te siliconeren</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg/ml in 75% ethanol; bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Glas Coplin kleurvat, schroefdop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Enkel gefroste microscoopglazen</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine gecoate microscoopglazen</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optioneel (om onbehandelde microscoopglazen te vervangen )</td></tr><tr><td>Vierkante dekglas</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Schaafmesjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri schotel</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Model 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objectief</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objectief</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytologische analyse van spermatogenese: live and vaste bereidingen van<em&gt; drosophila</em&gt; testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem dat wijd gebruikt om een verscheidenheid van biologische processen helderen. Zo hebben studies van zowel de vrouwelijke als mannelijke kiemlijnen van Drosophila mate bijgedragen tot de huidige kennis van meiose en stamcel biologie. Uitstekend protocollen zijn in de literatuur voor de isolatie en beeldvorming van Drosophila eierstokken en testes 3-12. Hierin, methoden voor de dissectie en voorbereiding van Drosophila testes voor microscopische analyse worden beschreven met een begeleidende video demonstratie. Een protocol voor het isoleren testes uit de buik van volwassen mannetjes en voorbereiden slides van levend weefsel voor analyse door fase-contrast microscopie en een protocol voor het bevestigen en immunokleuring testes voor analyse door fluorescentiemicroscopie worden gepresenteerd. Deze technieken kunnen in de karakterisering van Drosophila mutanten die d vertonen worden toegepastefects in spermatogenese en in de visualisatie van subcellulaire lokalisatie van eiwitten.

Een voorbeeld van een zorgvuldig ontleed paar Drosophila mannelijke voortplantingsorganen wordt getoond in figuur 2A. Testes verwijderd uit de buik van de volwassen mannelijke vliegen zijn meestal verbonden aan de ejaculatie kanaal (bruine figuur 2A) en een paar accessoire klieren (groen figuur 2A) via een paar zaadblaasjes (blauw, Figuur 2A) . De testes scheiden van de meeste van de bijgaande somatische weefsel, de ejaculatie kanaal en het acc...

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontleden en voorbereiden van oph-testikels voor microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de paren testikels uit het abdomen van mannelijke vliegen te ontleden. De tweede stap is om de testikels op het juiste ontwikkelingsniveau open te scheuren en de testikels te pletten om de aanwezige cellen vrij te maken.Vervolgens worden de geplette testikels gefixeerd en daarna geïncubeerd in primaire en secundaire antilichamen. De laatste stap is het monteren van het weefsel op een objectglas voor beeldvorming. Tot slot wordt fasecontrast- of immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om cellen in verschillende stadia van spermatogenese op defecten en morfologie te controleren, en om de subcellulaire lokalisaties van diverse eiwitten te observeren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van kritieke rollen van eiwitten tijdens het verloop van de spermatogenese. Een visuele demonstratie van de dissectie van de testikels van RAs is essentieel, omdat iemand die onbekend is met deze procedure in eerste instantie moeite kan hebben met het lokaliseren van de testikels in he

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.

Imaging Centrosomes in Fly Testikels

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en cultivatie van intacte testikels en kiembaan-cysten uit Drosophila melanogaster poppen. Deze methode maakt microscopisch waarnemen van spermatogenese ex vivo mogelijk. Verder beschrijven we een farmacologisch assay van het effect van remmers op specifieke stadia van kiembaan-celontwikkeling in de testikels van de pop.

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Leer cytologische analyse van spermatogenese in Drosophila testes met dissectie, fixatie en immunofluorescentie. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van cellulaire structuren en eiwitlokalisatie mogelijk.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van

Meer video's verkennen