Drosophila Larvale IHC
Drosophila melanogaster is een veel bestudeerde modelorganisme vanwege zijn veelzijdigheid en gebruiksgemak.
Immunohistochemische analyses die op larvele preparaten van Drosophila worden uitgevoerd, zijn een onschatbare methode die informatie kan geven over de aanwezigheid, locatie en co-lokalisatie van eiwitten.
Deze video behandelt de essentiële methoden voor de dissectie, fixatie, blocking en montage van larveel weefsel van Drosophila en voorbeelden van hun toepassingen.
Immunohistochemische analyse is een proces waarbij gemodificeerde antilichamen worden gebruikt om specifieke eiwitten in weefsel te targeten, te binden en uiteindelijk te visualiseren.
Immunohistochemische analyse van Drosophila-larven is afhankelijk van een juiste dissectie, die nauwkeurigheid en tijdigheid vereist vanwege de gevoeligheid van het larvele weefsel.
De dissectie wordt meestal gedaan in fosfaatgebufferde zoutoplossing, of kortweg "PBS".
Na extractie worden organen tijdelijk in PBS geplaatst - een zoutoplossing met dezelfde pH als de interne pH van de larve.
Na de dissectie is de volgende stap in Drosophila-larve IHC de fixatie.
Fixatie is een proces waarbij weefsel in een verdunde formaldehyde-oplossing wordt geplaatst, die het weefsel conserveert.
Deze fixeeroplossing voorkomt de enzymatische afbraak van eiwitten in weefsel.
Na de fixatie vinden er verschillende wasstappen plaats gedurende het immunokleuringsproces met behulp van PBS met Triton-X, ook wel PBST genoemd.
Triton-X100 biedt een kleine hoeveelheid detergent dat dient als oppervlaktespanningsbreker en maakt de cel doorlaatbaar, waardoor antilichamen en andere reagentia kunnen binnendringen.
Na fixatie en wassen is het weefsel klaar voor blocking.
De blockingoplossing bevat eiwitten die zich binden aan weefsel en niet-specifieke bindingsplaatsen bezetten waaraan de doelspecifieke antilichamen anders zouden hechten. Blocking helpt om een vals positief eiwitsignaal te voorkomen.
Na het blocking is het weefsel klaar voor kleuring.
Kleuring omvat een zeer specifiek "primair" antilichaam dat zich bindt aan een doeleiwit, een antigeen genoemd.
Een "secundair" antilichaam, geconjugeerd aan een reportermolecuul, bindt zich aan het primaire antilichaam.
Het reportermolecuul zendt een gelokaliseerd signaal uit dat kan worden gevisualiseerd, vaak van fluorescerende aard.
Na elke antilichaamincubatiestap wordt overtollig antilichaam afgewassen om antilichamen die zich niet-specifiek hebben gebonden te verwijderen.
Na het kleuringsproces moet het monster worden gemonteerd.
Om de resultaten van de kleuring te zien, moet het weefsel zorgvuldig op schuifjes worden gemonteerd.
Een dik reagens of montagemedium wordt gebruikt om het weefsel in te sluiten.
Het monster is dan klaar om onder de microscoop te worden bekeken.
Nu we de principes van Drosophila-immunohistochemische analyse hebben doorlopen, zijn we klaar om te zien hoe het wordt gedaan.
In deze video zullen we ons concentreren op de reagentia, gereedschappen en processen die worden gebruikt bij de immunohistochemische analyse van de Drosophila-larvehersenen, beginnend met fixatie.
Het proces dat we volgen, gebruikt de volledige hersenen en staat bekend als volledige montagekleuring.
Hoewel de dissectieprocedure verschilt afhankelijk van het weefseltype dat voor het experiment wordt gebruikt, blijven de belangrijkste stappen van IHC hetzelfde, dus we gaan meteen naar de fixatiestap.
Zodra de dissectie van de larvele hersenen is voltooid, verwijdert u PBS met een pipette.
Voeg fixeermiddel toe en incubeer volgens uw specifieke protocol, voor hersenen 23 minuten.
Na fixatie wassen monsters vier keer in PBST.
Incubeer monsters gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur in blockingoplossing.
Incubeer in primaire antilichaamoplossing overnacht bij 4 °C met de juiste verdunning.
Na de incubatieperiode wassen hersenen vier keer in PBST met een pipettetip bij kamertemperatuur.
Incubeer de monsters overnacht bij 4 °C in het donker met secundair antilichaam om het bleken van de fluoroforen te voorkomen.
Was opnieuw hersenen vier keer in PBST.
Breng de hersenen een uur in evenwicht in montagemedium.
Na het evenwicht brengen brengt u de hersenen over naar een schuifje met een p200 pipette met de tip afgesneden.
Plaats ruimteschuivers rond het monster om te voorkomen dat het wordt verpletterd.
Plaats een dekglasje over de monsters.
Verzegel de randen van de slip met nagellak. Larvale hersenen zijn nu klaar om te worden gevisualiseerd met immunohistochemische analyse
Nu we de immunohistochemische analyse van Drosophila-hersenen hebben behandeld, laten we enkele alternatieve manieren van het toepassen van IHC-procedures doornemen.
Alternatieve dissectie- en fixatietechnieken kunnen worden gebruikt om Drosophila-larven voor beeldvorming voor te bereiden.
In dit experiment willen onderzoekers leren hoe cellen specifieke vormen genereren.
Ze doen dit door de morfologieën van larvele tracheaal terminale cellen te traceren.
De onderzoekers maken gebruik van een mutante vlieglinie die GFP tot expressie brengt.
De GFP-expressie wordt geïnduceerd door blootstelling aan warmte in een waterbad
Larven worden geselecteerd onder een dissectiescoop met fluorescentie.
Vliegen die fluorescentie uitstoten, geven een succesvolle activering van GFP aan.
Deze vliegen worden onderworpen aan een alternatieve vorm van fixatie door warmte; er is geen dissec
Immunohistochemie (IHC) is een techniek die wordt gebruikt om de aanwezigheid en locatie van eiwitten in weefsels te visualiseren. Drosophila larven z…
Drosophila melanogaster is een veel bestudeerde modelorganisme vanwege zijn veelzijdigheid en gebruiksgemak.
Immunohistochemische analyses die op larvele preparaten van Drosophila worden uitgevoerd, zijn een onschatbare methode die informatie kan geven over de aanwezigheid, locatie en co-lokalisatie van eiwitten.
Deze video behandelt de essentiële methoden voor de dissectie, fixatie, blocking en montage van larveel weefsel van Drosophila en voorbeelden van hun toepassingen.
Immunohistochemische analyse is een proces waarbij gemodificeerde antilichamen worden gebruikt om specifieke eiwitten in weefsel te targeten, te binden en uiteindelijk te visualiseren.
Immunohistochemische analyse van Drosophila-larven is afhankelijk van een juiste dissectie, die nauwkeurigheid en tijdigheid vereist vanwege de gevoeligheid van het larvele weefsel.
De dissectie wordt meestal gedaan in fosfaatgebufferde zoutoplossing, of kortweg "PBS".
Na extractie worden organen tijdelijk in PBS geplaatst - een zoutoplossing met dezelfde pH als de interne pH van de larve.
Na de dissectie is de volgende stap in Drosophila-larve IHC de fixatie.
Fixatie is een proces waarbij weefsel in een verdunde formaldehyde-oplossing wordt geplaatst, die het weefsel conserveert.
Deze fixeeroplossing voorkomt de enzymatische afbraak van eiwitten in weefsel.
Na de fixatie vinden er verschillende wasstappen plaats gedurende het immunokleuringsproces met behulp van PBS met Triton-X, ook wel PBST genoemd.
Triton-X100 biedt een kleine hoeveelheid detergent dat dient als oppervlaktespanningsbreker en maakt de cel doorlaatbaar, waardoor antilichamen en andere reagentia kunnen binnendringen.
Na fixatie en wassen is het weefsel klaar voor blocking.
De blockingoplossing bevat eiwitten die zich binden aan weefsel en niet-specifieke bindingsplaatsen bezetten waaraan de doelspecifieke antilichamen anders zouden hechten. Blocking helpt om een vals positief eiwitsignaal te voorkomen.
Na het blocking is het weefsel klaar voor kleuring.
Kleuring omvat een zeer specifiek "primair" antilichaam dat zich bindt aan een doeleiwit, een antigeen genoemd.
Een "secundair" antilichaam, geconjugeerd aan een reportermolecuul, bindt zich aan het primaire antilichaam.
Het reportermolecuul zendt een gelokaliseerd signaal uit dat kan worden gevisualiseerd, vaak van fluorescerende aard.
Na elke antilichaamincubatiestap wordt overtollig antilichaam afgewassen om antilichamen die zich niet-specifiek hebben gebonden te verwijderen.
Na het kleuringsproces moet het monster worden gemonteerd.
Om de resultaten van de kleuring te zien, moet het weefsel zorgvuldig op schuifjes worden gemonteerd.
Een dik reagens of montagemedium wordt gebruikt om het weefsel in te sluiten.
Het monster is dan klaar om onder de microscoop te worden bekeken.
Nu we de principes van Drosophila-immunohistochemische analyse hebben doorlopen, zijn we klaar om te zien hoe het wordt gedaan.
In deze video zullen we ons concentreren op de reagentia, gereedschappen en processen die worden gebruikt bij de immunohistochemische analyse van de Drosophila-larvehersenen, beginnend met fixatie.
Het proces dat we volgen, gebruikt de volledige hersenen en staat bekend als volledige montagekleuring.
Hoewel de dissectieprocedure verschilt afhankelijk van het weefseltype dat voor het experiment wordt gebruikt, blijven de belangrijkste stappen van IHC hetzelfde, dus we gaan meteen naar de fixatiestap.
Zodra de dissectie van de larvele hersenen is voltooid, verwijdert u PBS met een pipette.
Voeg fixeermiddel toe en incubeer volgens uw specifieke protocol, voor hersenen 23 minuten.
Na fixatie wassen monsters vier keer in PBST.
Incubeer monsters gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur in blockingoplossing.
Incubeer in primaire antilichaamoplossing overnacht bij 4 °C met de juiste verdunning.
Na de incubatieperiode wassen hersenen vier keer in PBST met een pipettetip bij kamertemperatuur.
Incubeer de monsters overnacht bij 4 °C in het donker met secundair antilichaam om het bleken van de fluoroforen te voorkomen.
Was opnieuw hersenen vier keer in PBST.
Breng de hersenen een uur in evenwicht in montagemedium.
Na het evenwicht brengen brengt u de hersenen over naar een schuifje met een p200 pipette met de tip afgesneden.
Plaats ruimteschuivers rond het monster om te voorkomen dat het wordt verpletterd.
Plaats een dekglasje over de monsters.
Verzegel de randen van de slip met nagellak. Larvale hersenen zijn nu klaar om te worden gevisualiseerd met immunohistochemische analyse
Nu we de immunohistochemische analyse van Drosophila-hersenen hebben behandeld, laten we enkele alternatieve manieren van het toepassen van IHC-procedures doornemen.
Alternatieve dissectie- en fixatietechnieken kunnen worden gebruikt om Drosophila-larven voor beeldvorming voor te bereiden.
In dit experiment willen onderzoekers leren hoe cellen specifieke vormen genereren.
Ze doen dit door de morfologieën van larvele tracheaal terminale cellen te traceren.
De onderzoekers maken gebruik van een mutante vlieglinie die GFP tot expressie brengt.
De GFP-expressie wordt geïnduceerd door blootstelling aan warmte in een waterbad
Larven worden geselecteerd onder een dissectiescoop met fluorescentie.
Vliegen die fluorescentie uitstoten, geven een succesvolle activering van GFP aan.
Deze vliegen worden onderworpen aan een alternatieve vorm van fixatie door warmte; er is geen dissec
Drosophila melanogaster is een veel bestudeerde modelorganisme vanwege zijn veelzijdigheid en gebruiksgemak.
Immunohistochemische analyses die op larvele preparaten van Drosophila worden uitgevoerd, zijn een onschatbare methode die informatie kan geven over de aanwezigheid, locatie en co-lokalisatie van eiwitten.
Deze video behandelt de essentiële methoden voor de dissectie, fixatie, blocking en montage van larveel weefsel van Drosophila en voorbeelden van hun toepassingen.
Immunohistochemische analyse is een proces waarbij gemodificeerde antilichamen worden gebruikt om specifieke eiwitten in weefsel te targeten, te binden en uiteindelijk te visualiseren.
Immunohistochemische analyse van Drosophila-larven is afhankelijk van een juiste dissectie, die nauwkeurigheid en tijdigheid vereist vanwege de gevoeligheid van het larvele weefsel.
De dissectie wordt meestal gedaan in fosfaatgebufferde zoutoplossing, of kortweg "PBS".
Na extractie worden organen tijdelijk in PBS geplaatst - een zoutoplossing met dezelfde pH als de interne pH van de larve.
Na de dissectie is de volgende stap in Drosophila-larve IHC de fixatie.
Fixatie is een proces waarbij weefsel in een verdunde formaldehyde-oplossing wordt geplaatst, die het weefsel conserveert.
Deze fixeeroplossing voorkomt de enzymatische afbraak van eiwitten in weefsel.
Na de fixatie vinden er verschillende wasstappen plaats gedurende het immunokleuringsproces met behulp van PBS met Triton-X, ook wel PBST genoemd.
Triton-X100 biedt een kleine hoeveelheid detergent dat dient als oppervlaktespanningsbreker en maakt de cel doorlaatbaar, waardoor antilichamen en andere reagentia kunnen binnendringen.
Na fixatie en wassen is het weefsel klaar voor blocking.
De blockingoplossing bevat eiwitten die zich binden aan weefsel en niet-specifieke bindingsplaatsen bezetten waaraan de doelspecifieke antilichamen anders zouden hechten. Blocking helpt om een vals positief eiwitsignaal te voorkomen.
Na het blocking is het weefsel klaar voor kleuring.
Kleuring omvat een zeer specifiek "primair" antilichaam dat zich bindt aan een doeleiwit, een antigeen genoemd.
Een "secundair" antilichaam, geconjugeerd aan een reportermolecuul, bindt zich aan het primaire antilichaam.
Het reportermolecuul zendt een gelokaliseerd signaal uit dat kan worden gevisualiseerd, vaak van fluorescerende aard.
Na elke antilichaamincubatiestap wordt overtollig antilichaam afgewassen om antilichamen die zich niet-specifiek hebben gebonden te verwijderen.
Na het kleuringsproces moet het monster worden gemonteerd.
Om de resultaten van de kleuring te zien, moet het weefsel zorgvuldig op schuifjes worden gemonteerd.
Een dik reagens of montagemedium wordt gebruikt om het weefsel in te sluiten.
Het monster is dan klaar om onder de microscoop te worden bekeken.
Nu we de principes van Drosophila-immunohistochemische analyse hebben doorlopen, zijn we klaar om te zien hoe het wordt gedaan.
In deze video zullen we ons concentreren op de reagentia, gereedschappen en processen die worden gebruikt bij de immunohistochemische analyse van de Drosophila-larvehersenen, beginnend met fixatie.
Het proces dat we volgen, gebruikt de volledige hersenen en staat bekend als volledige montagekleuring.
Hoewel de dissectieprocedure verschilt afhankelijk van het weefseltype dat voor het experiment wordt gebruikt, blijven de belangrijkste stappen van IHC hetzelfde, dus we gaan meteen naar de fixatiestap.
Zodra de dissectie van de larvele hersenen is voltooid, verwijdert u PBS met een pipette.
Voeg fixeermiddel toe en incubeer volgens uw specifieke protocol, voor hersenen 23 minuten.
Na fixatie wassen monsters vier keer in PBST.
Incubeer monsters gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur in blockingoplossing.
Incubeer in primaire antilichaamoplossing overnacht bij 4 °C met de juiste verdunning.
Na de incubatieperiode wassen hersenen vier keer in PBST met een pipettetip bij kamertemperatuur.
Incubeer de monsters overnacht bij 4 °C in het donker met secundair antilichaam om het bleken van de fluoroforen te voorkomen.
Was opnieuw hersenen vier keer in PBST.
Breng de hersenen een uur in evenwicht in montagemedium.
Na het evenwicht brengen brengt u de hersenen over naar een schuifje met een p200 pipette met de tip afgesneden.
Plaats ruimteschuivers rond het monster om te voorkomen dat het wordt verpletterd.
Plaats een dekglasje over de monsters.
Verzegel de randen van de slip met nagellak. Larvale hersenen zijn nu klaar om te worden gevisualiseerd met immunohistochemische analyse
Nu we de immunohistochemische analyse van Drosophila-hersenen hebben behandeld, laten we enkele alternatieve manieren van het toepassen van IHC-procedures doornemen.
Alternatieve dissectie- en fixatietechnieken kunnen worden gebruikt om Drosophila-larven voor beeldvorming voor te bereiden.
In dit experiment willen onderzoekers leren hoe cellen specifieke vormen genereren.
Ze doen dit door de morfologieën van larvele tracheaal terminale cellen te traceren.
De onderzoekers maken gebruik van een mutante vlieglinie die GFP tot expressie brengt.
De GFP-expressie wordt geïnduceerd door blootstelling aan warmte in een waterbad
Larven worden geselecteerd onder een dissectiescoop met fluorescentie.
Vliegen die fluorescentie uitstoten, geven een succesvolle activering van GFP aan.
Deze vliegen worden onderworpen aan een alternatieve vorm van fixatie door warmte; er is geen dissec
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is dissection important in Drosophila larval immunohistochemistry?
Proper dissection is critical because larval tissue is highly sensitive and requires accuracy and timeliness. Dissection is performed in phosphate buffered saline (PBS), a saline solution matching the larva's internal pH, to preserve tissue integrity. Careful dissection ensures organs are extracted without damage, allowing subsequent fixation and staining steps to proceed effectively.
Q2: What role does fixation play in preparing Drosophila larval tissue for immunohistochemistry?
Fixation preserves tissue by placing it in a diluted formaldehyde-based solution that prevents enzymatic breakdown of proteins. This step protects epitopes—the specific binding sites on proteins—ensuring they remain intact for antibody recognition. Proper fixation is essential before permeabilization and staining to maintain tissue structure and protein integrity throughout the immunohistochemistry process.
Q3: How does blocking solution prevent false positive signals in Drosophila larval IHC?
Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites where target-specific antibodies would otherwise adhere incorrectly. By saturating these sites, blocking prevents antibodies from binding to unintended locations, reducing background noise. This step is crucial for ensuring that only the target protein generates a fluorescent signal, improving the accuracy of protein localization results.
Q4: What is the function of Triton-X100 in the immunohistochemistry washing steps?
Triton-X100 is a detergent added to PBS (creating PBST) that acts as a surface tension breaker and permeabilizes cell membranes. This permeabilization allows antibodies and other reagents to penetrate cells and access target proteins inside tissue. The detergent is used throughout multiple washing steps to remove excess unbound antibodies while maintaining tissue permeability.
Q5: How do primary and secondary antibodies work together in Drosophila larval staining?
The primary antibody is highly specific and binds directly to the target protein (antigen). The secondary antibody then binds to the primary antibody and carries a reporter molecule—typically a fluorescent dye—that emits a localized signal. This two-antibody system amplifies the signal and allows visualization of protein location under fluorescence microscopy.
Q6: Why is mounting medium necessary after immunostaining Drosophila larval tissue?
Mounting medium is a thick reagent that encases the tissue on microscope slides, protecting it and preserving fluorescent signals. The medium maintains tissue transparency and prevents sample degradation, allowing clear visualization under the microscope. Proper mounting with spacers and coverslips ensures the tissue remains intact and ready for long-term fluorescence microscopy examination.
Q7: What are some alternative applications of immunohistochemistry in Drosophila research?
IHC is used to study diverse Drosophila tissues and developmental stages. Researchers trace larval tracheal terminal cell morphologies using GFP-expressing mutant lines, examine ovaries to understand stem cell interactions with their cellular environment, and compare development and reproduction across larval, pupal, and adult retinas. These applications demonstrate IHC's versatility in visualizing protein location across different tissues and developmental stages.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:41
Principles of Larval Immunohistochemistry
3:29
Immunohistochemistry Procedure
5:34
Applications
8:03
Summary