Name: Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer de cecale ligatie- en punctiemethode toe te passen bij muizen om sepsis te induceren en autophagie in long-, lever- en nierweefsel te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in therapeutische mogelijkheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, naar AMK Choi. S. Ryter ontvangen salaris steun van de Lovelace Respiratory Research Institute.

Opmerking: de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Brigham en Women&#39;s Hospital / Harvard Medical School Area ingestemd met de volgende procedures. 1. Cecal Ligatie en Puncture Gebruik muizen van dezelfde achtergrond (C57Bl / 6), mannelijke, 8-10 weken oud. Vrouwelijke muizen zijn resistenter dan de mannetjes tegen sepsis geïnduceerde dodelijkheid. Muizen ouder dan 8 weken produceren minder variabele resultaten dan jongere muizen in termen van overleving na CLP. Ongeveer N = 10 muizen per groep worden vergeleken voor overlevingsanalyse. N = 3-5 muizen voldoende voor autophagy assays. <ol><li> Gebruik steriele kleine chirurgische instrumenten (namelijk scalpel, schaar en stompe anatomische pincet), die geschikt is voor knaagdieren operatie zou moeten zijn. </li><li> Bereid anesthesie mengsel: Aan 7,95 ml PBS met 150 ul van xylazine (AnaSed injectie van 100 mg / ml) en 700 gl Ketamine (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / mliter). </li><li> Om aseptische omstandigheden te garanderen tijdens de procedure, draag handschoenen, gezichtsmasker en chirurgische toga. </li><li> Weeg dieren. Verdoven ze door het injecteren intraperitoneaal (ip) de in stap 3 genoemde in een dosering van gl (10x lichaamsgewicht in g) mengsel. Bijvoorbeeld, voor een muis gewicht 22 g toedienen 10x22 = 220 pi van het mengsel verdoving. Dus de uiteindelijke doses xylazine en ketamine zijn 17 en 80 mg / kg lichaamsgewicht, respectievelijk. Zorg ervoor dat anesthesie is voldoende, geen buiging van de ledematen moeten worden geproduceerd na teen knijpen. Opmerking: Gebruik oogzalf op de ogen tot droog te voorkomen, terwijl onder verdoving. </li><li> Plaats de dieren op een schoon werkvlak op hun rug. Staarten en achterpoten zijn gericht op de onderzoeker. Ontsmet de buikhuid het gebruik van alcohol (70% EtOH oplossing). Opmerking: Chirurgische gebied moet volledig worden geschoren, om besmetting van de wond door contact met vermijdenbont. Ook, optimaal, een circulerend warm water kussen moet worden gebruikt om normothermia van verdoofde muizen tijdens de operatie te handhaven. </li><li> Door het gebruik van een scalpel, een kleine longitudinale incisie in de huid parallel en ongeveer 1 cm van links naar middellijn. Nog niet doordringen in de peritoneale holte. Gebruik een klein schaartje om de eerste incisie te verlengen. </li><li> Identificeer buikspieren en ontleden ze toegang krijgen in de peritoneale holte. </li><li> Door het gebruik van stompe anatomische pincet, identificeren de blindedarm en verplaats ze uit de buikholte. Wees voorzichtig mesenteriale bloedvaten (dit kan leiden tot dodelijke bloedingen) niet te beschadigen. </li><li> Ligeren 60% van de blindedarm van een mid-grade sepsis bereiken. Ligeren gelijk aan of meer dan 75% van de blindedarm doorgaans tot hoogwaardige sepsis, dat gelijk aan of minder dan 25% van de blindedarm resultaten bij laaggradig sepsis ligeren. Wees voorzichtig de Bauhin klep (dit kan de intestinale continuïteit te blokkeren) niet afbinden. </li><li> Door een21 G naald, perforeren de blindedarm voor een door-en-door punctie (twee gaten) in de buurt van de ligatie. De richting van de perforatie moet worden van de mesenteriale de anti-mesenteriale zijde van de blindedarm. Wees voorzichtig mesenteriale bloedvaten niet te doorboren. </li><li> Verwijder de naald. Knijp de blindedarm geligeerd om openheid te bevestigen door de twee gaten, slechts een kleine hoeveelheid uitwerpselen worden geëxtrudeerd door hen. </li><li> Verplaats de geligeerde en doorboord blindedarm in de peritoneale holte. Opmerking: Voor sham muizen, sla dan stappen 1,10-1,12. </li><li> Gebruik zijde chirurgische hechtingen 6-0 met cutting naald om buikspieren te sluiten. Gebruik zijde chirurgische hechtingen 6-0 met cutting naald om buikhuid sluiten. </li><li> Injecteer 1 ml voorverwarmde (37 ° C) normale zoutoplossing ip warmte en vocht verloren tijdens de procedure te vervangen. Leg de muizen onder een warmtelamp totdat hun reanimatie. Opmerking: Optimaal, een veiliger warming-apparaat (such als een circulerende warm water pad) kan worden gebruikt in plaats van een warmtelamp. </li><li> Postoperatief injecteren buprenorfine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht sc.) Om pijnstilling te bereiken. Opmerking: Een dier mag niet onbeheerd worden achtergelaten, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Een dier dat een chirurgische behandeling heeft ondergaan mag niet worden teruggestuurd naar het gezelschap van andere dieren, totdat volledig hersteld. </li><li> Plaats de dieren terug in hun kooien met onbeperkte toegang tot voedsel en water. Muizen zullen worden gedood wanneer ze stervende (aangegeven met klinische symptomen zoals mislukte overstap bij aanraking of cyanose). Controleer muizen elke 4 uur om te voorkomen dat ze sterven voorafgaand aan euthanasie. </li></ol> 2. Tissue Harvest en Fixation <ol><li> Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing: Voor 889 ml PBS toe 111 ml van 37% PFA. </li><li> Sacrifice muizen met behulp van CO 2-geïnduceerde narcose of Ketamine / Xylazine sPLOSSING in een hoge dosering. </li><li> Immobiliseer de muizen op een schoon werkvlak. Spray de abdominale en thoracale huid met 70% EtOH oplossing te desinfecteren. </li><li> Gebruik een scalpel en een klein schaartje om de buik-en thoracale huid en de huid die de tracheale gebied te verwijderen. </li><li> Reveal luchtpijp door het verwijderen van de omliggende weefsels (spieren en bindweefsel). </li><li> Plaats een hechting (zonder te snijden naald) rond de luchtpijp. Nog niet vastdraaien. </li><li> Gebruik een kleine perifere veneuze katheter (20 G) naar &#39;intubate&#39; luchtpijp. Wees voorzichtig tijdens het inbrengen van de katheter om tracheale scheuren te voorkomen. Merk op dat de grootste diameter van de trachea net onder de ringkraakbeen. </li><li> Draai de hechtdraad rond de luchtpijp / katheter. Verwijder de naald waardoor de plastic canule van de katheter in de luchtpijp. Naald alleen diende als een gids-draad voor het plaatsen van de plastic canule. </li><li> Nadat de plastic canule bevestigd in de trachea gesneden the buikspieren, opent de buik en onthullen het middenrif. </li><li> Met een naald doorboord membraan pneumothorax (bijvoorbeeld inbrengen van lucht in de pleura-holte) produceren. Longen moeten dan worden ingestort. </li><li> Met behulp van kleine schaar, verwijder het middenrif, snijd langs het borstbeen (sternotomie), verwijder de ribbenkast en onthullen het hart en de longen. </li><li> Door de plastic canule ingebracht in de luchtpijp, bevestig de longen met de formaldehyde-oplossing onder de 30 cm H 2 O druk. </li><li> Verwijder de longen en deze in de met 4% PFA gedurende 24 uur en vervolgens in 70% EtOH-oplossing tot verwerking. </li><li> Identificeren en verwijderen van hart, lever en nieren. Op dezelfde wijze, plaats ze in de 4% PFA gedurende 24 uur en vervolgens in 70% EtOH-oplossing tot verwerking. </li></ol> 3. GFP Muizen en bekijken van GFP Slides <ol><li> Voer CLP en sham operatie aan GFP-LC3 muizen zoals beschreven in stap 1, en postoperatieve procedures zoals beschreven in stap 2 van het protocol. </li><li> Het weefsel (namelijk de longen, hart, lever en nieren) inbedden in paraffine en snijd ze in serie 5 urn. </li><li> Wanneer klaar voor GFP kleuring, incubeer bij 60 ° C gedurende 30-60 min tot paraffine smelt en weefsel weergegeven doorschijnend. </li><li> Deparaffinize met standaard gesorteerde reeks xyleen of xyleensubstituanten, 5 min. xyleen 1, xyleen 2, en xyleen 3 dan 3 min incubatie in gesorteerde reeks EtOH: 100%, 95%, 75%, en dan afspoelen in gedestilleerd water. Opmerking: Na deparaffinisatie vermijden weefsel uitdroging, welk monster achtergrond neemt toe. </li><li> Voer antigenen met citroenzuur buffer (10 mM natriumcitraat zuur, 0,05% Tween 20, pH 6,0), door de magnetron gedurende 10-20 minuten. Wees voorzichtig om buffer periodiek worden vervangen om weefsel uitdroging te voorkomen. </li><li> Laat de oplossing afkoelen gedurende 20 minuten op de bank om antigen herstel te voltooien. </li><li> Was 2-3x met PBS. Verwijder overtollig buffer en transfer glijdt van rek tot horizontale positie in een dia doos of andere vochtige kamer om uitdroging te voorkomen. </li><li> Blokkeer 45-60 min bij kamertemperatuur met 10% normaal serum ezel (ook 5% runderserumalbumine of bij voorkeur serum van het dier waarbij het secundaire antilichaam werd opgewekt) in PBS. </li><li> Incubeer monsters in primaire GFP antilichaam bij 1:100 verdunning in PBS overnacht bij 4 ° C in vochtige kamer. Voorzichtig toepassing stukjes Parafilm dan weefsel met antilichaam homogeen contact met het weefsel te bevorderen en verdamping te voorkomen. Opmerking: resterende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. </li><li> Was 5x met PBS om overtollig primaire antilichaam te verwijderen. Incubeer met secundaire antilichaam 1:500-1:1,000 in PBS gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was 5x met PBS om overmaat secundair antilichaam te verwijderen. Desgewenst tegenkleuring de glijbanen in deze stap. </li><li> Bij gebruik van fluorescerende secundair antilichaam, incubeer 0,1% Sudan Black in 70% EtOH fof 15-20 min autofluorescentie te verminderen. Veeg het overtollige Sudan Black van rond weefsel en wassen 5x met PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Monteer monster met dekglaasje en slaan horizontaal, totdat montage oplossing heeft ingesteld. </li></ol> 4. Alternatief protocol: directe detectie van GFP-LC3 <ol><li> Canule en pomp longen met een ~ 500 ml 50/50 v / v oktober PBS. </li><li> Embed in OCT door een kleine hoeveelheid OCT in de bodem van een cryomold. </li><li> Plaats de ontleed long complex zorgvuldig in de matrijs. </li><li> Langzaam vriezen methylbutaan gekoeld met behulp van droogijs. </li><li> Voeg meer oktober totdat het weefsel volledig bedekt en bevroren solide. Blijf op droog ijs en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Met behulp van een cryomicrotoom, gesneden 5-10 micrometer dikke secties bescherming van de secties tegen licht. Store secties en restmateriaal bij -80 ° C. </li><li> Om dia&#39;s te bereiden voor imaging, verwijderen gedeelte van diepvries en onmiddellijk een druppel PBS toepassing op uitdroging te voorkomen. </li><li> Fix gedurende 30 minuten met 4% PFA. Wassen met PBS. </li><li> Solliciteer DAPI / Hoescht gedurende 10 minuten. Was 3x met PBS. </li><li> Monteer monster met dekglaasje en slaan horizontaal, totdat montage oplossing heeft ingesteld. </li><li> Beeld met behulp van epifluorescentie of confocale microscoop. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. </li></ol> 5. Bereiding van weefsel voor Elektronenmicroscopie <ol><li> Snijd weefsels in ongeveer 1 mm blokjes voor de bevestiging. </li><li> Bevestig het weefsel in 2% formaldehyde, 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natrium cacodylaat buffer, pH 7,4. </li><li> Wassen met 0,1 M natriumcacodylaatbuffer voor 1-2 uur. Opmerking: Vaste weefsel kan worden opgeslagen in 0,1 M natriumcacodylaat bij 4 ° C. </li><li> Plaats fix in 1% osmiumtetroxide in 0,2 M natriumcacodylaatbuffer 1 uur. </li><li> Spoel in 0,2 M natrium cacodylaat buffer gedurende 10 minuten 3x. </li><li> Uitdrogen in 70% EtOH, 20 min. 2x. Uitdrogen in 90% EtOH, 10 min. 2x. Dehydrateer 100% EtOH,20 min 2x. </li><li> Incubeer met propyleenoxide (epoxypropaan) gedurende 10 min 2x. </li><li> Incubeer met propyleenoxide / epoxyharsmengsel (50:50) gedurende 1 uur. De epoxy hars mengsel: 24 g Agar 100 hars 13 g dodecenylsuccinic anhydride, 13 g methylnadic anhydride en 1 ml N-benzyldimethylamine. Meng in een wegwerp beker met behulp van een houten spatel. </li><li> Incubeer met epoxyhars overnachting in afgetopte flesjes (dit kan elke resterende propyleenoxide verdampen). </li><li> Insluiten in geëtiketteerde capsules met vers bereide hars. Polymeriseren bij 60 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Foto weefselsecties met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 of 60 kV op elektronenmicroscoop film. De beelden afdrukken op fotopapier of op te slaan als digitale media. </li><li> Analyseer autophagosome vorming in intacte cellen met kern. Laag krachtvelden (e. G. 2.000-4.000 X) kunnen worden gebruikt om kernhoudende cellen te identificeren. Typisch 6,800-10,000 X beelden worden gebruikt voor eis autophagosome kwantificering. Count autofagosomen per oppervlakte-eenheid 15-30 velden voor passende statistische vertegenwoordiging. Autofagosomen hebben dubbele membraan structuur, waar laat stadium autophogosomes leek gevulde vacuolen. </li></ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+and+treatment+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The pathology and treatment of sepsis.</a> N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).</li>
<li>Anaya, D. A., Nathens, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+severe+sepsis+in+secondary+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Infect%22%5BJournal%5D)">Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis.</a> Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).</li>
<li>Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+A+new+hypothesis+for+pathogenesis+of+the+disease+process%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process.</a> Chest. 112, 235-243 (1997).</li>
<li>Rivers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+goal-directed+therapy+in+the+treatment+of+severe+sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock.</a> N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).</li>
<li>Deitch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+intra-abdominal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Rodent models of intra-abdominal infection.</a> Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).</li>
<li>Raven, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+sepsis+found+shockingly+lacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent models of sepsis found shockingly lacking.</a> Nat. Med. 18, 998 (2012).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoi%2C+AM+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 368, 651-662 (2013).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7, 629-642 (2011).</li>
<li>Chen, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLos One. 3, 3313 (2008).</li>
<li>Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+clinical+tissues+of+lung+and+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases.</a> Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+functions+of+IL-17A+in+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis.</a> FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+3+%28MKK3%29+for+activation+of+p38%CE%B1+and+p38%CE%B4+MAPK+isoforms+by+TGF-%CE%B21+in+murine+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).</li>
<li>Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%7Bbeta%7D1+protects+against+mesangial+cell+apoptosis+via+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy.</a> J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).</li>
<li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94, 331-335 (1983).</li>
<li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).</li>
<li>Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1-mediated+autophagy+protects+against+hepatocyte+cell+death+and+hepatic+injury+from+infection%2Fsepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice.</a> Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).</li>
<li>Lo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lc3+over-expression+improves+survival+and+attenuates+lung+injury+through+increasing+autophagosomal+clearance+in+septic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice.</a> Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren

Het grote voordeel van de CLP is dat het mogelijk onderzoekers sepsis van verschillende ernst onderzoeken (dat wil zeggen van low-tot mid-en high-grade). Ernst van geïnduceerde sepsis wordt beïnvloed door de lengte van blindedarm geligeerd (waarvan de belangrijkste determinant), de grootte van de naald gebruikt doorboren en het aantal openingen 15 uitgevoerd. Daarnaast kan de muizenstam en geslacht van invloed zijn op de ernst van sepsis; verschillende stammen zijn gevoeliger dan anderen en mannetjes...

Sepsis, systemische inflammatoire respons op infectie, is een belangrijke doodsoorzaak bij kritisch zieke patiënten 1. Intra-abdominale infecties, vaak leidt tot polymicrobiële sepsis, goed voor 20% van sepsis, die aanzienlijke mortaliteit tot 60% 2 hebben. Met sepsis geassocieerde sterfte voornamelijk het gevolg is van multi-orgaanfalen met daaropvolgend orgaanfalen 3,4. Aanvullend onderzoek naar de pathogenese van deze ziekte is dringend nodig om de ontwikkeling van nieuwe en effectievere behandelingen bevorderen. De methode cecal ligatie en punctie (CLP) is een veel gebruikte procedure voor het modelleren sepsis in vivo. Zoals de blindedarm is vol bacteriën, de punctie resultaten in polymicrobiële peritonitis, translocatie van bacteriën in het bloed (bacteriëmie), septische shock, multi-orgaanfalen en uiteindelijk de dood 5. Het is algemeen aanvaard dat CLP weerspiegelt de klinischerealiteit nauwkeuriger dan eerdere technieken, zoals injectie van endotoxine of gezuiverde bacteriën in knaagdieren, dus CLP wordt beschouwd als de gouden standaard (maar niet Onbeperkt) 6 voor de experimentele inductie en dus het onderzoek van de pathogenese van sepsis. In deze monografie, beschrijven we protocollen ontworpen om te beoordelen of pathogene mechanismen van sepsis omvatten autofagie. Autofagie, een evolutionair geconserveerd cellulair proces, vergemakkelijkt de omzet van beschadigde eiwitten en organellen zoals mitochondriën en speelt een belangrijke rol in de klaring van intracellulaire pathogenen zoals bacteriën 7,8. Tijdens autofagie, worden cytosolische eiwitten of organellen afgezonderd in dubbele membraan gebonden blaasjes genoemd autofagosomen, die vervolgens worden geleverd aan de lysosomen voor degradatie 9. Een aantal eiwitten geïdentificeerd als zoogdierhomologen van autofagie genen (Atg)oorspronkelijk geïdentificeerd in gist, die het proces van autofagie regelen. De omzetting van microtubuli geassocieerde proteïne-1 lichte keten 3B (LC3B) (homoloog van Atg8) uit LC3B-I (vrije vorm) te LC3B-II (fosfatidylethanolamine-geconjugeerde vorm) vormt een belangrijke stap in autophagosome vorming 9. Autophagic dysfunctie wordt geassocieerd met ouder worden en menselijke ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen 10. Bovendien autofagie beïnvloedt aangeboren en adaptieve immuniteit, zoals antigeen presentatie, lymfocyten ontwikkeling en cytokine secretie door immuuncellen 8. Zo lijkt het redelijk dat autofagie ook een rol zou kunnen spelen in de systemische inflammatoire respons op infectie (ic in sepsis). Tot op heden verschillende methoden zijn beschreven om de rol van autofagie in weefselbeschadiging in vivo te beoordelen. Deze omvatten het gebruik van groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 expressie muizen en kwantificering van autophagosomes in weefsel door elektronenmicroscopie (beide werkwijzen zijn in deze monografie). Aanvullende methoden omvatten de kwantificering van autophagic eiwitexpressie in weefselhomogenaten, en de analyse van autophagic flux (zoals elders beschreven) 11-13. Het doel van dit onderzoek is om de huidige protocollen voor de beoordeling van autofagie in vivo in het kader van experimentele sepsis.

<table><tbody><tr><td>GFP-LC3 Transgenic Mice</td><td>Riken (Japan)</td><td>RBRC00806</td><td>GFP-LC3#53</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry-Schein</td><td>568-0606</td><td>Xylazine HCl Injection Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry-Schein</td><td>995-2949</td><td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A405-20</td><td>Histology Grade</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A407-1</td><td>For Sterilizatiion</td></tr><tr><td>silk surgical sutures 6-0</td><td>Owens &amp; Minor</td><td>2300-0078OG, 017624</td><td></td></tr><tr><td>buprenorphine-HCl</td><td>Henry-Schein</td><td>614-5157</td><td>Buprenex Ampules</td></tr><tr><td>paraformaldehyde (37%) solution</td><td>JT Baker</td><td>S898-09</td><td></td></tr><tr><td>xylenes</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP monoclonal antibody</td><td>Life Technologies</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Sigma</td><td>944403</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR scientific</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203760</td><td></td></tr><tr><td>EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15960</td><td></td></tr><tr><td>propylene oxide</td><td>Sigma</td><td>240397</td><td></td></tr><tr><td>Agar 100 resin</td><td>Agar scientific</td><td> R1045</td><td></td></tr><tr><td>dodecenylsuccinic anhydride</td><td>Sigma</td><td>46346</td><td></td></tr><tr><td>methylnadic anhydride</td><td>Sigma</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>N-benzyldimethylamine</td><td>Sigma</td><td>185582</td><td></td></tr></tbody></table>

cecal ligatie en punctie-geïnduceerde sepsis als een model om autophagy studie bij muizen

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode, die polymicrobiële sepsis veroorzaakt. Hier wordt een protocol voorzien van sepsis van verschillende ernst induceren in muizen met de CLP techniek. Autophagy is een fundamentele weefsel reactie op stress en pathogeen invasie. Twee huidige protocollen om autofagie in vivo te beoordelen in het kader van experimentele sepsis worden hier ook gepresenteerd. (I) Transgene muizen die groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 fusieproteïne onderworpen CLP. Gelokaliseerde verbetering van GFP signaal (puncta), zoals bepaald hetzij door immunohistochemische of confocale assays kunnen worden gebruikt om verbeterde autophagosome vorming detecteren en dus veranderde activatie van autofagie route. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formatie per eenheid weefsel gebied (als een marker van autofagie stimulatie) kan worden gekwantificeerd met behulp van elektronenmicroscopie. De studie van autophagic reacties op sepsis is een kritische compponent van het begrijpen van de mechanismen die weefsels reageren op infectie. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan het begrijpen van de pathogenese van sepsis, die een groot probleem in de intensive care geneeskunde vertegenwoordigt.

Bacteriëmie aanwezig muizen vanaf 6 uur na CLP-geïnduceerde sepsis 14. Klinische symptomen van sepsis (waaronder rillingen, tachypneu en verminderde motorische activiteit) verschijnen circa 12 uur na de procedure. Muizen onderworpen aan CLP beginnen te sterven op ongeveer 18 uur na inductie van peritonitis. Hoe ernstig is de sepsis de meer toegenomen is de dodelijkheid 15. In detail, hoogwaardige sepsis veroorzaakt 100% sterfte binnen 2-3 dagen, terwijl de mid-grade sepsis resultaten in ongeveer 60...

Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode. Voor deze protocollen autofagie in vivo beoordelen in het kader van CLP-geïnduceerde sepsis worden hier gepresenteerd: Een protocol voor het gebruik autofagie (GFP)-LC3 muizen, en een protocol voor autophagosome vorming van elektronenmicroscopie.

Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Het algemene doel van deze procedure is om sepsis op te wekken door ligatie en punctie van het caecum bij muizen, om zo weefselautofagie te bestuderen, een homeostatisch proces dat de omzetting van beschadigde eiwitten en organellen faciliteert. Dit wordt bereikt door eerst het caecum te identificeren en dit uit de peritoneale holte van de geanestheseerde muis te verplaatsen. Zodra het caecum is geïsoleerd, wordt 60% ervan geligeerd en vervolgens geperforeerd om midden-gradige peritonitis op te wekken.Het afgebonden en gepuncteerde serum wordt teruggeplaatst in de peritoneale holte en het dier krijgt de gelegenheid om te herstellen. De laatste stap is het oogsten van long-, lever- en niertweefsels van het septische dier 24 uur later. Tot slot wordt elektronenmicroscopie gebruikt om de vorming van autofagosomen aan te tonen in intacte cellen van de weefsels die uit het septische dier zijn geoogst.We present de cecumligatie en punctie (CLP) als een methode om sepsis op te wekken en autofagie te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van eerdere methoden, zoals de injectie van endotoxine, is de klinische relevantie. CLP leidt tot peritonitis, wat een bek

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De muis model van cecal ligatie en lek als een waardevol instrument voor de studie van de menselijke sepsis.

Cecal Ligatie Puncture Procedure

Sepsis verwijst naar een systemic inflammatory response syndrome als gevolg van een bacteriële infectie, en kan worden gesimuleerd door een chirurgische techniek genoemd cecal ligatie en punctie (CLP). Hier beschrijven we een methode om CLP-geïnduceerde diermodel te gebruiken om geneeskrachtige kruiden te screenen op therapeutische middelen.

Het gebruik van dierlijk model van Sepsis op nieuwe kruidentherapieën Evalueer

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Hier wordt een protocol om na te bootsen de ingang van bacteriële afkomstige verbindingen na de schending van de intestinale barrière gepresenteerd. Een lage dosis subletale lipopolysaccharide werd systemisch geïnjecteerd in muizen, die werden gecontroleerd voor 24u na injectie. De expressie van pro-ontsteking cytokinen werd vastgesteld op verschillende tijdstippen in de milt, lever en dikke darm.

Injecties van Lipopolysaccharide in muizen om na te bootsen ingang van microbiële afkomstige producten na de schending van de intestinale barrière

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft technieken om besmettelijke resultaten te meten aan de onderliggende secundaire ziekenhuisinfecties in de immunosuppressieve voorwaarde, eerst door de oprichting van cecal afbinding/punctie muizen dan uitdagend hen met intranasal infectie Maak een klinisch relevant model van immunosuppressie sepsis.

Ontwerp van Cecal afbinding en punctie en Intranasal infectie Dual model van sepsis-geïnduceerde immunosuppressie

Dit protocol presenteert de operationele details van cecal ligatie en punctie (CLP) in een muismodel van sepsis. CLP is een van de meest gebruikte technieken om een diermodel van sepsis te maken. Daarom is een gestandaardiseerd CLP-protocol vereist voor het verkrijgen van betrouwbare onderzoeksresultaten.

Evaluatie van een betrouwbare biomarker in een cecale ligatie en punctie-geïnduceerd muismodel van sepsis

Dit protocol beschrijft de inductie van Gram-negatieve monobacteriële sepsis in een muismodelsysteem. Het model is nuttig bij het onderzoeken van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis.

Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen

Dit muizenmodel combineert een septische belediging met onbruik van de achterpootspieren om het bedlegerige kenmerk van de typische septische patiënt samen te vatten. Het model vertegenwoordigt een significante afwijking van eerdere modellen om spierdisfunctie bij sepsis te bestuderen en is een reproduceerbare benadering voor het aanpakken van therapeutische strategieën om deze aandoening te behandelen.

Een preklinisch model van door sepsis geïnduceerde myopathie met onbruik bij muizen

Hier presenteren we een protocol voor het opzetten van een immunosuppressiemodel voor muissepsis via intranasale installatie van Klebsiella pneumoniae en valideren we het model aan de hand van verschillende indicatoren.

Vestiging van een door muis sepsis geïnduceerd immunosuppressiemodel door intranasale instillatie van bacteriën

Leer de cecale ligatie- en punctiemethode toe te passen bij muizen om sepsis te induceren en autophagie in long-, lever- en nierweefsel te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in therapeutische mogelijkheden.

Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen

Meer video's verkennen