Name: Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een In Vitro Hechting Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer hoe probiotische Streptococcus salivarius de hechting van Streptococcus pneumoniae aan epitheelcellen remt met een in vitro-hechtingsassay. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van strategieën tegen pneumokokkenkolonisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Murdoch Childrens Research Institute en operationele infrastructuur Support Program de Victoriaanse regering.

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Jacoby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+co-occurrence+of+Streptococcus+pneumoniae+with+other+bacterial+and+viral+pathogens+in+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract.</a> Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).</li>
<li>Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acquisition+and+high+nasopharyngeal+co-colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+three+respiratory+pathogens+amongst+Gambian+new-borns+and+infants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants.</a> BMC Infect. Dis. 11, (2011).</li>
<li>Licciardi, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+against+pneumococcal+disease%3A+critical+interactions+between+probiotics+and+the+airway+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome.</a> PLoS Pathog. 8, (2012).</li>
<li>Popova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+probiotics+in+upper+respiratory+tract+infections+and+their+mechanical+actions+to+antagonize+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens.</a> J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).</li>
<li>Pracht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavA+of+Streptococcus+pneumoniae+modulates+adherence%2C+invasion%2C+and+meningeal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation.</a> Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).</li>
<li>Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+human+bronchial+epithelial+cells+%28BEAS-2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B).</a> Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+pneumoniae+adherence+to+human+epithelial+cells+in+vitro+by+the+probiotic+Lactobacillus+rhamnosus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG.</a> BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).</li>
<li>Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+bacteriocins+and+the+case+for+Streptococcus+salivarius+as+model+oral+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics.</a> Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).</li>
<li>Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+oral+probiotic+Streptococcus+salivarius+K12+in+the+prevention+of+recurrent+pharyngitis+and%2For+tonsillitis+caused+by+Streptococcus+pyogenes+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).</li>
<li>Fiedler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+respiratory+tract+streptococci+against+Streptococcus+pyogenes+biofilm+formation+and+epithelial+cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).</li>
<li>Slotved, H. C., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+pneumococcal+isolates+representing+23+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes.</a> BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).</li>
<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
<li>Smith-Vaughan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nasal+bacterial+load+and+its+association+with+otitis+media%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ear+Nose+Throat+Disord%22%5BJournal%5D)">Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media.</a> BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).</li>
<li>Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+of+bacterial+adhesion+onto+mammalian+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritische deel van deze test is het passende concentraties van S. salivarius en pneumokokken in de paragrafen 3.1.7 en 3.1.12. Concentraties worden geschat middels OD maar de exacte inocula zijn niet bepaald tot platen worden geteld de volgende dag. Om deze reden raden wij u aan groeicurven voor OD en levensvatbare tellingen (CFU / ml) na verloop van tijd voor alle bacteriestammen die in de test van de mid-log fase identificeren en te helpen bij de bepaling van de concentratie door de OD te meten. Bovendien...

Streptococcus pneumoniae (pneumokok het) is een Gram-positieve bacterie die infecties zoals longontsteking, middenoorontsteking en hersenvliesontsteking kan veroorzaken. Het is een belangrijke oorzaak van ziekte bij kinderen in landen met lage inkomens en verantwoordelijk voor naar schatting 800.000 sterfgevallen van kinderen onder de leeftijd van vijf jaar 1. Pneumokokken worden vaak gedragen in de nasofarynx van jonge kinderen. Hoewel dit kolonisatie algemeen beschouwd asymptomatisch het vooraf pneumococcen infectie en dient als reservoir voor de bacteriën in menselijke populaties 2. Pneumokokkenvaccinatie vermindert effectief vervoer van de serotypen die in het vaccin. Er zijn meer dan 90 pneumokokkenserotypen en vaccinatie kan leiden tot serotype vervangen, waardoor de eliminatie van vaccinserotypen wordt gevolgd door een stijging in vervoer en ziekte veroorzaakt door nonvaccine serotypen 3. Ook in sommige hoog-risicogroepen, pneumokokkenkolonisatie komt vaak heel vroeg in het leven, vóór de toediening van de eerste dosis vaccin: 4,5. Onlangs is het gebruik van probiotica voorgesteld als aanvullende strategie pneumokokken kolonisatie 6,7 remmen. In vitro hechting assays werden gebruikt om pneumococcen hechting 8,9 onderzocht. Deze testen zijn aangepast om het effect van de probiotische Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) op pneumokokken hechting 10 onderzoeken. Naast LGG en andere melkzuurbacteriën, Streptococcus salivarius, een gemeenschappelijk ingezetene van de mondholte, is onderzocht als een potentiële probiotische de luchtwegen vanwege de kolonisatie potentieel en het vermogen om pneumokokken en andere respiratoire pathogenen in vitro te remmen 11 - 13. De hier gepresenteerde protocol beschrijft een hechting assay gebruikt om de effecten te onderzoeken van S. salivarius K12 op pneumokokken aanhankelijkheidde humane epitheel cellijn CCL-23. Voor gebruik in de assay, werden pneumococcen isolaten onderzocht op hechting mogelijkheden, zoals groei en hechting eigenschappen hoofdzaak onder isolaten 10,14 variëren. Groeicurven van pneumokokken en S. salivarius uitgevoerd om mid-log fase en schatting concentratie (kolonie vormende eenheden of CFU / ml) bepaald door optische dichtheid (OD figuur 1). Het wordt aanbevolen om de groei onderzocht door kiemgetal en OD voor elk isolaat voor gebruik in de assay. Deze test kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met standaard weefselkweek faciliteiten en apparatuur. In dit protocol, de effecten van de drie doses van S. salivarius toegediend 1 uur voorafgaande aan de toevoeging van pneumokokken op de hechting van S. pneumoniae PMP843, een serotype 19F wagen isolaat afkomstig van een nasofarynxuitstrijk, worden onderzocht. Twee verschillende manieren om aanhangend pneumokokken kwantificeren worden gepresenteerd: plating op bloed agar om af te schrikkenmijn rendabel telt, en DNA-extractie en detectie van de pneumokokken lytA gen door qPCR 15. De basis hechting assay protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende doses of het tijdstip van toediening van probiotica testen en kunnen ook worden gebruikt met andere bacteriële stammen of soorten.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Media (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-well Cell culture plate</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Horse blood agar (HBA) plates</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Schapenbloed agar platen zijn ook acceptabel</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt Broth</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable cuvettes</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>komt in steriele ampullen van 5.000 IE/5m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriele verspreider</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternatief kan een glazen verspreider worden gedoopt in 96% ethanol en vóór elk gebruik vlam gesteriliseerd</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% oplossing</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mini-kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Op maat gemaakt</td><td>5' -> 3' sequentie ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Op maat gemaakt</td><td>5' -> 3' sequentie&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA sonde</td><td>Eurogentec</td><td>Op maat gemaakt</td><td>5' -> 3' sequentie Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternatieve fluoroforen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 Detectieplaat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraclear qPCR cap strips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR Systeem</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*alternatieve bronnen zijn beschikbaar voor de meeste/alle vermelde producten</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

onderzoek naar de effecten van probiotica op pneumococcal kolonisatie met behulp van een<em&gt; in vitro</em&gt; hechting assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Hechting van Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) de epitheliale bekleding van de nasofarynx kan resulteren in kolonisatie en wordt beschouwd als een voorwaarde voor pneumococcen infecties zoals longontsteking en otitis media. In vitro hechting assays kunnen worden gebruikt om de hechting van pneumococcen studie naar cel epitheliale monolagen en mogelijke acties, zoals het gebruik van probiotica onderzoeken tegen pneumokokken kolonisatie remmen. De hier beschreven protocol wordt gebruikt om de effecten van de probiotische Streptococcus salivarius de hechting van pneumococcen de humane epitheel cellijn CCL-23 onderzocht (soms aangeduid als HEp-2 cellen). De test bestaat uit drie stappen: 1) de voorbereiding van epitheliale en bacteriële cellen, 2) toevoeging van bacteriën om celmonolagen epitheliale, en 3) de detectie van aanhangend pneumokokken door kiemgetal (seriële verdunning en plating) of kwantitatieve real-time PCR (qPCR ). Deze technique is betrekkelijk eenvoudig en niet gespecialiseerde apparatuur anders dan een weefselkweek setup nodig. De test kan worden gebruikt om andere probiotische soorten en / of potentiële remmers van pneumokokken kolonisatie testen en kan eenvoudig worden aangepast aan andere wetenschappelijke vragen over pneumokokken hechting en invasie te pakken.

Resultaten van een representatief experiment waarbij pneumococcen (S. pneumoniae PMP843, een koloniseert 19F isolaat) werden toegevoegd aan CCL-23-cellen 1 uur na toevoeging van S. salivarius en pneumococcal hechting werd gekwantificeerd door zowel kiemgetal en lytA qPCR worden getoond in Tabel 2. resultaten waren consistent tussen de twee methoden voor zowel het absolute aantal bacteriën (gepresenteerd als CFU / ml) en de% hechting, genormaliseerd naar het aantal hechtende pn...

In vitro kan hechting assays worden gebruikt om de hechting van Streptococcus pneumoniae onderzoeken naar cel monolagen epitheliale en mogelijke acties zoals het gebruik van probiotica voor het remmen pneumococcal kolonisatie onderzoeken.

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Het algemene doel van deze procedure is om het vermogen van een probiotische streptococcus cell levarius te onderzoeken om de adhesie van pneumokokken aan een epitheliale cellijn te remmen. Dit wordt bereikt door eerst monolagen van CCL 23 epitheelcellen voor te bereiden. In een 24-well plaat worden vervolgens slovar en pneumokokken opeenvolgend aan de monolaag toegevoegd, waarna de cellen worden geïncubeerd.In de laatste stap worden de wells gewassen om de niet-adherente bacteriën te verwijderen. De CCL 23 epitheelcellen worden gelyseerd en de inhoud van de wells wordt geoogst. Uiteindelijk kan de impact van salivarius op de pneumokokkenadherentie worden geëvalueerd door het aantal cel-geassocieerde pneumokokken te kwantificeren.Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van infectieziekten, zoals de vraag of probiotica de adhesie van bacteriële pathogenen, zoals de pneumokok, kunnen remmen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we het potentiële gebruik van lactobacillus hypnosis, GG en andere probiotica in de luchtwegen gingen onderzoeken. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Jane Manning en Zen, twee PhD-studenten uit ons laboratorium. Splits de dag voor het experiment een confluence-cultuur van CCL 23 epitheelcellen en verdun deze vervolgens in voorverwarmd medium tot een concentratie van 150.000 cellen per milliliter in een steriele buis van 50 milliliter.Zaai vervolgens één milliliter van de cellen per putje in een behandelde 24-wells tissue culture plate en incubeer de cellen een nacht. Inoculeer daarna met een lus van 10 microliter 10 tot 12 gescheiden kolonies van elke bacteriële cultuur in een aliquot van 10 milliliter Todd Hewitt-bouillon met 0,5% gistextract. Vortex kort en incubeer de culturen 14 tot 16 uur op de dag van het experiment.Vortex elke bacteriële cultuur gedurende drie tot vijf seconden, voeg vervolgens 100 µL pneumococci en 100 µL salivarius toe aan gelabelde, voorverwarmde buisjes die 10 mL bouillon bevatten. Vortex de geïnoculeerde buisjes gedurende drie tot vijf seconden en incubeer bij 37 °C om de culturen te laten groeien tot de midden-logfase. Nadat is bevestigd dat de CCL 23-celcultuur een confluentie van ten minste 80% heeft, wordt de transferpipet gebruikt om het medium uit elke well van de 24-wells plaat te verwijderen; kantel de plaat lichtjes om te voorkomen dat de cellaag wordt verstoord. Was de wells vervolgens twee keer door ongeveer 500 µL voorverwarmde PBS toe te voegen en de vloeistof voorzichtig te verwijderen met een transferpipet.Kantel de plaat tijdens het wassen om de monolaag na de tweede wasbeurt beter te behouden. Voeg 500 µL voorverwarmd medium toe aan elke well en plaats de plaat terug in de incubator terwijl de bacteriële culturen worden voorbereid. Meet eerst de optische dichtheid van één milliliter van de levarius-cultuur bij een absorptie van 600.Breng vervolgens vijf milliliter van de Sal Levarius-cultuur over in een buis van 10 milliliter en centrifugeer de buis gedurende vier minuten bij 1.870 Gs bij kamertemperatuur. Gooi na afloop het supernatant weg en resuspendeer het pellet in 200 tot 1000 microliters 0,85% natriumchloride, afhankelijk van de OD-meting, tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1,5 × 10⁹ colony forming units per milliliter. Het toevoegen van het juiste aantal bacteriën is het meest lastige deel van het experiment, aangezien het werkelijke aantal toegevoegde bacteriën pas wordt bepaald wanneer de volgende dag de kolonietelling wordt uitgevoerd.Breng het resuspendeerde speekselinoculum nu over naar een microcentrifugebuis met het label "hoog". Verdun de hoge concentratie 1:10 en 1:100 in meer 0,85% natriumchloride om medium en lage concentraties alvar voor de assay te maken; vortex de buisjes tussen de verdunningen door om de heparine-controleputjes te creëren. Verwijder 40 µL medium uit elk controleputje en voeg 50 µL heparine toe tot een eindconcentratie van 100 units per milliliter per putje.Voeg 10 µL 0,85% natriumchloride toe aan uitsluitend de putjes met CCL 23-cellen en de putjes met CCL 23-cellen plus pneumokokken; vortex alle SIV-concentraties volledig. Voeg vervolgens 10 µL onverdunde, 1:10 en 1:100 SIV-concentraties toe aan de juiste putjes om bacterieel contact met de celmonolaag te bevorderen. Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij 114 ×g bij kamertemperatuur en incubeer de plaat vervolgens een uur terwijl de cellen incuberen. Verdun de spekselvoorraad serieel in 0,85% natriumchloride en gebruik een steriele spreider om 100 µL van de 10⁻⁵, 10⁻⁶ en 10⁻⁷ verdunningen in dubbelvoud uit te plaatten op paardenbloedagarplaten.Kweek de platen in een omgekeerde positie gedurende de nacht tegen het einde van de monolayer-incubatie. Meet de optische dichtheid van de pneumokokkenkweek en centrifugeer vervolgens één milliliter van de cellen. Resuspendeer het pellet in 300 tot 2000 µL 0,85% natriumchloride, afhankelijk van de OD-meting, tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 150 miljoen colony forming units per milliliter.Voeg vervolgens 10 µL onverdunde pneumokokken toe aan alle putjes, behalve de putjes voor de negatieve controle, centrifugeer de 24-wellplaat opnieuw en incubeer de cocultures vervolgens gedurende drie uur. Voer een seriële verdunning uit en plaat de pneumokokkenvoorraad op een vergelijkbare manier als bij salivarius. Controleer na drie uur incubatie de cellen onder de microscoop op eventuele cytopathische effecten.Verwijder nu het medium uit elke well en was de co-culturen voorzichtig drie keer met 1x PBS om de niet-adherente bacteriën te verwijderen, waarbij u er zorg voor draagt de monolagen niet te verstoren. Lyseer vervolgens de cellen met 200 µL 0,1% Digitonine gedurende zeven minuten bij 37 °C en 5% CO2. Voeg daarna 800 µL THB toe aan elke well.Pipette enkele keren op en neer in elke put en oogst de cel-suspensies uit elke put in gelabelde microcentrifugebuisjes. Verdun vervolgens de adherente pneumokokken serieel en tel de volgende dag de kolonies op de betreffende verdunningsplaten. Om de pneumokokken en slovar in deze tabel te kwantificeren, worden de resultaten getoond van een representatief experiment waarin de pneumokokken één uur na de toevoeging van slovar aan CCL 23-cellen werden toegevoegd.De adhesie van pneumokokken werd gekwantificeerd via zowel levende telling als lit. A-Q-P-C-R. De resultaten waren consistent tussen beide methoden voor zowel het absolute aantal bacteriën als het adhesiepercentage. Genormaliseerd naar het aantal adherente pneumokokken in de wells die enkel pneumokokken bevatten.Heparine wordt als controle gebruikt, aangezien bekend is dat het de pneumokokkenadhesie remt. Daarom is een afname van de adhesie met ongeveer 40% of meer in de monsters met pneumokokken plus heparine, vergeleken met alleen pneumokokken, indicatief voor een geslaagde assay. Aangezien speeksel de pneumokokkenadhesie op een dosisafhankelijke manier remt, leidde de hoge concentratie salivarius van ongeveer 10 salivarius per één pneumokok tot de laagste pneumokokkenadhesie.Deze grafieken tonen de adhesie van pneumokokken aan de CCL 23-cellen wanneer salivarius wordt toegevoegd, één uur vóór de pneumokokken, gelijktijdig met de pneumokokken, of één uur na de pneumokokken. Alvar is effectiever in het remmen van de pneumokokkenadhesie wanneer het vóór de pneumokokken wordt toegevoegd, aangezien zowel de hoge als de medium dosis Alvar de pneumokokkenadhesie in de pre-editie assay significant reduceerden. Terwijl in de Coit-editie en post-editie assays alleen de hoge doses Slovar de pneumokokkenadhesie remden.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een in vitro assay uitvoert om de remming van de pneumokokkenadherentie door de probiotische streptococcus cell areas te meten.

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol is een eenvoudige bacteriële hechting test die bestaat in het tellen van de aantallen van bacteriële kolonievormende eenheden die in acht worden genomen op gekweekte cellen. De test is robuust, onafhankelijk van de adhesine bestudeerd en er zijn ontelbare variaties gebruikt in de meeste laboratoria werken aan bacteriële pathogenese.

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

Source: Jagau, H. et al. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the real-time visualization of pneumococcal attachment to Von Willebrand Factor (VWF) strings on endothelial cells under constant media flow conditions. It outlines the steps for stimulating VWF release, labeling the strings, and quantifying bacterial binding.

Evaluating Pneumococcal Attachment to Primary Human Endothelial Cells Under Constant Media Flow

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates an in vitro gut host–microbe model to study bacterial viability. A co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells is incubated with bacteria pre-treated under simulated digestive conditions. Epithelial barrier integrity is assessed using transepithelial electrical resistance, and fractions from the medium, solubilized...

In Vitro Gut Model to Assess Bacterial Adhesion and Internalization

The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Concurrentie in Streptococcus pneumoniae wordt gemedieerd door bacteriocine, kleine antimicrobiële peptiden met remmende activiteit tegen pneumokokken en andere verwante soorten.  Hier beschrijven we een geoptimaliseerde bacteriële overlay-assay die de karakterisering van bacteriocine-activiteit en remmingsspectrum, bacteriocine-specifieke immuniteit en detectie van uitgescheiden quorum sensing-peptiden mogelijk maakt.

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Deze studie een overzicht van het proces van de precieze bedragen gavaging van probiotica met neonatale muizen. De experimentele opstelling is geoptimaliseerd om te omvatten maar is niet beperkt tot probiotische doseren, methoden voor beheer, en kwantificering van bacteriën in de darmen.

Probiotische Studies in neonatale muizen met behulp van de maagsonde

Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel voor de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om polymicrobiële en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen tijdens de verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen verschillende gastheren.

Een muismodel voor de overgang van Streptococcus pneumoniae van kolonisator naar pathogeen bij virale co-infectie vat leeftijdsverergerde ziekte samen

Dit protocol beschrijft de noodzakelijke stappen voor kolonisatie van muizen met pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden, evenals niet-invasieve methoden voor validatie van kolonisatie en beoordeling van de pks+ E. coli-expansie in ontlasting.

Kolonisatie met Murine pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden

Leer hoe probiotische Streptococcus salivarius de hechting van Streptococcus pneumoniae aan epitheelcellen remt met een in vitro-hechtingsassay. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van strategieën tegen pneumokokkenkolonisatie.

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een

Meer video's verkennen