Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een In Vitro Hechting Assay

Het algemene doel van deze procedure is om het vermogen van een probiotische streptokokkencel levarius te onderzoeken om de aanhechting van pneumokokken aan een epitheelcellijn te remmen. Dit wordt bereikt door eerst CCL 23 epitheelcelmonolagen te bereiden. In een 24-wellplaat worden vervolgens slovar en pneumokokken achtereenvolgens aan de monolaag toegevoegd en worden de cellen geïncubeerd.

In de laatste stap worden de wells gewassen om de niet-aanhechtende bacteriën te verwijderen. De CCL 23 epitheelcellen worden gelyseerd en de inhoud van de wells wordt geoogst. Uiteindelijk kan de invloed van salivarius op pneumokokkenaanhechting worden beoordeeld door het aantal celgeassocieerde pneumokokken te kwantificeren.

Deze methode helpt om belangrijke vragen in het veld van infectieziekten te beantwoorden, zoals of probiotica de aanhechting van bacteriële pathogenen zoals de pneumococcus kunnen remmen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we begonnen met het onderzoeken van het potentiële gebruik van lactobacillus hypnose, GG en andere probiotica in de luchtwegen. Het demonstreren van deze procedure zal Jane Manning en Zen zijn voor PhD-studenten uit ons laboratorium Op de dag vóór het experiment de cultuur van confluentie, CCL 23 epitheelcellen, en verdun ze dan in voorverwarmde media tot een concentratie van 150.000 cellen per milliliter in een steriele 50 milliliter buis.

Zaai vervolgens één milliliter van de cellen per well in een behandelde 24-well weefselkweekplaat en incubeer de cellen overnacht. Gebruik vervolgens een 10 microliters lus om 10 tot 12 gescheiden kolonies van elke bacteriecultuur te inoculeren in een 10 milliliter aliquot Todd Hewitt bouillon plus 0,5% gistextract. Vortex kort en incubeer de culturen gedurende 14 tot 16 uur op de dag van het experiment.

Vortex elke bacteriecultuur gedurende drie tot vijf seconden, voeg vervolgens 100 microliters pneumokokken en 100 microliters salivarius toe aan vooraf gelabelde voorverwarmde buizen, die 10 milliliter bouillon bevatten. Vortex de geïncubeerde buizen gedurende drie tot vijf seconden en incubeer bij 37 graden Celsius om de culturen te laten groeien tot middenlog fase. Na bevestiging van minimaal 80% co fluentie van de CCL 23-celcultuur, gebruik de transferpijp om het media uit elke well van de 24-wellplaat te verwijderen, waarbij de plaat licht wordt gekanteld om de celmonolaag niet te verstoren, en was de wells twee keer door ongeveer 500 microliters vooraf voorverwarmd PBS toe te voegen en de vloeistof voorzichtig te verwijderen met een transferpijp.

Kanteel de plaat tijdens het wassen om de monolaag te behouden na het tweede wassen. Voeg 500 microliters voorverwarmd media toe aan elke well en plaats de plaat terug in de incubator terwijl de bacterieculturen worden voorbereid. Meet eerst de optische dichtheid van één milliliter van de levariuscultuur bij absorbantie 600.

Vervolgens brengt u vijf milliliter van de Sal Levarius-cultuur over in een 10 milliliter buis en centrifugeert u de buis gedurende vier minuten bij 1.870 Gs bij kamertemperatuur. Gooi na het weggooien van de snat Res het pellet weg in 200 tot 1000 microliters punt 85% natriumchloride, afhankelijk van de OD-lezing, tot een eindconcentratie van ongeveer 1,5 keer 10 tot de negende kolonievormende eenheden per milliliter. Het toevoegen van het juiste aantal bacteriën is het lastigste deel van het experiment, omdat het werkelijke aantal toegevoegde bacteriën pas wordt bepaald na het tellen van kolonies de volgende dag.

Breng nu het gesuspendeerde speekselinoculum over naar een micro fuge buis met het label hoog. Verdun de hoge concentratie bij een op tien en een op honderd in meer punt 85% natriumchloride om middelmatige en lage concentraties alvar voor de assay te maken. Vortex de buizen tussen de verdunningsstapjes om de heparine controle wells te maken. Verwijder 40 microliters media uit elke controle well en voeg 50 microliters heparine toe tot een eindconcentratie van 100 eenheden per milliliter per well.

Voeg 10 microliters punt 85% natriumchloride toe aan de CCL 23 cellen alleen en de CCL 23 cellen plus pneumokokken alleen wells, volledig vortex alle SIV gebieden concentraties. Voeg vervolgens 10 microliters onverdund een op tien en een op honderd SIV verschillende concentraties toe aan de juiste wells om bacterieel contact met de cel te bevorderen. Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij 114 Gs bij kamertemperatuur en incubeer de plaat vervolgens een uur terwijl de cellen incuberen, verdun seriëel de speeksel stock in punt 85% natriumchloride en gebruik een steriele spreider om 100 microliters van de 10 tot de min vijf, 10 tot de min zes en 10 tot de min zeven verdunning in duplicaat te verspreiden op paardenbloed agar platen.

Kweek de platen met een omgekeerde positie 's nachts naar het einde van de monolaag als salvers incubatie. Meet de optische dichtheid van de pneumokokkencultuur en centrifugeer vervolgens één milliliter van de cellen. Suspensie het pellet in 300 tot 2000 microliters punt 85% natriumchloride, afhankelijk van de OD-lezing, tot een eindconcentratie van ongeveer 150 miljoen kolonievormende eenheden per milliliter.

Voeg vervolgens 10 microliters onverdunde pneumokokken toe aan alle wells behalve de negatieve controle wells, centrifugeer de 24-wellplaat opnieuw en incubeer vervolgens de coculturen gedurende drie uur tijdens de incubatiestap. Verdun seriëel en plateer de pneumokokken stock op een vergelijkbare manier als salivarius. Na drie uur incubatie controleert u de cellen onder de microscoop op eventuele cytpathische effecten.

Verwijder nu het media uit elke well en was de coculturen voorzichtig drie keer met een XPBS om de niet-aanhechtende bacteriën te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat de monolagen niet worden verstoord. Lys vervolgens de cellen met 200 microliters van 0,1% Dig toin gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius