Name: Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Leer diffusiecoëfficiënten meten van EGFP-gelabelde plasmamembraaneiwitten in levende zoogdiercellen met k-Space Beeld Correlatie Spectroscopie. Deze methode onthult membraaneiwitdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Lundbeck Junior groepsleider Fellowship te LNN. PWW erkent subsidies steun van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC). We danken ook de Deense Molecular Bioimaging Center aan de Universiteit van Zuid-Denemarken voor de toegang tot spinning disk microscopie.

Verwerving van EGFP-gelabeld eiwitten in de plasmamembraan van KIG analyse kan worden uitgevoerd op een epifluorescentie microscoop, een TIRF setup of op een draaiende schijf microscoop ingesteld om beelden van het membraan plaats verwerven. De camera pixelgrootte en de tijd tussen beeldframes nodig is voor de analyse. Afbeelding sequenties van 100-1200 frames met een beeldsnelheid van 4-30 Hz kan worden gebruikt voor de analyse. Tijdens de overname, is het belangrijk om het membraan in focus tijdens de duur van de beeldvorming en focus op een fractie van de vlakke membraan waarin de fluorescentie wordt gelijkmatig verdeeld. Moving blaasjes, uitstekende membraan regio&#39;s en celorganellen kan later in het analyseproces worden uitgesneden. De acquisitie tijd moet worden gekozen dat er geen drift of beweging van de cel. Om de KIG code scripts voor MATLAB krijgen, contact opnemen met Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). De eerste keer dat de KIG code wordt gebruikt, geopend MATLAB en klik file en stel pad, klik voegen met submappen en vind de map op de computer waarin de KIG code zich bevindt. Klik vervolgens op OK, opslaan en sluiten. Ga nu verder met de analyse van gewassen in de volgende punten beschreven. 1. Importeer de afbeelding sequentie van belang in een Imaging Analysis Program als een TIFF Stack Sla het bestand met de naam: stack1.tif. <ol><li> Selecteer een rechthoekig gebied van belang (ROI) op het vlakke gedeelte van het membraan zonder bewegende celorganellen en uitstekende membraan regio. Het gewas omvang wordt gekozen, zodat er voldoende statistieken worden gegenereerd ten goede k 2 percelen. </li><li> Snijd de regio en sla het gewas als een TIFF-bestand in een geschikte map. Als er verschillende gewassen uit dezelfde film, gebruiken een aantal increment, bijvoorbeeld &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Plaats de map met de gewassen lokaalop de computer, niet op een server, terwijl het doen van KIG analyse. </li></ol> 2. Importeer de gewassen in de Analysis Software One by One om de analyses uit te voeren <ol><li> Open MATLAB en typ &quot;icsgui&quot; in het commando venster en druk op ENTER. ICS GUI is het uitvoerbare naam voor de afbeelding correlatie spectroscopie grafische gebruikersinterface programma. </li><li> In de ICS GUI klik op het tabblad &quot;KIG&#39;s&quot;. Een beeld van het analysevenster wordt getoond in figuur 1. </li><li> Zoek de map met de naam van de map &quot;MATLAB-code&quot; en blader naar het bestand met de bestandsnaam &quot;Scripts&quot; en open deze door erop te dubbelklikken. Of klik rechtermuisknop op het bestand en kies &quot;openen met MATLAB&quot; of ga naar bestand, open in MATLAB en open de scripts bestand. Dit bestand heet Editor. </li><li> In de Editor scroll naar &quot;Load KIG data sets&quot;, deze te kopiëren of naam bestandstype en de map locatie in de opdrachtregel die begintmet img = bijvoorbeeld &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. In de opdrachtregel onder de map locatie stelt u het aantal frames te analyseren - bijv. [1:500]. Gebruik dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de gegevensreeks. Als er aandacht drift in latere frames, moeten deze van de analyse uitgesloten. </li><li> In de editor klik op &quot;opslaan&quot; en klik vervolgens op &quot;cel te evalueren&quot;. De dataset is nu geladen in in de analyse software. </li><li> In het venster KIG Analyse in de GUI, voert u de instellingen voor de analyse: <ol><li> Unclick &quot;T-cel&quot; dozen. </li><li> Voer het aantal vertragingen te analyseren. Het aantal keer dat vertragingen (τ) zal effect hebben op de verspreiding perceel en moet worden gekozen dat de diffusie perceel is lineair. Begin met het invoeren van 25 en dan af naar de plaats waar de diffusie plot is lineair. τ is het aantal er tijd verloopt de KIG analyse vergelijkt en een vertraging is de tijd bussen een frame en het volgende. De kleinste waarde die een lineaire grafiek geeft worden gekozen. Het maximum aantal vertragingen wordt gekozen dat een lineaire passing wordt verkregen, het kiezen van een hogere waarde gegevens die niet lijn worden gemonteerd produceren. </li><li> Voer de maximale k 2-waarde (zie cirkel 1 in figuur 1), is het meestal 20-50. Een goede k 2 perceel is een perceel waar er veel datapunten die zijn verdeeld langs een lijn. Begin met het invoeren van 70 en dan af na de k 2 en diffusie percelen te hebben geëvalueerd en kies de laagste waarde waar de datapunten cluster rond een rechte lijn. De k2 waarde is de gekwadrateerde grootte van de ruimtelijke k-vector in Fourierruimte. In eerste instantie moet de analyse worden herhaald tot de beste waarden worden bepaald, gebruik dan dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de data-serie, maar altijd controleren of de geselecteerde instellingen geven een goede match met de gegevens: goede k 2 percelenen een lineaire diffusie plot. </li><li> Klik op &quot;Instellingen opslaan en verder&quot;. </li><li> Klik op &quot;ja&quot; om alle grafieken tonen. </li><li> Klik op &quot;Load image serie&quot; (zie cirkel 2 in figuur 1) en klik op &#39;werkruimte&#39;. </li><li> Selecteer &quot;imgSerCrop&quot;, klik op &quot;Importeren uit Workspace&quot;. </li><li> Voer het imaging systeem collectie instellingen. In het vak &quot;pixelgrootte&quot; voer het geprojecteerde pixelgrootte voor de imaging-systeem waarin het beeld stapels worden verworven. Voor AQP3-EGFP, 0.111 gebruikt. In het vak &quot;Voer de tijd (s) tussen frames&quot;, 0,1150 werd gebruikt voor AQP3-EGFP. </li><li> Klik op &quot;selecteer ROI&quot;, voert u &quot;1&quot;, klik op OK en &quot;gebruiken gehele beeld&quot;. </li><li> Klik op &quot;Do KIG analyse&quot; en klik op Ja om &quot;immobiel filtering&quot; doen. De resultaten zullen automatisch open als afbeeldingen. </li><li> Het venster instellingen te minimaliseren, het minimaliseren van de cel info Window, en het minimaliseren van het venster fotofysica. In het venster dynamiek, controleer dan of de dynamiek plot geeft grafisch weer een lineaire fit van de gegevens aan een lijn met een negatieve helling betekent dat de gegevens correleren en gratis verspreiding kan worden aangenomen. Noteer de diffusiecoëfficiënt van de specifieke vertraging en k 2 instellingen (het is niet nodig de standaardafwijking van de pasvorm noot). De gegevens in de k 2 percelen moet worden geclusterd rond de lijn voor de gegeven tijd loopt. </li><li> Vakje &quot;Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen&quot; en klik op &#39;Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen &quot;te redden leiden bestanden. Opslaan in een nieuwe map onder C: Users Documents AQP3diffusion. Klik op &quot;clear huidige gegevens&quot; en ga verder met de analyse van de volgende oogst. </li></ol></li></ol> 3. Gemiddelde van het berekende diffusiecoëfficiënt wordt berekend om een ​​overzicht van de geanalyseerde gegevens ophalen <ol><li> Voer de individuele diffusiecoëfficiënten uit elke ROI in een SPREadsheet (zorg ervoor dat de τ noot en k 2 waarden), gebruik maken van de namen van de gewassen zoals hierboven uiteengezet. </li><li> Bereken de gemiddelde diffusiecoëfficiënt en de standaarddeviatie met behulp van een spreadsheet programma. </li><li> Voer een Kolmogorov-Smirnov test of een student t-test statistische verschillen te evalueren met behulp van een 5% significantie niveau. Kwantitatieve vergelijkingen tussen cellen (bijvoorbeeld behandelde versus onbehandelde) kunnen worden gemaakt. </li><li> Open de spreadsheet versie van de diffusie percelen die werd gegenereerd door de analysesoftware voor elk gewas en de gemiddelde gegevens voor elke voorwaarde voor elke vertraging. Genereer een nieuwe gemiddelde diffusie plot voor de presentatie in kranten of presentaties. </li></ol>

<ol><li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-Space+image+correlation+spectroscopy%3A+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+Applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li>
<li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li>
<li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li>
<li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Deze paper gepresenteerd uitvoerige stap-voor-stap overzicht van hoe de KIG analysemethode gelden voor diffusie coëfficiënt te bepalen van microscopie beelden van eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten. De analyse is onafhankelijk probe keuze met een zeer breed dynamisch bereik etikettering dichtheid en kan dus ook worden toegepast op eiwitten gelabeld met quantum dots en kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zoals EGFP. Geldige diffusie coëfficiënten voor de berekening van eiwitten...

De vierdimensionale spatiotemporele organisatie en laterale mobiliteit van plasmamembraaneiwitten zijn strak gereguleerd en kan een rol spelen in eiwitfunctie, activiteit en eiwit-eiwit interacties. Laterale diffusie van plasmamembraan eiwitten, is van oudsher bestudeerd door het berekenen diffusiecoëfficiënten voor enkele deeltjes van time-lapse imaging van quantum dot of kleurstof gelabelde plasmamembraaneiwitten 2-4. Deze benadering vereist het inbrengen van een extracellulair tag in de plasmamembraan eiwit quantum dot of kleurstof etikettering, die eiwitvouwing en functie kunnen beschadigen en derhalve niet kan worden bereikt voor sommige eiwitten. Het sterische volume van een quantum dot is aangetoond vertragen diffusie van het proteïne 5 en bovendien slechts een fractie van de eiwitten in de populatie zijn gelabeld met quantum dots, en het is niet bekend of deze fractie is representatief voor de totale pool van plasmamembraaneiwitten. Enkel deeltje tracking (SPT) metingen van diffusiecoëfficiënten uit beeld-serie van quantum dot gelabelde eiwitten betreft het in kaart brengen van de afgebeelde top posities van de deeltjes met twee dimensionale Gauss-fits gevolgd door uitgebreide analyse algoritmen. De analyse is computationeel zeer intensief, die uitgebreide niet-lineaire curve fitting in elk beeld frame van een time-lapse volgorde om benaderingen van de microscoop puntspreidingsfunctie (meestal twee dimensionale ruimtelijke Gaussians) en daaropvolgende koppeling van deeltje posities in deeltjestrajecten beschrijven van de beweging van enkele moleculen 6,7. Een recent ontwikkelde beeldcorrelatie techniek, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG&#39;s) maakt relatieve eenvoudige metingen van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabeld plasmamembraan eiwitten. De mogelijkheid om routinematig berekenen diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten door KIG is een unieke tool die houdteen aantal voordelen ten opzichte van traditionele quantum dot SPT analyse: geen invoeging van extracellulaire tags en tijdrovend extracellulaire etikettering vereist (cellijnen die fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt); diffusie coëfficiënten worden uit de totale verzameling van fluorescente proteïnen ten opzichte van een subset gelabeld met quantum dots; analyse is eenvoudig zonder dat enige proteïnen volgen en de analyse kan worden uitgevoerd met een bestaande code zonder behoefte aan extra gebruikersprogrammering. De werkwijze is snel omdat het een gemiddelde techniek die snelle berekening en de berekening van diffusiecoëfficiënten maakt. Deze snelle verspreiding metingen voor het eiwit bevolking aanvulling op de meer gedetailleerde informatie moleculair transport voor een subset van de populatie verkregen door het zorgvuldige SPT methoden. KIG tijd correleert fluorescentie microscopie afbeelding sequenties die van tevoren zijn omgevormd tot Fourier ruimte, en daardoor scheidt fluorescence schommelingen als gevolg van fotofysica uit die als gevolg van moleculaire vervoer 1. Hierdoor kan het aantal KIG dichtheid te bepalen, luchtsnelheid en verspreiding van fluorescent gelabelde moleculen terwijl onpartijdige door complexe fotobleken of knipperen van de fluoroforen. Dit maakt KIG een nuttig hulpmiddel voor het snel de verspreiding dynamiek van fluorescent gelabelde celmembraan eiwitten bepalen zonder aangepaste schrijven algoritmen. Naast fluorescent gelabelde eiwitten KIG kan ook worden toegepast op quantum dot-gemerkte membraaneiwitten 8. Dit document biedt een stap-voor-stap introductie van hoe KIG gebruiken om diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten halen door aan te tonen hoe het gewas te plaatsen, hoe je de code en hoe u de gegenereerde percelen, te evalueren gebruiken waaruit diffusie coëfficiënten worden gewonnen. Als voorbeeld, gegevens verkregen door het draaien van schijf-microscopie set in semi-totale interne reflectie fluorescerenNVU (TIRF) modus van een nier waterkanaal eiwit aquaporin-3 (AQP3) getagged met EGFP wordt gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Peniciline&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=nl&amp;region=NL">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Fenolr Rood Vrij medium</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=nl&amp;region=NL">D8418 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

gemakkelijk meting van diffusiecoëfficiënten van egfp-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van k-space beeld correlatie spectroscopie

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Laterale diffusie en compartimentering van plasmamembraan eiwitten worden strak gereguleerd in cellen en dus, het bestuderen van deze processen zullen nieuwe inzichten onthullen plasmamembraaneiwit functie en regulatie. Onlangs, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG&#39;s) 1 is ontwikkeld om routinematige metingen van diffusiecoëfficiënten staat rechtstreeks van beelden van fluorescent gelabelde plasmamembraaneiwitten, dat systematische fouten geïntroduceerd door sonde fotofysica vermeden. Hoewel de theoretische basis voor de analyse is complex, kan de werkwijze worden uitgevoerd door nonexperts met een vrij verkrijgbaar code diffusie coëfficiënten van proteïnen te meten. KIG berekent een tijd correlatie functie van een fluorescentie microscopie afbeelding stapel na Fourier transformatie van elk beeld om wederzijdse (k-) ruimte. Vervolgens circulaire middeling, natuurlijke logaritme transformeren en lineaire past om de correlatie functie levert de diffusiecoëfficiënt. Dezepapier zorgt voor een stap-voor-stap handleiding voor de beeldanalyse en meting van diffusiecoëfficiënten via KIG&#39;s. Eerst wordt een hoge framesnelheid beeld sequentie van een fluorescent gemerkt plasmamembraaneiwit verkregen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vervolgens wordt een regio van belang (ROI) te vermijden intracellulaire organellen, bewegende blaasjes of uitstekende membraan regio geselecteerd. De ROI stack wordt geïmporteerd in een vrij beschikbare code en een aantal gedefinieerde parameters (zie methode sectie) ingesteld voor de KIG analyse. Het programma genereert vervolgens een &quot;helling pistes&quot; plot van de k-ruimte tijd correlatie functies, en de diffusie coëfficiënt wordt berekend uit de helling van het perceel. Hieronder is een stap-voor-stap KIG procedure om de diffusie coëfficiënt van een membraan eiwit meten met behulp van de renale waterkanaal aquaporine-3 gelabeld met EGFP als een canonieke voorbeeld.

Om geschikte afbeelding stapels worden geanalyseerd met de KIG te verwerven, kunnen verschillende microscoop systemen worden gebruikt. Het is mogelijk om beeldsequenties van een epi-fluorescentiemicroscoop en een TIRF of draaiende schijf opstart analyseren. Het membraan moet vlak zijn, zonder grote bewegende celorganellen of bewegende blaasjes / objecten. Dit document presenteert een time lapse sequentie van beelden van AQP3 gelabeld met EGFP in levende MDCK cellen afgebeeld op een draaiende schijf microscoop met focus ...

Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG&#39;s) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten in levende cellen. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken die het GFP-getagde eiwit tot expressie brengen, om vervolgens een time-lapse beeldsequentie op te nemen met een spinning disc microscoop, waarbij de focus is ingesteld op het plasmamembraan. De tweede stap is het selecteren van een uitsnede in de beeldstapel waarin het membraan vlak is en er geen bewegende organellen aanwezig zijn.Vervolgens wordt het uitgesneden beeld geanalyseerd met behulp van software voor case-based image correlation spectroscopy. De laatste stap is het middelen van de diffusieplots in Excel. Uiteindelijk wordt live-cell microscopie in combinatie met kicks gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van een membraaneiwit te meten.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de membraanbiofysica, zoals het bepalen van de diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten onder verschillende omstandigheden. Wanneer de kicks-code voor het eerst wordt gebruikt, open dan MATLAB en klik op 'file'. Selecteer vervolgens 'set path', klik op 'add with sub folders' en zoek de map op de computer waarin de kicks-code zich bevindt.Klik op oké. Voordat u MATLAB tijdens de acquisitie opslaat en sluit, is het belangrijk om het membraan gedurende de gehele duur van de beeldvorming in focus te houden. Selecteer een rechthoekig interessegebied of ROI op het vlakke gedeelte van het membraan waar de fluorescentie gelijkmatig is verdeeld.Sluit bewegende celorganellen en uitstekende membraangebieden uit. De uitsnedemaat is zodanig gekozen dat er voldoende statistieken worden gegenereerd voor kwalitatieve K-kwadraatplots. Snijd het gebied uit en sla de uitsnede op als een tiff.Sla het bestand op in een geschikte map. Als er meerdere uitsneden van dezelfde film zijn, gebruik dan een oplopend nummer, zoals stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif, enzovoort. Om de analyse uit te voeren, opent u eerst Matlab, typt u ICS gooey in het opdrachtvenster en drukt u op enter ICS.GUI is de uitvoerbare naam voor het grafische gebruikersinterfaceprogramma voor beeldcorrelatiespectroscopie in de ICS Gooey. Klik op het tabblad kicks. Zoek de map met de mapnaam MATLAB code.Scroll naar het bestand met de bestandsnaam scripts en open dit door erop dubbel te klikken. Dit bestand wordt de editor genoemd. In de editor.Scroll om de kicks-datasets te laden. Kopieer of typ vervolgens de bestandsnaam en de maplocatie in de opdrachtregel. In de opdrachtregel onder de maplocatie.Stel het aantal te analyseren frames in. Gebruik voor alle opeenvolgende video's in de dataserie dezelfde instellingen. Indien er sprake is van focusdrift in latere frames.Deze moeten in de editor worden uitgesloten van de analyse. Klik op opslaan en vervolgens op evalueren. De dataset is nu geladen in de analysesoftware in het kicks-analysevenster in de gui.Voer de instellingen voor de analyse in door eerst de vakjes voor T-cellen uit te vinken. Voer vervolgens het aantal time-lags in dat geanalyseerd moet worden. Voer de maximale K kwadraat in.In eerste instantie ligt dit meestal tussen de 20 en 50. De analyse moet worden herhaald tot de optimale waarden zijn bepaald, waarna deze instelling moet worden gebruikt voor alle opeenvolgende video's in de dataserie. Controleer altijd of de geselecteerde instellingen een goede passing van de gegevens opleveren, wat blijkt uit goede case square-plots en een lineaire diffusieplot.Klik vervolgens op store settings en ga verder. Klik daarna op yes om alle grafieken weer te geven. Klik op load image series en vervolgens op workspace.Selecteer de uitsnede van de beeldserie voordat u op importeren vanuit werkruimte klikt. Voer nu de instellingen voor de collectie van het beeldvormingssysteem in het vak pixelgrootte in. Voer de geprojecteerde pixelgrootte in voor het beeldvormingssysteem waarmee de beeldstapels zijn verkregen.Klik op select ROIs en voer er één in. Klik vervolgens op okay en gebruik whole image. Klik op do kicks analysis en klik op yes om immobile filtering uit te voeren.De resultaten worden automatisch als afbeeldingen geopend. Minimaliseer het instellingenvenster, het venster met celinformatie en het fotofysica-venster in het dynamica-venster. Controleer of de dynamica-plot een lineaire fit van de gegevens laat zien die overeenkomt met een negatieve helling, wat betekent dat de datapunten correleren en er van vrije diffusie kan worden uitgegaan.Registreer de diffusiecoëfficiënt voor de specifieke tijdvertraging en de K-kwadraat-instellingen. De datapunten in de K-kwadraat-plots moeten geclusterd zijn rond de lijn voor de opgegeven tijdvertraging. Vink het vakje 'save open figures as images' aan en klik vervolgens op 'save open figures as images' om de resultaatbestanden op te slaan.Sla dit op in een nieuwe map, klik vervolgens op 'clear current data' en ga verder met de analyse van het volgende gewas. Voer de individuele diffusiecoëfficiënten van elke ROI in een spreadsheet in, gebruikmakend van de eerder ingestelde gewasnamen, en noteer zorgvuldig het aantal time lags en de K squared-waarden. Bereken de gemiddelde diffusiecoëfficiënt en de standaarddeviatie met behulp van een spreadsheetprogramma.Voer een MOV Smirnoff-test of een student t-toets uit om statistische verschillen te evalueren. Met een significantieniveau van 5% kunnen kwantitatieve vergelijkingen tussen cellen open worden gemaakt. De spreadsheetversie van de diffusieplots is gegenereerd door de analysesoftware voor elk gewas en bevat de gemiddelde gegevens per conditie voor elke tijdvertraging.Genereer een nieuwe gemiddelde diffusieplot voor presentatie in artikelen of presentaties. De hier gepresenteerde resultaten zijn een time-lapse beeldsequentie van Aquaporine 3 gelabeld met EGFP. In levende MDCK-cellen, welke renale epitheelcellen zijn, gefotografeerd met een spinning disc-microscoop waarbij de focus is ingesteld op het plasmamembraan.Hier wordt een afbeelding van de cel getoond met voorbeeld-ROI-uitsneden gemarkeerd in rechthoeken voor de selectie van de uitsneden. Het is belangrijk om uit te snijden aan de periferie van de cel waar het membraan uniform en vlak is, zodat er slechts een tweedimensionale diffusie wordt gevisualiseerd. Celorganellen, blaasjes en membraanuitstulpingen moeten worden vermeden, en voor de analyse is het essentieel dat er geen drift optreedt tijdens de time-lapse.Dit representatieve uitsnedevlak werd uitgesloten van de analyse en kicks omdat er bewegende blaasjes aanwezig zijn, die kunnen bijdragen aan de diffusiecoëfficiënt. Een ander voorbeeld van een uitgesloten uitsnedevlak waarin een gat in het membraan zit, wordt hier getoond. De diffusiegrafiek van één uitsnedevlak gegenereerd met kicks wordt hier gepresenteerd.Deze methode kan worden gebruikt om de diffusiecoëfficiënt te bepalen van een eiwit dat is gelabeld met een fluorescent eiwit, een kleurstof of quantum dots. De helling van de curve in de diffusieplot is simpelweg het negatieve van de diffusiecoëfficiënt; hier is een berekende diffusieplot getoond voor Aquaporine 3 gelabeld met EGFP met te veel tijdvertragingen (time lags). In dit geval is de analyse opnieuw uitgevoerd, maar met minder tijdvertragingen, zodat de diffusieplot lineair is.Hier wordt een typische case squared-plot gepresenteerd. Dit is de radiaal gemiddelde en logaritmisch getransformeerde correlatiecurve voor een geselecteerde tijdsvertraging uit deze K squared-plots. De helling is uitgezet tegen de tijdsvertragingen, en het resultaat is de eerder getoonde diffusieplot.Bij het inspecteren van de K-kwadraatplots is het belangrijk dat de fit wordt geëvalueerd aan de hand van deze K-kwadraatplot. Er kan worden geconcludeerd dat de uitsnede te klein is en niet geanalyseerd kon worden, aangezien deze een negatieve helling zou moeten hebben en lineair moet afnemen tot een ruisvloer. Deze K-kwadraatplot moet opnieuw worden geanalyseerd met een verlaagde maximale K-kwadraatwaarde, omdat de fit niet langer adequaat is, afgaande op de toenemende residuen bij grotere K-kwadraatwaarden.In dit geval moet de analyse opnieuw worden uitgevoerd, waarbij een lagere maximale K-kwadraatwaarde wordt ingevoerd. Hier wordt een gemiddelde diffusieplot getoond, gemiddeld over 10 crops. De diffusieplot is gevonden in het Excel-bestand van de analyse en daaruit verkregen.De diffusiecoëfficiënt van AQUAPORIN drie EGFP wordt berekend volgens deze procedure. Andere methoden, zoals het meten van de diffusiecoëfficiënt van membraaneiwitten na toevoeging van verschillende geneesmiddelen, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de diffusiecoëfficiënt verandert na behandeling met geneesmiddelen, en of het waarschijnlijk is dat er veranderingen optreden in de lipide-omgevingen en/of eiwit-eiwitinteracties in het membraan.

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Een methode om eiwitdiffusie in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) wordt beschreven. In dit artikel wordt het gebruik van antilichamen voor fluorescentielabeling geïllustreerd.

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.

Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

Leer diffusiecoëfficiënten meten van EGFP-gelabelde plasmamembraaneiwitten in levende zoogdiercellen met k-Space Beeld Correlatie Spectroscopie. Deze methode onthult membraaneiwitdynamica.

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie (Video) | JoVE Journal

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

Meer video's verkennen