Shock Wave Toepassing op celculturen

Het algemene doel van deze procedure is om storende fysieke effecten tijdens in vitro shockwave-behandelingen te vermijden om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst een kweekfles volledig te vullen met kweekmedium en de fles vervolgens in een verwarmd waterbad te plaatsen. De tweede stap is het gebruik van een royale hoeveelheid echogel bij het koppelen van de applicator aan het waterbad.

Vervolgens wordt de applicator horizontaal tegen het membraan van het waterbad geplaatst. De laatste stap is om te controleren of de schokgolfbron is uitgelijnd met het centrum van de kweekfles, zodat de cellen zich binnen de focus van de golf bevinden. Ten slotte kan de analyse van de cellen worden uitgevoerd, bijvoorbeeld met real-time PCR en een cytokine-array om een verandering in de betreffende genen en cytokines aan te tonen.

We kregen voor het eerst het idee voor dit model toen we zagen dat bestaande methoden om korte golven direct op celculturen toe te passen geen rekening houden met het effect van golfreflectie bij de overgang van het cultuurmedium naar de omgevingslucht. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Chante, promovendus uit mijn onderzoeksgroep. Begin met het verwarmen van 3,5 liter kraanwater tot 37 °C.

Houd vervolgens het verhitte water over in het waterbad. Het waterniveau moet drie centimeter onder de bovenkant van het waterbad liggen en het membraan volledig bedekken. Sluit daarna de temperatuursensor aan op een voeding en plaats de temperatuursensor in de fitting op de achterwand van het waterbad.

Terwijl het water wordt geroerd, wordt de verwarmingsplaat aangesloten op een stroombron en wordt het water verhit tot een stabiele temperatuur van 37 °C. Onder steriele omstandigheden worden cellen uitgeplaat in T 25 kweekflessen.

Zo bereiken ze een confluentie van 90% na een incubatie gedurende de nacht. Plaats de kolf vervolgens verticaal en vul deze met kweekmedium tot aan de onderkant van de hals van de kolf om contaminatie te voorkomen. Zorg ervoor dat het medium niet in contact komt met de hals van de kolf of de sluitingsdop.

Sluit de kolven vervolgens af met een dichte dop zonder filter om contaminatie door het water in het bad te voorkomen. Zet de doppen daarna vast met parafilm. Klem de kolven in een statief zodra ze zijn afgesloten.

Plaats vervolgens de gefixeerde kolfjes in het waterbad en richt het midden van de celkweekkolf uit. Breng met het midden van het membraan van de schokgolfapplicator voldoende hoeveelheden ultrasone transmissiegel aan op de schokgolfapplicator en het membraan van het waterbad. Verbind vervolgens de applicator met het membraan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen beide aanwezig zijn.

Houd vervolgens de shockwave-applicator in het midden van het membraan en zorg ervoor dat deze horizontaal en verticaal is uitgelijnd met de kweekfles om behandeling van het gehele celgroeioppervlak te garanderen. Voer daarna een proefexperiment uit om de ideale afstand tussen de shockwave-applicator en de kweekfles te bepalen, alsmede om de juiste behandelingsparameters vast te stellen. Zorg ervoor dat de kweekfles en de applicator in een stabiele positie blijven tijdens de activering van het shockwave-apparaat.

Zodra een ideale afstand is bepaald, wordt het experiment uitgevoerd volgens de gewenste parameters voor de shockwave-behandeling. Nadat de shockwave-behandeling is voltooid, wordt de kweekfles uit het waterbad gehaald, afgedroogd met papieren handdoeken en wordt het buitenoppervlak van de fles gedesinfecteerd. Vervolgens wordt het medium vanuit de fles overgebracht naar een centrifugebuis.

Pellet de cellen volgens de normale centrifugeparameters. Resuspendeer de celpellet in twee milliliter celcultuurmedium en breng de celsuspensie vervolgens terug in de kolf met vijf milliliter celcultuurmedium; kweek de cellen tot de vereiste confluentie voor celanalyse-experimenten. Real-time PCR-analyse van menselijke endotheelcellen uit de navelstrengader toonde een opregulatie van tie2 mRNA-niveaus aan na shockwavebehandeling.

Dit suggereert dat schokgolfbehandeling de proliferatie van endotheelcellen en angiogenese verhoogt. De cytokineniveaus in de navelvene werden bepaald. Endotheelcellen werden gekwantificeerd met behulp van een cytokine-array.

Ook de twee inflammatoire cytokinen IL six en IL eight bleken significant verhoogd te zijn, waarbij beide betrokken zijn bij de ontsteking die het angiogene proces na de ontwikkeling begeleidt. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor talrijke onderzoekers in het veld van de fundamentele schokgolfwetenschap om de effecten op een enkel celtype in in vitro experimenten te onderzoeken. We hopen nog meer onderzoekers te overtuigen om dit model te gebruiken om reproduceerbare en vergelijkbare resultaten in de schokgolfwetenschap te verkrijgen.