Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging

TimeLapse-microscopie maakt het mogelijk om processen van ontwikkeling, groei of drift van een monster te visualiseren die gedurende de beeldvorming optreden. Bij de acquisitie kan het voorkomen dat het niet mogelijk is om celbewegingen te volgen of te tracken; het volgende protocol beschrijft hoe we open-source beeldbewerkingssoftware gebruiken om driedimensionale drift over tijd te corrigeren.

Het vastleggen van een reeks optische doorsneden op verschillende brandpuntsvlakken maakt het mogelijk om een driedimensionaal model van het monster te genereren. Dit kan worden uitgebreid naar vier dimensies door een time-lapse serie van 3D-datasets te maken. Bij langdurige time-lapse experimenten komt het vaak voor dat er beweging van het monster wordt waargenomen.

Dit kan worden veroorzaakt door onnauwkeurigheden bij het verschuiven van de hardware die de tafel en brandpuntsposities aanstuurt, terwijl het in andere gevallen drift is als gevolg van bewegingen veroorzaakt door monstergroei of flexibiliteit binnen de montage-media. Er bestaan methoden om dit te compenseren en deze bewegingen te beperken, met talrijke verbeteringen aan hardwarematige focussystemen en de verhoogde stijfheid van het montagemedium. Deze benaderingen kunnen echter in veel gevallen niet worden toegepast vanwege de beeldgevingsopstelling die nodig is om geschikte omstandigheden te bieden voor het behoud en de groei van de monsters. Om monsterdrift te corrigeren, hebben we een plug-in ontwikkeld voor het open-source beeldbewerkingsplatform Fiji.

Onze Correct 3D Drift-plugin is in staat om een fasecorrelatieregistratie te vormen om bewegingen te corrigeren die optreden als rol of monsterdrift in driedimensionale time-lapse experimenten in multi-channel experimenten. De Correct 3D Drift-plugin maakt gebruik van één kanaal om de benodigde correctie te bepalen. Deze correctie wordt vervolgens toegepast op alle aanvullende kanalen, wat resulteert in de registratie van de 4D-dataset.

Het open-source gratis webpakket. Fiji is een distributie-fork van het ImageJ-programma, dat vooraf geïnstalleerde plug-ins bevat om talrijke processen uit te voeren op gegevens die zijn verzameld uit microscopie-experimenten. Fiji biedt een eenvoudigere plug-inarchitectuur en is inbegrepen in de standaardinstallatie.

Een kopie van de juiste drie EG-plugin, die we voor deze analyse zullen gebruiken wanneer de installatie is voltooid. Open Fiji. Fiji ondersteunt de import van een breed scala aan propriëtaire microscopie-beeldformaten. Dit kan via drag-and-drop of via de gebruikersinterface van de Open Microscopy Environment.

Bio-formats import-plug-in. Als de dataset groter is dan het geïnstalleerde geheugen van uw systeem, open het afbeeldingsbestand dan als een virtuele stack en gebruik een optie voor geheugenbeheer. De dataset die we in deze analyse gebruiken, is gegenereerd uit een driedimensionaal tijdserie-experiment met ACTA1-GFP transgene zebravisjes, waarbij GFP tot expressie komt in de skeletspieren.

Om de kernen te visualiseren, werd deze transgene lijn geïnjecteerd met nucleo-lokaliserend M cherry. Om deze fluorescentie beter weer te geven, kunnen we de lookup-tabellen voor elk van deze kanalen wijzigen via de tool voor kleurkanalen. Gedurende de verzamelde tijdreeks lijkt het zebravismonster te zijn verschoven in het gezichtsveld. Om deze drift te corrigeren, werd de 3D-driftplugin geopend in het registratiemenu van de geïnstalleerde plugins in Fiji.

Cellmarkers die ofwel breed tot expressie komen binnen een monster of niet betrokken zijn bij de markeringsgebeurtenissen tijdens de beeldacquisitie, vormen de beste bron voor driftcorrectie. In dit voorbeeld is dat ACTA, GFP-fluorescentie in kanaal één. Als het geheugen van uw systeem beperkt is, selecteer dan de optie virtuele stack en laat de plugin Correct 3D drift draaien.

De gecorrigeerde dataset zal een grotere canvasgrootte hebben vergeleken met de originele, om rekening te houden met de beweging van het monster. Door maximale projectiebeelden van de optische coupes te genereren, kan de drift die uit het gecorrigeerde monster is verwijderd, worden vergeleken.

De maximaalintensiteitsprojectie verwijdert de dimensie uit de dataset, maar is een nuttige benadering om snel de resultaten van de driftcorrectie te onderzoeken. Hier zien we de maximaalprojectiebeelden voor elk verbindingspunt in hun gecorrigeerde en ongecorrigeerde datasets. Wanneer dit time-lapse-experiment als één enkel beeld wordt geprojecteerd, is de hoeveelheid drift die zelfs in een kort time-lapse-experiment kan optreden duidelijk zichtbaar.

De correcties die zijn aangebracht door de drift van één kanaal van uw monster te registreren, worden ook toegepast op alle andere kanalen in deze beeldstapel. De procedure voor driftcorrectie is enigszins gewijzigd als het geheugen van uw systeem beperkt is. Selecteer de optie 'used virtual stack' in zowel het menu 'File', 'Import', als in het pop-upmenu van de plugin 'Correct 3D Drift'.

Wanneer u deze optie selecteert, wordt u gevraagd een locatie te kiezen waar een plug-in individuele afbeeldingsbestanden per kanaalslice en tijdstip van uw time-lapse experiment kan exporteren. De gegenereerde virtuele stack bevat dezelfde driftcorrectie als in ons vorige voorbeeld. Als we de geselecteerde opslaglocatie openen, zien we de resulterende individuele afbeeldingssequentiebestanden die zijn gegenereerd.

Gebruik de tool voor het importeren van beeldsequenties om deze verzameling bestanden te openen. Het resulterende bestand zal kanalen, optische coupes of tijdspunten niet scheiden. Om deze kenmerken te visualiseren, converteert u de stack naar een hyperstack met behulp van de gegevens uit het logbestand door het aantal kanalen, optische coupes en verzamelde tijdspunten in te voeren. We kunnen vervolgens de opzoektabelen wijzigen om de weergegeven kleur van ons time-lapse-experiment aan te passen.

Dit protocol corrigeert voor drift die optreedt tussen tijdspunten; drift die optreedt tijdens de acquisitie van een enkel tijdspunt kan niet met dit protocol worden gecorrigeerd. We raden aan om de parameters voor beeldacquisitie zodanig te kiezen dat de tijd die nodig is voor de vastlegging van elk tijdspunt wordt geminimaliseerd. De mogelijkheid om drift in post-processingsoftware te corrigeren, maakt het mogelijk om celbewegingen te analyseren en te meten die anders zouden worden overschaduwd door de drift van het monster.