Name: Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer hoe je driedimensionale monsterdrift corrigeert in tijdopnamemicroscopie met open-source software. Deze methode verbetert het volgen van celbewegingen en genereert accurate 4D-modellen voor ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Gaby Martins en de organisatoren van de EMBO2010 3D Developmental Imaging werkplaats waar dit werk begonnen en alle medewerkers aan de Fiji en ImageJ projecten bedanken.

1. 4D time-lapse imaging Experimenten De instellingen die worden gebruikt voor het overname zal verschillen afhankelijk van de gebruikte apparatuur. Het vermogen van confocale microscopie optisch gedeelte een monster hangt af van een aantal factoren: de golflengte van excitatie, pinhole grootte numerieke apertuur van het objektief, de brekingsindex van het monster en het medium waarin het monster is ingebed. De grootte van de confocale pinhole geselecteerde dikte van het optische gedeelte verzameld bepalen. Een kleinere pinhole een dunnere optische gedeelte vergroten van de z-as resolutie, maar verminderen de hoeveelheid licht opgevangen produceren. Een grotere pinhole zal de dikte van de optische sectie te verhogen, waardoor z-as resolutie, maar verhogen van de hoeveelheid licht opgevangen. Bijkomende factoren om te overwegen tijdens het verzamelen van 4D gegevens voor correctie zijn: <ol><li> Optimaliseer scansnelheid te verwijderen, of te beperken, drift dijdens de vangst van een enkele keer-punt. Daarom is de tijd die de foto collectie zou een kleine fractie van het interval tussen tijdstippen zijn. </li><li> Perfect herhalende structuren of roosters, zijn niet geschikt als structuren te vullen omdat het niet mogelijk is om de vereiste correctie te bepalen. Willekeurig verdeeld kralen of ongelijke structuren zullen eenduidige registratie mogelijk te maken. </li><li> Als drift wordt verwacht, verhoogt het scangebied en de bovenste en onderste limieten aandacht om ervoor te zorgen het gebied van belang blijft in het beeld stapel. </li><li> Naast de zorg voor de nodige ruimtelijke resolutie om de structuren van belang op te lossen, stelt de sampling rate naar temporele resolutie zorgen voor de dynamische gebeurtenissen wordt bestudeerd. Opmerking: De tijd tussen het tijd-punten moet daarom ten minste de helft van de tijd-interval tussen regelmatige herhalende gebeurtenissen en neemt als gevolg van onregelmatige gebeurtenissen. </li></ol> 2. Openen van de confocale Dataset Het open source pakket Fiji is een verdeling van de ImageJ programma, dat vooraf geïnstalleerde plug-ins om talrijke processen uitvoeren op gegevens verzameld uit microscopie experimenten bevat. De software biedt eenvoudig plug-in-update architectuur en bevat een kopie van de juiste 3D drift plug-in gebruikt voor dit protocol. De software ondersteunt de import van een breed scala van eigen afbeelding microscopie formaten door het gebruik van de Open Microscopie Milieu Bio-indelingen importeren plug-in. <ol><li> Installeer de Fiji-programma (http://fiji.sc/Downloads). </li><li> Laad de verkregen dataset met behulp van de LOCI Bio-indelingen Importeur plugin. </li><li> Als de dataset is groter dan het geheugen aan het programma toegewezen, selecteert u de &quot;Use virtuele stack optie&quot; in de sectie Geheugen management. </li></ol> 3. Corrigeren Drift van een 3D-object in de nabewerking In de loop van een langere time-lapseexperimenteren een monster kan bewegen, zelfs wanneer ingesloten. Om beweging te corrigeren en om de migratie gebeurtenissen afgebeeld te analyseren, kan de nabewerking van de beelden worden uitgevoerd. Alle beeldverwerking gewerkt moet duidelijk worden beschreven in de methodologie van de analyse zijn afgeleid van dit werk. <ol><li> Zodra de dataset is geladen, voert u de juiste 3D-drift plugin. </li><li> Als er meerdere kanalen van de afbeelding, selecteert u het kanaal dat moet worden gebruikt om de beelden te registreren. Dit zou idealiter vertegenwoordigen een statische structuur binnen de steekproef in plaats van dat een trekkende of mobiele elementen. Indien dit niet mogelijk het kanaal met de minste beweging moet worden gekozen. </li><li> Als de beschikbare RAM-geheugen op de voor deze analyse systeem is minder dan twee keer de grootte van de originele dataset, selecteert u het gebruik virtuele stack optie. Dit zal de geregistreerde HyperStack te slaan als een sequentie van beelden, in plaats van het opslaan van het bestand naar RAM. <ol><li> Selecteer een map voor de plug-in om de productie individueel gecorrigeerd imaGES-bestanden. Een aparte image-bestand gemaakt voor elk kanaal bij elke z positie. </li></ol></li><li> De plug wordt dan een paarsgewijze fase correlatieanalyse tussen elk tijdpunt voeren om de gewenste correctie die vervolgens wordt aangebracht op de dataset te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Ons vermogen om post-processing software gebruiken om monster drift van datasets afkomstig van langere time-lapse microscopie experimenten corrigeren wordt beperkt door een aantal factoren. De mogelijkheid om drift onderscheiden versus migratiestroom van een monster is afhankelijk van de cellulaire merkers gebruikt. Cellulaire merkers die ofwel op grote schaal worden uitgedrukt in een monster of zijn niet betrokken in het vreemdelingenrecht gebeurtenissen tijdens beeldacquisitie bieden de beste bron voor drift correctie...

Confocale beeldvorming wordt veel gebruikt in de cel-en ontwikkelingsbiologie naar cel bewegingen en veranderingen in morfologie volgen. Vastleggen van een reeks optische secties verschillende beeldvlakken maakt het genereren van een driedimensionaal (3D) model van een monster, dat vervolgens in vier dimensies (4D) kan worden verlengd door een time-lapse reeks 3D datasets. De generatie van 4D datasets maakt gedetailleerde meting van cel bewegingen en gedragingen. In lange-termijn time-lapse experimenten is het gebruikelijk om monster beweging waarnemen. Dit kan worden veroorzaakt door kleine onnauwkeurigheden in de hardware controle podium en focale posities. Terwijl in andere gevallen drift is een gevolg van veranderingen geïnduceerd door groei monster of flexibiliteit in het monster fixeermiddelen. Methoden bestaan ​​om te compenseren of te beperken deze bewegingen, waaronder verbeteringen aan de hardware focussen systemen en verhoogde stijfheid van de montage medium. Echter, deze benadering kan niet worden vaak toegepast vanwege de beeldvormende set up nodig om geschikte omstandigheden voor de monsters onderhoud en groei. Open source software oplossingen bestaan ​​voor de correctie van de beweging in 2D in de tijd, door het gebruik van de StackReg en TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins in ImageJ of Fiji, maar deze kan niet worden toegepast 4D datasets. Om te corrigeren voor de steekproef drift hebben we een plug-in (Correct 3D drift) om de open-source imaging-processing platform, Fiji 1 voort te brengen. De plug-in kan fase correlatie registratie uit te voeren beweging die optreedt als gevolg van drift monster in driedimensionale time-lapse experimenten corrigeren. Fase correlatie 6 is een computationeel efficiënte methode om de vertaling tussen de beelden te bepalen. De plug-in beschreven gebruikt de fase-correlatie bibliotheek ontwikkeld door Preibisch et al.. 7. In multi-channel experimenten, de plug-in maakt gebruik van het ene kanaal naar determinantenne de benodigde correctie. Deze correctie wordt dan toegepast om extra kanalen waardoor registratie van de 4D dataset. In de zebravis modelsysteem is mogelijk tot time-lapse imaging gedurende vele uren of zelfs meerdere dagen 8. Een veelgebruikte methode voor het monteren van de zebravis is om de narcose levend embryo te bedden in laag smeltpunt agarose (0,8-1,5%), het beperken van de beweging 9-11. Terwijl beweging beperkt groei van het monster blijft voordoen, waardoor de cellen in het gezichtsveld verschuiven positie. Om beweging van de cellen te volgen binnen het embryo moet eerst corrigeren voor beweging van het gehele monster. Dit protocol werd ontwikkeld met zebravissen specimens, en is gebruikt om het somite ontwikkeling 12 maar kan worden toegepast op elk 4D confocale dataset.

<table><tbody><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 3 ml graduated</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9cm bacterial grade Petri dishes</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-710 Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

monster tijdafwijkingscorrectie na 4d confocal time-lapse imaging

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Het genereren van vierdimensionale (4D) confocale datasets; bestaande uit 3D-beeld reeksen in de tijd; biedt een uitstekende methode om cellulaire gedrag betrokken zijn bij ontwikkelingsprocessen te vangen. Het vermogen om te volgen en volgt celbewegingen wordt beperkt door monster bewegingen die door drift van het monster of, in sommige gevallen, groei in beeldacquisitie optreden. Tracking cellen in datasets die door drift en / of groei zal deze bewegingen op te nemen in de analyse van de cel positie. Hierdoor kan de schijnbare beweging van statische structuren in het monster. Derhalve vóór cell tracking, moet een monster drift worden gecorrigeerd. Met behulp van de open source Fiji verdeling 1 van ImageJ 2,3 en de opgenomen LOCI hulpmiddelen 4 hebben we de juiste 3D drift plug-in ontwikkeld om foutieve monster verkeer weg in confocale datasets. Dit protocol effectief compenseert proefvertaling of wijzigingen in focale poling door gebruik te maken van fase correlatie met elke keer-punt van een vier-dimensionale confocale datasets registreren met behoud van de mogelijkheid om te visualiseren en meten celbewegingen over langere time-lapse experimenten.

In de ontwikkeling van de zebravis, snel spiercellen smelten tot meerkernige vezels vanaf 19 uur na de bevruchting (20 - somiet fase) 13. Om de beweging van kernen en fusie spiercellen we uitgevoerd confocale 4D time-lapse beeldvorming met behulp van een transgene stam die groen fluorescent proteïne (GFP) tot expressie brengt onder controle van het skelet α-actine promoter om alle spier label visualiseren cellen 14 en geïnjecteerd RNA dat codeert voor het rood fluorescerend eiwit mCherry gelabeld m...

Time-lapse microscopie kan de visualisatie van ontwikkelingsprocessen. Groei of drift van monsters tijdens beeldacquisitie vermindert het vermogen om nauwkeurig te volgen en te meten cel bewegingen tijdens de ontwikkeling. We beschrijven het gebruik van open source software voor beeldverwerking om te corrigeren voor driedimensionale sample drift in de tijd.

Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

TimeLapse-microscopie maakt het mogelijk om processen van ontwikkeling, groei of drift van een monster te visualiseren die gedurende de beeldvorming optreden. Bij de acquisitie kan het voorkomen dat het niet mogelijk is om celbewegingen te volgen of te tracken; het volgende protocol beschrijft hoe we open-source beeldbewerkingssoftware gebruiken om driedimensionale drift over tijd te corrigeren.Het vastleggen van een reeks optische doorsneden op verschillende brandpuntsvlakken maakt het mogelijk om een driedimensionaal model van het monster te genereren. Dit kan worden uitgebreid naar vier dimensies door een time-lapse serie van 3D-datasets te maken. Bij langdurige time-lapse experimenten komt het vaak voor dat er beweging van het monster wordt waargenomen.Dit kan worden veroorzaakt door onnauwkeurigheden bij het verschuiven van de hardware die de tafel en brandpuntsposities aanstuurt, terwijl het in andere gevallen drift is als gevolg van bewegingen veroorzaakt door monstergroei of flexibiliteit binnen de montage-media. Er bestaan methoden om dit te compenseren en deze bewegingen te beperken, met talrijke verbeteringen aan hardwarematige focussystemen en de verhoogde stijfheid van het montagemedium. Deze benaderingen kunnen echter in veel gevallen niet worden toegepast vanwege de beeldgevingsopstelling die nodig is om geschikte omstandigheden te bieden voor het behoud en de groei van de monsters. Om monsterdrift te corrigeren, hebben we een plug-in ontwikkeld voor het open-source beeldbewerkingsplatform Fiji.Onze Correct 3D Drift-plugin is in staat om een fasecorrelatieregistratie te vormen om bewegingen te corrigeren die optreden als rol of monsterdrift in driedimensionale time-lapse experimenten in multi-channel experimenten. De Correct 3D Drift-plugin maakt gebruik van één kanaal om de benodigde correctie te bepalen. Deze correctie wordt vervolgens toegepast op alle aanvullende kanalen, wat resulteert in de registratie van de 4D-dataset.Het open-source gratis webpakket. Fiji is een distributie-fork van het ImageJ-programma, dat vooraf geïnstalleerde plug-ins bevat om talrijke processen uit te voeren op gegevens die zijn verzameld uit microscopie-experimenten. Fiji biedt een eenvoudigere plug-inarchitectuur en is inbegrepen in de standaardinstallatie.Een kopie van de juiste drie EG-plugin, die we voor deze analyse zullen gebruiken wanneer de installatie is voltooid. Open Fiji. Fiji ondersteunt de import van een breed scala aan propriëtaire microscopie-beeldformaten. Dit kan via drag-and-drop of via de gebruikersinterface van de Open Microscopy Environment.Bio-formats import-plug-in. Als de dataset groter is dan het geïnstalleerde geheugen van uw systeem, open het afbeeldingsbestand dan als een virtuele stack en gebruik een optie voor geheugenbeheer. De dataset die we in deze analyse gebruiken, is gegenereerd uit een driedimensionaal tijdserie-experiment met ACTA1-GFP transgene zebravisjes, waarbij GFP tot expressie komt in de skeletspieren.Om de kernen te visualiseren, werd deze transgene lijn geïnjecteerd met nucleo-lokaliserend M cherry. Om deze fluorescentie beter weer te geven, kunnen we de lookup-tabellen voor elk van deze kanalen wijzigen via de tool voor kleurkanalen. Gedurende de verzamelde tijdreeks lijkt het zebravismonster te zijn verschoven in het gezichtsveld. Om deze drift te corrigeren, werd de 3D-driftplugin geopend in het registratiemenu van de geïnstalleerde plugins in Fiji.Cellmarkers die ofwel breed tot expressie komen binnen een monster of niet betrokken zijn bij de markeringsgebeurtenissen tijdens de beeldacquisitie, vormen de beste bron voor driftcorrectie. In dit voorbeeld is dat ACTA, GFP-fluorescentie in kanaal één. Als het geheugen van uw systeem beperkt is, selecteer dan de optie virtuele stack en laat de plugin Correct 3D drift draaien.De gecorrigeerde dataset zal een grotere canvasgrootte hebben vergeleken met de originele, om rekening te houden met de beweging van het monster. Door maximale projectiebeelden van de optische coupes te genereren, kan de drift die uit het gecorrigeerde monster is verwijderd, worden vergeleken.De maximaalintensiteitsprojectie verwijdert de dimensie uit de dataset, maar is een nuttige benadering om snel de resultaten van de driftcorrectie te onderzoeken. Hier zien we de maximaalprojectiebeelden voor elk verbindingspunt in hun gecorrigeerde en ongecorrigeerde datasets. Wanneer dit time-lapse-experiment als één enkel beeld wordt geprojecteerd, is de hoeveelheid drift die zelfs in een kort time-lapse-experiment kan optreden duidelijk zichtbaar.De correcties die zijn aangebracht door de drift van één kanaal van uw monster te registreren, worden ook toegepast op alle andere kanalen in deze beeldstapel. De procedure voor driftcorrectie is enigszins gewijzigd als het geheugen van uw systeem beperkt is. Selecteer de optie 'used virtual stack' in zowel het menu 'File', 'Import', als in het pop-upmenu van de plugin 'Correct 3D Drift'.Wanneer u deze optie selecteert, wordt u gevraagd een locatie te kiezen waar een plug-in individuele afbeeldingsbestanden per kanaalslice en tijdstip van uw time-lapse experiment kan exporteren. De gegenereerde virtuele stack bevat dezelfde driftcorrectie als in ons vorige voorbeeld. Als we de geselecteerde opslaglocatie openen, zien we de resulterende individuele afbeeldingssequentiebestanden die zijn gegenereerd.Gebruik de tool voor het importeren van beeldsequenties om deze verzameling bestanden te openen. Het resulterende bestand zal kanalen, optische coupes of tijdspunten niet scheiden. Om deze kenmerken te visualiseren, converteert u de stack naar een hyperstack met behulp van de gegevens uit het logbestand door het aantal kanalen, optische coupes en verzamelde tijdspunten in te voeren. We kunnen vervolgens de opzoektabelen wijzigen om de weergegeven kleur van ons time-lapse-experiment aan te passen.Dit protocol corrigeert voor drift die optreedt tussen tijdspunten; drift die optreedt tijdens de acquisitie van een enkel tijdspunt kan niet met dit protocol worden gecorrigeerd. We raden aan om de parameters voor beeldacquisitie zodanig te kiezen dat de tijd die nodig is voor de vastlegging van elk tijdspunt wordt geminimaliseerd. De mogelijkheid om drift in post-processingsoftware te corrigeren, maakt het mogelijk om celbewegingen te analyseren en te meten die anders zouden worden overschaduwd door de drift van het monster.

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven de bereiding van drie monsters en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het optimaliseren en de prestatie van microscopen STORM beoordelen. Met behulp van deze voorbeelden laten we zien hoe ruwe data te verwerven en vervolgens te verwerken tot super-resolutie beelden te verwerven in cellen van ongeveer 30-50 nm resolutie.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Dit protocol beschrijft toepassingen van monsterimmobilisatie met behulp van Fibrine-stolsels, waardoor driften worden beperkt en de toevoeging en washout van reagentia tijdens live beeldvorming mogelijk is. Monsters worden overgebracht naar een druppel Fibrinogeen met kweekmedium op het oppervlak van een afdeklip, waarna polymerisatie wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine.

Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Dit werk presenteert een workflow voor het volgen van atomaire positie in atomaire resolutie transmissie elektronenmicroscopie beeldvorming. Deze workflow wordt uitgevoerd met behulp van een open-source Matlab-app (EASY-STEM).

Picometer-Precision Atomic Position Tracking door elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Leer hoe je driedimensionale monsterdrift corrigeert in tijdopnamemicroscopie met open-source software. Deze methode verbetert het volgen van celbewegingen en genereert accurate 4D-modellen voor ontwikkelingsbiologie.

Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging

Meer video's verkennen