Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging

TimeLapse Microscopie maakt een visualisatie mogelijk van de processen van ontwikkeling, groei of drift van een monster dat zich over deze afbeelding voordoet. Acquisitie kan resulteren in een onvermogen om de bewegingen van cellen te volgen of te traceren, het volgende protocol. We gebruiken open source beeldverwerkingssoftware om driedimensionale drift over tijd te corrigeren.

Het vastleggen van een reeks optische secties op verschillende focale vlakken maakt de generatie van een driedimensionaal model van het monster mogelijk. Dit kan worden uitgebreid tot vier dimensies door een tijd-lapse serie van 3D-gegevenssets te creëren. Bij langdurige time-lapse experimenten is het gebruikelijk om bewegingen van het monster waar te nemen.

Dit kan worden veroorzaakt door schuifnauwkeurigheden in de hardware die de stage en focale posities regelt, en in andere gevallen door drift als gevolg van bewegingen veroorzaakt door monstergroei of flexibiliteit binnen de montagemedia. Er bestaan methoden om deze bewegingen te compenseren om ze te beperken, met veel verbeteringen aan hardware-focussystemen en de verhoogde stijfheid van het montagemedium. Echter, deze benaderingen kunnen in veel gevallen niet worden toegepast vanwege de beeldvormingsopstelling die vereist is om geschikte omstandigheden te bieden voor het onderhoud en de groei van monsters om te corrigeren. Voor monsterdrift hebben we een plugin ontwikkeld om gebruik te maken van het open source beeldverwerkingsplatform van Fiji.

Onze correcte 3D-drift plugin is in staat om een fasecorrelatieregistratie te vormen om te corrigeren voor beweging die optreedt als een rol of monsterdrift in driedimensionale time-lapse experimenten in multi-kanaal experimenten. De correcte 3D-drift plugin gebruikt één kanaal om de vereiste correctie te bepalen. Deze correctie wordt vervolgens toegepast op eventuele aanvullende kanalen, wat resulteert in de registratie van de vier D-dataset.

Het open source gratis Web-pakket Fiji is een distributiefork van het Image J-programma, dat vooraf geïnstalleerde plugins bevat om talrijke processen uit te voeren op gegevens die zijn verzameld uit microscopie-experimenten. Fiji biedt een eenvoudiger plugin-architectuur en is standaard geïnstalleerd.

Een kopie van de correcte drie EG-plugin, die we zullen gebruiken voor deze analyse wanneer de installatie is voltooid, Open Fiji. Fiji ondersteunt de import van een groot aantal eigen microscoopbeeldformaten. Dit kan worden bereikt door middel van drag-and-drop of door de gebruikers, de Open microscopie omgeving.

Bio-formaten import-plugin. Als de dataset de grootte van het geheugen dat op uw systeem is geïnstalleerd overschrijdt, opent u het afbeeldingsbestand als een virtuele stack en een optie voor geheugenbeheer. De dataset die we zullen gebruiken in deze analyse is gegenereerd uit een driedimensionale tijdreeksexperiment van de ACTA een, GFP transgene zebravis waarin de GFP wordt uitgedrukt in de skeletspier.

Om de kernen te visualiseren, werd deze transgene lijn geïnjecteerd met de nucleo localizing M kersen om deze Fluor-vloeren beter te vertegenwoordigen, kunnen we de lookup-tabellen voor elk van deze kanalen onder het kleurenkanaalgereedschap wijzigen. In de loop van de verzamelde tijdreeks blijkt dat de ritsvis-monster in het gezichtsveld is gedrift. Ze corrigeren deze drift door de correcte 3D-drift plugin te openen in het registratie-submenu van de plugins die in Fiji zijn geïnstalleerd.

Verkopersmarkers die ofwel wijdverbreid worden uitgedrukt binnen een monster of niet betrokken zijn bij de marktgebeurtenissen tijdens de beeldacquisitie, bieden de beste bron voor driftcorrectie. In dit voorbeeld is de ACTA een, GFP-fluorescentie in kanaal een. Als het geheugen op uw systeem beperkt is, selecteert u de virtuele stack-optie en laat de correcte 3D-drift plugin draaien.

De gecorrigeerde dataset zal een grotere canvasgrootte hebben in vergelijking met de originele. Om de beweging van het monster te accommoderen. Het genereren van maximale projectie-afbeeldingen van de optische secties maakt de vergelijking mogelijk van de drift die is verwijderd uit de gecorrigeerde monster.

De maximale intensiteitsprojectie verwijdert de dimensie uit de dataset, maar is een nuttige aanpak om snel de resultaten van de driftcorrectie te bekijken. Hier zien we de maximale projectieafbeeldingen voor elk tijdspunt in hun gecorrigeerde en ongecorrigeerde datasets. Wanneer dit time-lapse experiment als een enkele afbeelding wordt geprojecteerd, is de hoeveelheid drift die kan optreden, zelfs in een korte time-lapse-experiment, duidelijk zichtbaar.

De correcties die worden gemaakt door de drift van één kanaal van uw monster te registreren, worden ook toegepast op alle andere kanalen die in deze beeldstapel zijn opgenomen. De procedure voor driftcorrectie als het geheugen op uw systeem beperkt is, wordt enigszins gewijzigd. Selecteer de gebruikte virtuele stack-optie zowel in het buy-formaat, het importmenu als in het popupmenu van de correcte 3D-drift plugin.

Wanneer u deze optie selecteert, wordt u gevraagd een locatie te selecteren waar een plugin individuele afbeeldingsbestanden kan exporteren voor elk kanaalsnede en tijdstip van uw time-lapse experiment. De gegenereerde virtuele stack bevat dezelfde driftcorrectie als ons vorige voorbeeld. Als we de geselecteerde opslaglocatie openen, zullen we de resulterende individuele beeldsequentiebestanden zien die zijn gegenereerd.

Om deze verzameling bestanden te openen, gebruikt u de gereedschap voor het importeren van beeldsequenties. Het resulterende bestand zal de kanalen, optische secties of tijdstippen niet scheiden. Om deze functies te visualiseren, converteert u de stack naar een hyperstack met behulp van de gegevens uit het logbestand, voer het aantal kanalen in, optische sneden en de tijdstippen die zijn verzameld in de, We kunnen de lookup-tabellen opnieuw wijzigen om de kleur weer te geven die wordt weergegeven van ons time-lapse experiment.

Dit protocol corrigeert voor drift die optreedt tussen tijdstippen. Drift die optreedt binnen de opname van een enkele tijdstip kan niet worden gecorrigeerd door dit protocol. We raden aan dat de parameters die worden gebruikt voor beeldacquisitie de tijd die wordt genomen om elk tijdstip te vangen, verminderen. De mogelijkheid om drift in post-processing software te corrigeren, maakt het mogelijk om celbewegingen die anders zouden worden gemaskeerd door de drift van het monster te analyseren en te meten.