Name: Geautomatiseerde Scheiding van C. elegans Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Leer hoe je Caenorhabditis elegans scheidt op basis van kolonisatie door Pseudomonas aeruginosa met behulp van een wormsorter. Deze methode helpt onderzoekers het verband tussen pathogeenherkenning en immuniteit bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de Ellison Medical Foundation voor hun steun. We willen ook de leden van de Abby Dernburg laboratorium bedanken voor hulp bij het gebruik van de wormsorter.

1. Het verkrijgen van een gesynchroniseerde Cultuur van jonge volwassen dieren <ol><li> Groeien wormen op verschillende NGM platen bezaaid met OP50-1 E. coli bacteriën (10x geconcentreerd uit een verzadigde cultuur) tot veel wormen hebben de zwangere stadium. </li><li> Behandel zwangere dieren met een ei-prep oplossing voor een gesynchroniseerde cultuur (eieren) te verkrijgen. </li><li> Plaat eieren op verschillende 60-mm NGM platen geënt met 10x geconcentreerde OP50-1 met een dichtheid van ongeveer 150-200 eieren / plaat. </li><li> Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 2 dagen (tot wormen de L4 hebben bereikt - Jong volwassen stadium). </li></ol> 2. Voorbereiden van Pseudomonas aeruginosa Platen en infecteren van Worms <ol><li> Op de dag van de ei-prep (stap 1.1) inoculeren een PA14 :: GFP cultuur in 2 ml medium B met rifampicine Koning bij een eindconcentratie van 100 ug / ml. Incubeer de kweek bij 37 ° C onder roeren O / N. </li><li> Plate de PA14 :: GFP cultuur op zoveel Langzaam Killing platen (SKP) als nodig is voor de test. Op elke 150 mm SKP petrischaal pipet 75-100 ul van verzadigde cultuur en gelijkmatig verdelen met behulp van een steriele glazen strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 20-24 uur. </li><li> Verwijder platen uit incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 min). Met behulp van M9 buffer, wassen wormen uit stap 1.4 op PA14 :: GFP platen in een minimaal volume van vloeistof. Bij het gebruik van platen van 150 mm, kan een paar honderd wormen op een enkele plaat worden geplaatst. </li><li> Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 18-21 uur. Voor P. aeruginosa-blootgestelde jonge volwassen wormen, dit is het tijdvenster de optimale verdeling van gekoloniseerde vs noncolonized dieren dat. </li></ol> 3. Het opzetten van de Wormsorter Voor het uitvoeren van de steekproef soort, ervoor zorgen dat de machine goed functioneert. Details zijn te verkrijgen op http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, en the essentiële stappen worden hieronder beschreven. <ol><li> Stel de schede ventiel druk tot ongeveer 5 psi (4.5-5.5 bereik). </li><li> Om te controleren of mantelvloeistof debiet is nodig, plaats een 15 ml conische buis onder de dispenser, zet de schede klep, en zet de sorter ventiel. Houd de buis onder de dispenser voor 60 sec. Het volume in de buis moet 9-10 ml. Als het buiten dit bereik, dienovereenkomstig aan te passen de schede klep druk. </li><li> Om ervoor te zorgen dat mantelvloeistof debiet (ingesteld als in stap 3.2) geeft accurate sortering toelaten, test het soort tarief met behulp van 40 micrometer controle deeltjes: </li><li> Schakel de schede ventiel. Voeg ongeveer 25 ml control deeltje oplossing van het reservoir. </li><li> Zet de huls ventiel en de monsterklep. </li><li> Op de computer software, navigeer naar de &quot;control deeltje mode&quot; en klik verwerven. </li><li> Zorg ervoor dat het deeltje debiet ~ 5-8 deeltjes / sec, met een TOF (Time Of Flight) benadert de breedtevan het deeltje, 40 urn. Zo&#39;n TOF geeft aan dat slechts een enkele 40 urn object passeren tegelijk. Wanneer waarden buiten dit bereik, dienovereenkomstig aan te passen de instellingen (volgende aanwijzingen hierboven). </li></ol> 4. Sortering Colonized vs Noncolonized Worms <ol><li> Met M9, wassen wormen in 15 ml conische buizen. Laat volwassen wormen te zinken naar de bodem van de buis door de zwaartekracht en verwijder het supernatant. Vul de buis met verse M9. Herhaal dit proces 3-4x. Dit verwijdert een groot deel van larven en overmaat bacteriën en duurt ongeveer 10 minuten. </li><li> Wormen toe te voegen aan de wormsorter reservoir met een zacht-mixing kleine roerstaafje. </li><li> Pas eerste signaalversterking door de Green PMT 600 en de rode en gele PMT tot 200. </li><li> Begin het verwerven van gegevens aan te passen. </li><li> Streef naar een soort snelheid van 25-30 evenementen (wormen) per sec. Indien het aantal te hoog is, verdun de wormen in het reservoir met M9 dienovereenkomstig. Als de snelheid teo laag, voeg meer wormen in een klein volume van de M9. </li><li> Als het experiment vereist een zeer strenge scheiding van gekoloniseerde vs noncolonized wormen, zet de &quot;toeval check&quot; om &quot;zuivere&quot;. Dit zorgt ervoor dat twee objecten bij te dicht bij elkaar optreden of in dezelfde druppel, de machine verwerpt de daling plaats te verzamelen. </li><li> Om de bevolking van belang te sorteren, tekenen hekken rond de assen aangeeft grootte (tot volwassen wormen te verkrijgen) en fluorescentie-intensiteit (dwz hoog voor gekoloniseerd, laag voor noncolonized). De waarden voor fluorescentie gating moet empirisch worden bepaald. </li><li> Plaats een multi-well plaat of een petrischaal onder de dispenser om wormen te verzamelen open vervolgens het soort ventiel om te beginnen met het sorteren van wormen. </li><li> Verzamel een kleine populatie van de dieren na te gaan onder de microscoop dat de gesorteerde populatie is de populatie van belang. Zo niet, stel de gating parameters dienovereenkomstig en ga verder met monstername. </li></ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li>
<li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%3A+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li>
<li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance%2C+danger%2C+and+the+extended+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li>
<li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li>
<li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li>
<li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li>
<li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li>
<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die we beschrijven maakt gebruik van TL-etikettering van entiteiten buiten de worm, om de interacties tussen de worm en zijn omgeving te volgen. In het geval dat we presenteren, werd de scheiding op basis van etikettering van een ziekteverwekker en werd gebruikt om afzonderlijke wormen met zware pathogeen last van degenen die geen (of lichte) belasting. Daaropvolgende genexpressie analyse vond geen verschil in immuunrespons tussen de twee groepen suggereren dat zij onafhankelijk van pathogenen. Het signaal da...

Automatische worm sortering is net als FACS, die door het meten van een fluorescerend signaal in een worm (die normaal door transgene expressie van reporter eiwitten) bij het passeren rechtgetrokken in een buis, waardoor omleiding hetzij naar een verzamelcentrum buis / put of een afvalcontainer volgens aan het poorten van de onderzoeker 1 set parameters. De wormsorter kan op verschillende manieren onderzoek te vergemakkelijken; een voorbeeld van het gebruik van het als een analytisch instrument is een studie die spatiotemporele promotor activiteit gevolgd voor bijna 1.000 genen 2. Echter, het belangrijkste gebruik van de wormsorter in genetische screens, na doelwitgen expressieniveaus of lokalisatie van fluorescerend eiwit langs de as van de worm 3-5. Hier beschrijven we een nieuwe applicatie voor de wormsorter, in het volgen van kolonisatie van de worm door een fluorescent gelabeld ziekteverwekker. Met dit als een instrument hebben we ons gericht op de relatie tussen Pathognl kolonisatie / lading en de immuunrespons, tot nieuwe inzichten in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de start van de immuunreacties van de worm te krijgen. In vrijwel alle tot nu toe onderzochte organismen, initiatie van de aangeboren immuunrespons op microbiële ziekteverwekkers is afhankelijk van de erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), en / of gevaar /-schade geassocieerde moleculaire patronen (dempt) 6,7. De eerste geconserveerd microbiële structuren die componenten van de microbiële celwand, het flagellum of de lipide bilaag 6 zijn, de tweede zowel model moleculen (bijv. ATP 8), veranderde eiwitten of andere merkers van veranderde cellulaire processen 9,10. Beide signalen worden herkend door eiwitten die als patroonherkenning receptoren (PRRS), die bij specifieke binding van een patroon molecuul activeert een keten van gebeurtenissen die leiden tot een beschermende respons. C. elegans is uiterst nuttig als tracta geweestble model om de verschillende aspecten van gastheer-pathogeen interacties te ontleden, maar een ding dat niet goed begrepen is hoe immuunreacties worden geïnitieerd in de worm. Geen van de vermeende receptoren die ortholoog patroonherkenning receptoren (PRRS) bij andere organismen is aangetoond PAMPs binden, en veel van de orthologen van PRRS die cruciaal voor immune responsen in andere organismen vertonen een verrassend beperkte bijdrage aan worm pathogeen reacties en weerstand. Zo is het Drosophila Toll-receptor, die essentieel zijn voor het weren grampositieve pathogenen, vertegenwoordigd C. elegans door een enkele homoloog, tol-1, die bijdraagt ​​aan bescherming tegen de Gram negatieve pathogeen Salmonella Typhimurium 11, maar niet van andere geteste Gram-negatieve of positieve pathogenen 11,12. Deze waarnemingen, gecombineerd met gegevens die aangeven immuunrespons kan worden geïnduceerd door het verstoren cellulaire eiwittranslatie hals sommigen ertoe gebracht om voor te stellen dat C. elegans detecteert voornamelijk DAMPs 9,13,14. Toch rapporten beschrijven het vermogen van dode ziekteverwekkers immuunrespons op te wekken suggereren dat PAMP bindend kunnen worden hebben een belangrijke rol in pathogeen herkenning in C. elegans 15,16. Vorige werk gericht op immuunreacties in de leeftijd gesynchroniseerde genetisch identieke C. elegans populaties aangetoond grote individuele variabiliteit in de darmflora door de bacteriële Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa. Echter, transcriptionele profiling studies behandeld deze variabel-gekoloniseerde bevolking als een entiteit 17,18. Profiteren van deze variabiliteit, een protocol gericht een geautomatiseerde wormsorter differentieel gekoloniseerde bevolking van Caenorhabditis elegans blootgesteld aan GFP-expressie P. scheiden ontwikkelden we aeruginosa. Het onderzoeken van genexpressie in verschillend-gekoloniseerde bevolking facilitated beoordeling van de relatie tussen ziekteverwekker belasting (en de bijbehorende schade) en immune reacties en nieuwe inzichten over pathogeen erkenning in C. elegans 19. Hieronder beschrijven we het protocol, die kunnen worden toegepast wormen geïnfecteerd met elk fluorescent gelabelde pathogeen sorteren. Om potentiële gebruikers moet worden opgemerkt dat het aantal wormen moet worden uitgezocht afhankelijk van de aard van de volgende analyses en gebruikte protocollen. Bijvoorbeeld, in het geval van microarray genexpressie analyse&gt; 1000 wormen zullen moeten voldoende RNA verkrijgen als standaard protocollen worden gebruikt, maar ~ 100 wormen volstaat als versterking wordt toegepast, waardoor een snelle verzameling van materiaal en dus spanning te minimaliseren de wormen.

<table><tbody><tr><td>M9 Buffer</td><td>zelf gemaakt</td><td></td><td>Recept op wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ei prep oplossing</td><td>zelf gemaakt</td><td></td><td>50 ml water; 40 ml bleekmiddel; 10 ml van 10 N natriumhydroxide</td></tr><tr><td>NGM platen</td><td>zelf gemaakt</td><td></td><td>Recept op wormbook.org</td></tr><tr><td>SKP platen</td><td>zelf gemaakt</td><td></td><td>Recept hetzelfde als NGM, alleen 0,35% pepton in plaats van 0,25%</td></tr><tr><td>Controle testdeeltjes</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde scheiding van<em&gt; c. elegans</em&gt; variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

De wormsorter is een instrument analoog aan een FACS machine die wordt gebruikt in studies van Caenorhabditis elegans, doorgaans naar wormen basis van expressie van een reporter fluorescent sorteren. Hier hebben we aandacht voor een alternatief gebruik van dit instrument, voor het sorteren wormen volgens hun mate van kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker. Dit nieuwe gebruik konden we de relatie tussen kolonisatie van de darm worm en inductie van immuunresponsen pakken. Terwijl C. elegans immuunrespons op verschillende pathogenen zijn gedocumenteerd, is nog onbekend wat hen initieert. De twee belangrijkste mogelijkheden (die elkaar niet uitsluiten) zijn erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, en detectie van schade veroorzaakt door een infectie. Om onderscheid te maken tussen de twee mogelijkheden, moet de blootstelling aan de ziekteverwekker worden gezien van de schade die ze toebrengen. De wormsorter ingeschakeld scheiding van wormen die werden uitgebreid-gekoloniseerd door de Gram-negatief pathogeen Pseudomonas aeruginosa, met de schade die wordt veroorzaakt door pathogenen, van wormen die op soortgelijke wijze zijn blootgesteld, maar niet of marginaal, gekoloniseerd. Deze verschillende populaties werden gebruikt om het verband tussen pathogenen en de inductie van transcriptionele immuunresponsen beoordelen. De resultaten suggereren dat de twee worden gescheiden, ondersteunen de mogelijkheid van pathogeen herkenning.

Wanneer leeftijd afgestemd, genetisch identiek C. elegans worden blootgesteld aan P. aeruginosa, is wijd verspreid waargenomen niveaus van kolonisatie (figuur 1A). Met behulp van de hier beschreven efficiënte scheiding van noncolonized uit gekoloniseerde wormen worden bereikt (figuur 1B) protocol. In tegenstelling tot noncolonized wormen, gekoloniseerd wormen vertonen tekenen van schade, zoals traagheid en verminderde ontlasting 19. Dit laatste kan een reden...

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Geautomatiseerde Scheiding van<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de bijdragen van kolonisatie en de daarmee gepaard gaande schade aan de initiatie van aangeboren immuunresponsen in C. elegans te beoordelen. Dit wordt bereikt door een gesynchroniseerde populatie jonge volwassen C. elegans bloot te stellen aan Pseudomonas aeruginosa die groen fluorescent eiwit of GFP tot expressie brengt, wat resulteert in een populatie wormen die in variabele mate door de pathogeen is gekoloniseerd. Na het wassen worden de differentieel gekoloniseerde populaties wormen gescheiden in zuivere populaties, waarbij de focus ligt op de twee extremen: volledig gekoloniseerde en niet-gekoloniseerde wormen.Vervolgens wordt RNA geëxtraheerd uit deze populaties en wordt de expressie van immuungenen geëvalueerd in vergelijking met wormen die zijn gekweekt op niet-pathogene e coli. Om de relatie tussen de immuunrespons en kolonisatie te onderzoeken, worden resultaten verkregen die aantonen dat de aangeboren immuunrespons van sea elegance op p arosa kan worden losgekoppeld van de kolonisatie door pathogenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere benaderingen voor het bestuderen van de initiatie

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Taylor, M. N., et.al. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the exposure of germ-free, age-matched Caenorhabditis elegans worms to a bacterial strain for intestinal colonization. It explains the selective removal of non-adhered and external bacteria, leaving only viable bacteria adhered to the gut epithelium for quantification.

Evaluating Intestinal Bacterial Colonization in Germ-Free C. elegans

Source: Petersen, C. et. al., Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the isolation and cultivation of bacterial species associated with Caenorhabditis elegans. A bead-based lysis of C. elegans, followed by selective culturing, enables the isolation of diverse microbial strains for further analysis.

Isolation and Cultivation of Caenorhabditis elegans-Associated Bacteria

Source: Chen, Y., et al. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a survival assay using C. elegans to model Aeromonas pathogenesis, where oral ingestion of the bacteria leads to intestinal infection and mortality, enabling quantitative assessment of bacterial virulence in a live host system.

Modeling Aeromonas Pathogenesis in C. elegans Using a Survival Assay

Source: Le, T. A. N., et al., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a fluorescence-based assay to quantify intestinal permeability in C. elegans exposed to Pseudomonas aeruginosa. Compared to controls fed Escherichia coli, pathogen-treated worms show increased fluorophore leakage into the body cavity, indicating epithelial barrier damage.

Assessment of Intestinal Permeability in C. elegans Following Bacterial Exposure

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Leer hoe je Caenorhabditis elegans scheidt op basis van kolonisatie door Pseudomonas aeruginosa met behulp van een wormsorter. Deze methode helpt onderzoekers het verband tussen pathogeenherkenning en immuniteit bestuderen.

Geautomatiseerde Scheiding van

Meer video's verkennen