Geautomatiseerde Scheiding van C. elegans Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de bijdragen van kolonisatie en de bijbehorende schade aan de initiatie van aangeboren immuunresponsen bij zee-elegans te beoordelen. Dit wordt bereikt door een gesynchroniseerde populatie jonge volwassen zee-elegans bloot te stellen aan pseudomonas arosa die groen fluorescent eiwit of GFP uitdrukt, wat een populatie wormen produceert die variabel gekoloniseerd is door de ziekteverwekker. Na het wassen worden de gedifferentieel gekoloniseerde wormenpopulaties gescheiden in zuivere populaties, waarbij de focus ligt op de twee uitersten van volledig gekoloniseerde en niet-gekoloniseerde wormen.

Vervolgens wordt RNA uit deze populaties geëxtraheerd en wordt de expressie van immuungenen geëvalueerd in vergelijking met wormen die zijn gekweekt op niet-pathogene e coli. Om de relatie tussen de immuunrespons en kolonisatie te onderzoeken, worden resultaten verkregen die aantonen dat de aangeboren immuunrespons van zee-elegans tegen p arosa kan worden losgekoppeld van kolonisatie door de ziekteverwekker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere benaderingen voor het bestuderen van de initiatie van immuunresponsen in zee-elegans is dat het de variabiliteit in infectie in warme populaties aanpakt, waardoor we verschillende aspecten van het infectieproces kunnen onderscheiden.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over zee-elegans, aangeboren immuniteit, zoals wat de basis is voor de initiatie van aangeboren immuunresponsen en op een hoog doorvoerende manier. Wat is de impact van verschillende genetische of omgevingsmanipulaties op het vermogen om kolonisatie door ziekteverwekkers te weerstaan? Om te beginnen, kweek wormen op verschillende nematode, groeimedium of NGM platen gezaaid met e coli bacteriën totdat veel wormen de grave fase hebben bereikt.

Behandel vervolgens grave dieren met een eiervoorbereidingsoplossing om een gesynchroniseerde cultuur te verkrijgen. Plaats de eieren vervolgens op verschillende 60 millimeter NGM platen gezaaid met bacteriën met een dichtheid van ongeveer 150 tot 200 eieren per plaat.

Er zullen minimaal 15 tot 20 platen nodig zijn om enkele duizenden wormen te verkrijgen. Voor het sorteerexperiment moeten gebruikers opschalen door platen met een grotere diameter te gebruiken met meer eieren per plaat als er meer wormen nodig zijn. Incubeer de platen gedurende twee dagen op 20 graden Celsius totdat wormen de L vier of jonge volwassen fase hebben bereikt.

Op de volgende dag van de eiervoorbereiding, inoculeer een GFP-expresserende POSA-cultuur, PA 14 GFP, in twee milliliter kings B.Medium dat antibioticum bevat. Incubeer de cultuur gedurende de nacht bij 37 graden Celsius met agitatie. Plaats de volgende dag de PA 14 GFP-cultuur op zoveel langzame dodelijke platen als nodig is voor de assay op elke 150 millimeter Petri-schaal.

Pipetter 75 tot 100 microliters van een verzadigde cultuur en verspreid gelijkmatig. Gebruik een steriele glazen verspreider en incubeer de platen gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius. Verwijder de platen met PA 14 GFP uit de incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.

Ondertussen, om de wormen die op NGM platen zijn gekweekt te verzamelen, voeg een kleine hoeveelheid M negen buffer toe, genoeg om de plaat te bedekken. Zwaai voorzichtig met de plaat en breng het vloeibaar over in een 15 milliliter conische buis. Laat de wormen naar de bodem zakken en verwijder overtollig vocht voordat je de wormen overbrengt naar PA 14 GFP platen. Met een minimaal volume vloeistof, wanneer je 150 millimeter platen gebruikt, kunnen enkele honderden wormen op een enkele plaat worden geplaatst.

Incubeer de platen gedurende 18 tot 21 uur bij 25 graden Celsius voor p arosa-blootstelling van jonge volwassen wormen. Dit is het tijdsvenster dat de optimale verdeling van gekoloniseerde versus niet-gekoloniseerde dieren weergeeft voordat de monstersortering wordt uitgevoerd. Zorg ervoor dat de machine goed functioneert. Essentiële stappen worden hier geschetst en details kunnen online worden verkregen.

Stel de druk van de hulsklep in op ongeveer vijf PSI om te verifiëren dat de hulsvloeistofstroomsnelheid geschikt is. Plaats een 15 milliliter conische buis onder de dispenser. Schakel de hulsklep in en schakel de sorterklep uit.

Houd de buis gedurende 60 seconden onder de dispenser. Het volume in de buis moet negen tot 10 milliliter zijn. Als het buiten dit bereik ligt.

Pas de druk van de hulsklep dienovereenkomstig aan om ervoor te zorgen dat de hulsvloeistofstroomsnelheid een nauwkeurige sortering mogelijk maakt. Test de sorteersnelheid door eerst de hulsklep uit te schakelen. Voeg vervolgens ongeveer 25 milliliter controle-deeltjesoplossing toe aan het reservoir.

Schakel de hulsklep en de monstersoortklep in de computersoftware in. Navigeer naar de controle-deeltjesmodus en klik op verwerven. Zorg ervoor dat de deeltjesstroomsnelheid ongeveer vijf tot acht deeltjes per seconde is met een vluchttijd die de breedte van het 40 micrometer deeltje benadert.

Dit zorgt ervoor dat er tegelijkertijd slechts één 40 micron object doorheen gaat. Als de waarden buiten dit bereik liggen, pas dan de instellingen dienovereenkomstig aan. Gebruik M negen buffer om wormen in 15 milliliter conische buizen te wassen, laat volwassen wormen door zwaartekracht naar de bodem van de buis zinken en verwijder het supernatant.

Vul de buis met verse M negen buffer. Herhaal dit proces drie tot vier keer. Dit verwijdert een groot deel van de larven, evenals overtollig bacteriën en duurt ongeveer 10 minuten.

Voeg wormen toe aan het wormensorteerreservoir dat een zacht roerende kleine roerder bevat. Pas de initiële signaalversterking aan door de groene fotomultiplierbuis in te stellen op 600 en de rode en gele fotomultiplierbuis op 200. Begin met het verzamelen van gegevens om de instellingen aan te passen.

Strijd naar een sorteersnelheid van 25 tot