Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring
23 januari 2014
We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om het genoom van herpes simplex virus, type één te detecteren in secties van trigeminal ganglia van latent geïnfecteerde muizen door middel van fluorescente in situ hybridisatie. Dit wordt bereikt door eerst het virus in de lip van het dier te inoculeren, gevolgd door een incubatieperiode van 28 dagen waarin het virus zich in de trigeminal ganglia vestigt. Vervolgens worden de trigeminal ganglia geoogst, ingebed en cryo-gesneden.
De secties worden onderworpen aan verschillende voorbereidende behandelingen, inclusief de belangrijke stap van het verwarmen in een natriumcitraatbuffer. Uiteindelijk wordt fluorescente in situ hybridisatie uitgevoerd met behulp van herpes specifieke fluorescente kleurstoffen. Uiteindelijk kunnen de resultaten de positionering van het virale genoom in de kern van individueel geïnfecteerde neuronen laten zien door middel van confocale microscopie.
In veel gevallen vereist de studie van een diverse levenscyclus het gebruik van diermodellen. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde techniek is dat het gegevens op enkelcellig niveau biedt door gebruik te maken van een fluorescentie-aanpak. Het royal killer model van HS infecties reproduceert de meeste aspecten van de natuurlijke geschiedenis van HSV één infectie bij mensen.
Dat is de natuurlijke gastheer van het virus. De primaire infectie wordt gemaakt in de orale weefsels, en vervolgens verspreidt het virus zich van de lippen naar het tweede al ganglion. Dat is de belangrijkste plaats van HS V latentie bij mensen. Gecombineerd twee immuno en kleuring.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de latentie van herpesvirus, zoals hoe het virus interactie heeft met nucleaire componenten, en hoe deze interacties de instandhouding van latentie en uiteindelijke reactivatie van het virus zouden kunnen beïnvloeden. Om te beginnen, heb een verdovingsmiddel muis en een HSV één virus stockoplossing. Opnieuw gesuspendeerd in fenol rood vrij medium.
Gebruik een binoculaire stereoscoop om de naald in de subepitheliale laag van de bovenste linkerlip in te brengen bij de mucocutane grens. Injecteer 0,5 microliters van virusoplossing gedurende vijf seconden, en maak vervolgens een tweede injectie van virus op dezelfde plaats. Breng de muis over in een 37 graden Celsius incubator of verwarmingsmat totdat hij ontwaakt.
Plaats het vervolgens in zijn eigen kooi voor de vereiste hersteltijd voordat je het volgens het tekstprotocol fixeert. Snijd aan elke kant van de onderkaak. Snijd vervolgens de punt van de neus net achter de snijtanden om de neusholte te onthullen.
Snijd het gehemelte doormidden met een schaar, en plaats het vervolgens opzij. De trigeminal ganglia bevinden zich onder het gehemelte. Het zijn witte langwerpige massa's, twee tot drie millimeter lang en zijn verbonden met de trigeminal zenuw.
Snijd de takken van de trigeminal zenuw aan elke kant van de ganglia om ze los te maken van de hersenstam. Gebruik chirurgische tang om de ganglia te verwijderen en breng ze over naar 20% Sucrose in PBS en laat ze 24 uur incuberen. Bij kamertemperatuur bedden je de volgende dag beide trigeminal ganglia in een enkele blok cryosectie.
Inbeddingsmedium, vries de blok bij minus 80 graden Celsius totdat het op een cryostaat wordt gesneden. Snijd de trigeminal ganglia in de lengterichting in 10 micron secties en verzamel ze op super frost dia's opgewarmd tot 30 graden Celsius. Vier tot vijf secties passen op een enkele dia.
Het geven van meerdere reekslabels aan de dia kan nuttig zijn. Als er meerdere downstream toepassingen gepland zijn, laat de plakjes vijf tot tien minuten drogen voordat je ze bewaart bij minus 80 graden Celsius. Voor dit protocol wordt de sonde voorbereid door het labelen van cosms bevattende 30 kilobase delen van het HSV één genoom met SI 3D CTP door NIC translatie.
Het wordt geprecipiteerd en opgehangen in gedeïoniseerd formaat amide en zou roze moeten lijken vanwege SSi drie incorporatie op dag een. Plaats de dia's op een diahouder bij kamertemperatuur en laat de secties 10 minuten drogen. Hydrateer vervolgens de secties in één XPBS gedurende 10 minuten.
Perme de weefsel vervolgens in 0,5% Triton X 100 in één XPBS gedurende 20 minuten. Was vervolgens de dia's drie keer gedurende 10 minuten per wassing met twee XSS en bewaar ze in twee XSSC totdat de unmasking buffer is verwarmd. Voor unmasking verwarm je de citraat buffer in een magnetron totdat de buffer kookt.
Dit wordt gedaan door een glazen dialade te vullen met 200 milliliter van de buffer. Plaats de lade in een grotere container gevuld met 500 milliliter gedistilleerd water en verwarm de buffer tot kookpunt. Breng vervolgens de dia's over naar de lade.
Controleer of ze volledig bedekt zijn met buffer in de magnetron. Verwarm de dia's in de buffer gedurende ongeveer 20 seconden totdat de buffer kookt. Laat de buffer niet overkoken.
Koel vervolgens de dia's af bij kamertemperatuur gedurende twee minuten en herhaal de verwarmingscyclus nog zes keer. Het is cruciaal om empirisch het aantal en de duur van de verwarmingscycli te bepalen voor de reproduceerbaarheid van de unmasking stap. De magnetron, de lade, de container, het volume van de buffer in de lade.
Het volume van het water in de container moet identiek worden gehouden wanneer het verwarmen is voltooid. Breng de dia's over naar twee XSSC gedurende vijf minuten onder een afzuigkap, en incubeer de dia's in een drie tot één tot vier oplossing van methanol, azijnzuur en PBS gedurende 15 minuten. Incubeer vervolgens de dia's in een vers bereide drie tot één methanol naar azijnzuur mix gedurende 15 minuten.
Dehydrateer de secties nu door middel van opeenvolgende 10 minuten incubaties in 70% ethanol, gevolgd door twee 10 minuten incubaties in pure ethanol. Laat de dia's op kamertemperatuur gedurende 10 minuten drogen om ze voor te bereiden op de sonde. Breng 80 microliters van de sonde oplossing druppelsgewijs aan op de gedroogde secties en bedek ze met een dekglas.
Controleer of de sonde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een fluorescent in situ hybridisatieprotocol dat is ontworpen om het herpes simplex virus type één genoom in trigeminusganglia secties van latent geïnfecteerde muizen te detecteren. De methode maakt de visualisatie van het virale genoom en zijn RNA producten binnen individuele neuronen mogelijk, wat inzichten biedt in het infectieproces.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Virologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Herpes simplex virus type één kan latentie in de trigeminusganglia vestigen.
- Het begrijpen van de positionering van het virale genoom is cruciaal voor het bestuderen van zijn infectiemechanismen.
- Fluorescent in situ hybridisatie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van nucleïnezuren in weefselsecties.
- Confocale microscopie maakt gedetailleerde beeldvorming van individuele cellen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het detecteren van het herpes simplex virus genoom in weefselsecties.
- Om het virale genoom en zijn RNA producten in geïnfecteerde neuronen te visualiseren.
- Om het begrip van het infectieproces op cellulair niveau te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van het virus in de dierenlip.
- 28-daagse incubatieperiode voor virusvestiging in trigeminusganglia.
- Oogsten, inbedding en cryo sectie van trigeminusganglia.
- Fluorescent in situ hybridisatie met behulp van herpes-specifieke fluorescente sondes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van het herpes simplex virus genoom in weefselsecties.
- Visualisatie van de positionering van het virale genoom binnen de kern van geïnfecteerde neuronen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode door middel van confocale microscopie.
- Inzichten in het infectieproces op enkel-celniveau.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het bestuderen van herpes simplex virus latentie.
- Fluorescent in situ hybridisatie biedt waardevolle informatie over virale infectiedynamiek.
- Deze methode kan worden toegepast op andere virale studies in de neurowetenschap.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables single-cell detection of persistent viral genomes in neuronal tissues, addressing a critical gap in virology research where low-copy viral reservoirs are difficult to visualize. By combining DNA-FISH with RNA-FISH and immunostaining, it provides mechanistic insights into virus-host interactions that inform target validation and antiviral screening strategies. The approach supports preclinical de-risking by clarifying viral latency mechanisms in relevant animal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral genome positioning relative to nuclear components to assess mechanisms of latency maintenance.
- Scientific Value: Supports functional validation of viral and host targets by co-detecting genomes, transcripts, and proteins in individual neurons.
- Scientific Value: Facilitates hypothesis testing about viral reactivation triggers through spatial correlation of viral and cellular signals.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Produces low-background, high-resolution signals compatible with confocal and wide-field microscopy for reliable readouts.
- Operational Value: Works with both custom and commercially available probes, enabling assay flexibility and reagent standardization.
- Operational Value: Accommodates a wide range of antibodies, supporting multiplexed screening of viral and cellular markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses a clinically relevant HSV-1 latency model in mice that mirrors human neuronal infection patterns.
- Translational Value: Enables longitudinal assessment of viral reservoir dynamics in tissues, informing predictive confidence in reactivation risk.
- Translational Value: Supports biomarker discovery by linking viral genome localization to cellular regulatory proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for neurotropic viruses where tissue-specific reservoir analysis is essential.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing how viral genomes interact with nuclear architecture during latency.
- Screening: Generates quantitative spatial data on viral genome copies per cell, enabling compound effect assessment in infection models.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (DNA, RNA, protein) that allow correlation of viral gene expression with host responses.
- Translational Research: Connects findings in rodent ganglia to human-relevant neuropathogenesis, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other persistent DNA viruses and tissue types, promoting platform reuse across virology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral persistence studies through direct visualization of viral nucleic acids.
- Operational Value: Enables reproducible tissue processing with heat-based unmasking that works across antibody and probe types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying reservoir biology that influences reactivation-driven pathogenesis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on latency-relevant mechanism data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, tissue sectioning, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to cryostat, hybridization oven, and confocal or wide-field fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of unmasking cycles and probe concentration across labs for consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to new tissue types may require optimization of permeabilization and antigen retrieval steps.
- Protocol duration of 2.5 days necessitates batch processing planning for high-throughput applications.
