Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van het genoom van herpes simplex virus type 1 in coupes van trigeminusganglia van latent geïnfecteerde muizen middels fluorescentie in situ hybridisatie. Dit wordt bereikt door eerst het virus in de lip van het dier te inoculeren, gevolgd door een incubatieperiode van 28 dagen waarin het virus zich vestigt in de trigeminusganglia. Vervolgens worden de trigeminusganglia geoogst, ingebed en cryogesneden.

De coupes worden onderworpen aan verschillende voorbehandelingen, waaronder de cruciale stap van het verhitten in een natriumcitraatbuffer. Vervolgens wordt fluorescentie-in-situ-hybridisatie uitgevoerd met gebruik van herpes-specifieke fluorescente probes. Uiteindelijk kan de positionering van het virale genoom in de kern van individueel geïnfecteerde neuronen worden aangetoond middels confocale microscopie.

In veel gevallen vereist de studie van diverse levenscycli het gebruik van diermodellen. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde techniek is dat deze gegevens op single-cell niveau biedt met behulp van een in situ fluidisatiebenadering. Het konijnmodel voor HS-infecties reproduceert de meeste aspecten van het natuurlijke verloop van een HSV-1 infectie bij mensen.

Dit is de natuurlijke gastheer van het virus. De primaire infectie vindt plaats in het mondweefsel, waarna het virus zich van de lippen naar het ganglion trigeminale verplaatst. Dit is de belangrijkste locatie van HSV-latentie bij mensen. Gecombineerde immuno- en kleuring.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de latentie van het herpesvirus, zoals de wijze waarop het virus interacteert met nucleaire componenten en hoe deze interacties de instandhouding van de latentie en uiteindelijk de reactivatie van het virus beïnvloeden. Begin met een geanestheseerde muis en een HSV-1 virusstamoplossing, resuspenderd in fenolroodvrij medium.

Breng met behulp van een binoculair stereomicroscoop de naald in de subepitheliale laag van de linker bovenlip ter hoogte van de mucocutane overgang. Injecteer gedurende vijf seconden 0,5 µL virusoplossing en voer vervolgens een tweede injectie van het virus uit op dezelfde plek. Plaats de muis in een incubator van 37 °C of op een warmtemat tot deze is ontwaakt.

Plaats het dier vervolgens in de thuiskooi voor de vereiste hersteltijd voordat het volgens het tekstprotocol wordt geperfuseerd en gefixeerd. Maak een incisie aan elke zijde van de onderkaak. Snijd vervolgens de neuspunt vlak achter de snijtanden door om de neusholte vrij te leggen.

Knip het gehemelte met een schaar doormidden en leg dit vervolgens opzij. De trigeminale ganglia bevinden zich onder het gehemelte. Het zijn witte, langwerpige massa's van twee tot drie millimeter lang die verbonden zijn met de nervus trigeminus.

Snij de takken van de nervus trigeminus aan beide zijden van de ganglia door om ze los te maken van de hersenstam. Verwijder de ganglia met een chirurgische pincet en breng ze over in 20% Sucrose in PBS; laat ze 24 uur incuberen. Bed bij kamertemperatuur de volgende dag beide ganglia trigeminae in één enkel cryosectieblok.

Bevries het inbeddingsmedium met het blok op minus 80 °C tot het moment van insnijden in een cryostaat. Snijd de nervus trigeminalis in de lengte in secties van 10 micron en vang deze op SuperFrost-objectglazen die zijn voorverwarmd tot 30 °C. Vier tot vijf secties passen op één objectglas.

Het is nuttig om de slide meerdere serielabels te geven. Als er meerdere downstream-applicaties zijn gepland, laat de coupes dan vijf tot 10 minuten drogen voordat ze worden bewaard bij minus 80 graden Celsius. Voor dit protocol wordt de probe geprepareerd door cosmids die stukken van 30 kilobase van het HSV 1-genoom bevatten, te labelen met SI 3D CTP via NIC-translatie.

Het wordt neergeslagen en gesuspendeerd in gedeïoniseerd formamide en moet op dag één roze verschijnen als gevolg van de incorporatie van S SI drie. Plaats de coupes op een couphouder bij kamertemperatuur en laat de secties 10 minuten drogen. Rehydrateer de secties vervolgens in 1x PBS gedurende 10 minuten.

Permeabiliseer vervolgens het weefsel gedurende 20 minuten in 0,5% Triton X 100 in 1x PBS. Was de coupes daarna drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt met 2x SSC en bewaar ze in 2x SSC tot de onmaskeringsbuffer is opgewarmd. Verwarm de citraatbuffer voor het onmaskeren voor in een magnetron tot de buffer kookt.

Dit wordt gedaan door een glazen objectglaasjesbak te vullen met 200 milliliters van de buffer. Plaats de bak in een grotere houder gevuld met 500 milliliters gedestilleerd water en verwarm de buffer voor tot het kookpunt. Verplaats vervolgens de objectglaasjes naar de bak.

Controleer of ze in de magnetron volledig zijn bedekt met buffer. Verhit de coupes in de buffer gedurende ongeveer 20 seconden totdat de buffer kookt. Voorkom dat de buffer overstroomt.

Koel de slides vervolgens twee minuten af bij kamertemperatuur en herhaal de verhittingscyclus nog zes keer. Het is essentieel om het aantal en de duur van de verhittingscycli empirisch te bepalen voor de reproduceerbaarheid van de onmaskingsstap. De magnetron, de tray, de houder, het volume buffer in de tray.

Het watervolume in de container moet identiek blijven wanneer het verwarmen is voltooid. Plaats de objectglazen gedurende vijf minuten in XSSC onder een zuurkast en incubeer de objectglazen vervolgens 15 minuten in een oplossing van methanol, azijnzuur en PBS in een verhouding van drie op één op vier. Incubeer de objectglazen daarna 15 minuten in een vers bereid mengsel van methanol en azijnzuur in een verhouding van drie op één.

Dehydrateer de coupes nu door opeenvolgende incubaties van 10 minuten in 70% ethanol, gevolgd door twee incubaties van 10 minuten in pure ethanol. Laat de preparaten 10 minuten drogen bij kamertemperatuur ter voorbereiding op de probe. Breng 80 µL probe-oplossing druppelsgewijs aan op de gedroogde coupes en dek deze af met een dekglas.

Controleer of de hybridisatie-oplossing over het gehele oppervlak van het dekglas is verspreid en of er geen luchtbellen aanwezig zijn. Seal het dekglas vervolgens met rubbercement en laat dit drogen. Ga verder met de denaturatie door de preparaten vijf minuten lang te incuberen bij 80 °C.

Breng de objectglazen vervolgens snel over naar een metalen plateau op ijs voor vijf minuten. Volg dit de volgende dag met een hybridisatie gedurende de nacht bij 37 °C. Verwijder de rubberlijm met een pincet terwijl de objectglazen zich op een warmteblok van 37 °C bevinden.

Verwijder voorzichtig het dekglas met de punt van een scalpelmesje. Was vervolgens de coupes herhaaldelijk met SSC. Kleur de monsters nu gedurende 10 minuten met de passende kleurstof, zoals DAPI of hooks 3 3 3 4 2, in een concentratie van 0,5 micrograms per milliliter in 1X PBS.

Was de objectglazen vervolgens drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Giet na de derde wasbeurt zoveel mogelijk vloeistof van het objectglas af. Breng vervolgens aan het uiteinde van elk objectglas 80 µL montagemedium met een anti-fade middel aan.

Dek het medium langzaam af met een dekglas van hoge optische kwaliteit, waarbij luchtbellen worden vermeden. Verzegel vervolgens het objectglas met nagellak en bewaar het donker bij vier graden Celsius. Bij de ontwikkeling van dit protocol zijn verschillende zoutbuffers getest voor het ontmaskeren.

Terwijl EDTA-buffers het weefsel hadden de neiging te beschadigen, waren natriumcitraat-tris, HCl en gedestilleerd water geschikt voor de detectie van HSV-1 om te verifiëren dat het protocol zou werken met commerciële probes. De detectie van het latente HSV-1-genoom werd uitgevoerd met een biotinylated PAN HSV-1-probe verkregen van Enzo Biochem, waarbij zowel enkelvoudige als meervoudige spot-patronen voor het HSV-1-genoom konden worden gedetecteerd.

Verder is het DNA-FISH-protocol getest op muizen en konijnen die waren geïnfecteerd met drie veelgebruikte HSV-1-stammen. In alle gevallen vertoonden de HSV-1-genomen een gespikkeld signaal met variabele helderheid en intensiteit. Daarnaast is de toepasbaarheid van het protocol getest in de replicatieve cyclus van HSV-1 door DNA-FISH uit te voeren op weefsels van muizen met een gegeneraliseerde herpesinfectie.

Bij deze dieren werden grote en heldere aggregaten van HSV-1-genomen gedetecteerd in verschillende weefsels, waaronder de DRG, ogen en hersenen. Het DNA-FISH-protocol is zeer veelzijdig. Het maakt de gelijktijdige detectie van het HSV-1-genoom en virale of cellulaire RNA's en eiwitten mogelijk.

Bijvoorbeeld is de co-detectie van het HSV-1 genoom samen met het HSV-1 lat-RNA haalbaar; co-detectie van het HSV-1 genoom met cellulaire eiwitten zoals het centromeer-eiwit CENP-A werd benut; co-detectie van HSV-1 met het chromatine en de PML-kernlichaampjes. Het geassocieerde eiwit ATRX werd gevisualiseerd met een drievoudige kleuring waarbij HSV-1 DNA in rood, het RNA-product lat in blauw en ATRX in groen werden weergegeven.

Zodra het ontmaskeringsproces is opgezet, is de DNA-FISH-procedure zeer robuust. Deze kan in minder dan 24 uur worden uitgevoerd in batches van 20 slides of meer. De ontwikkeling van deze techniek stelt onderzoekers die herpesvirussen en andere persistente virussen bestuderen in staat om op single-cell niveau te onderzoeken hoe cellulaire componenten en de nucleaire architectuur de biologie van deze virussen kunnen beïnvloeden.