Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van post-translationele modificaties van eiwitten die betrokken zijn bij plantaardige eiwitcomplexen, nadat het eiwit van interesse tijdelijk of stabiel is tot expressie gebracht in planten met de bijbehorende tags. Extraheer vervolgens de totale eiwitten uit het planteweefsel en voer een immunoprecipitatie uit van het eiwit van interesse. Scheid daarna de geïmmunoprecipiteerde eiwitten op een acrylamidegel en extraheer en verteer de eiwitten uit de betreffende gelband.

Dien nu de eiwitmonsters in voor massaspectrometrie. Uiteindelijk kunnen de resultaten van massaspectrometrie dynamische veranderingen in post-translationele modificaties, zoals fosforylering, detecteren. In tegenstelling tot alternatieve methoden, zoals de in vitro incubatie van kinase met substraat, worden eiwitten bij deze methode tot expressie gebracht in de plant.

U hoeft dus niet te weten welke kinase verantwoordelijk is voor de fosforylering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de plantenbiologie, zoals de wijze waarop signalen worden overgebracht als reactie op stress, omgevingsveranderingen of de herkenning van pathogenen. Naast de identificatie van fosforyleringsplaatsen van geactiveerde resistentie-eiwitcomplexen, kan deze methode breed worden toegepast op elke post-translationele modificatie van elk planteneiwitcomplex.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat ze niet gewend zijn om met grote hoeveelheden extract te werken en meer stappen van het protocol op één dag uit te voeren. Kweek voor transiënte expressie de agrobacterium tohin-stammen tot de stationaire fase. Oogst de agrobacteriën door centrifugatie bij 3000 Gs gedurende vijf minuten.

Resuspendeer de pellets in infiltratiebuffer. Infiltreer nu vier weken oude NCOA hamana-planten handmatig met agrobacteriën met behulp van een naaldloze spuit van 1 mL of via vacuüm met 0,02% surfactant, twee tot vijf dagen na infiltratie.

Oogst de geïnfiltreerde bladeren, vries deze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 graden Celsius. Vermaal vervolgens 20 gram plantweefsel en vloeibare stikstof met een vijzel en stamper, waarbij 80 milliliter koude buffer C wordt toegevoegd aan de 20 gram. Meng goed en ontdooi op ijs.

Homogeniseer nu met drie pulsen van elk 10 seconden op volle snelheid. Filtreer het homogenisaat en centrifugeer dit 30 minuten bij 30,000 Gs bij vier graden Celsius. Voeg ondertussen aan 100 µL van een geschikte affiniteitsmatrix 500 µL koude blokkeringsbuffer D toe voor vijf minuten bij vier graden Celsius en was dit drie keer met 1 mL koude buffer D. Verwijder vervolgens het supernatant van het bladextract en leid dit door een spuitfilter van 0,45 µm.

Filter in een nieuwe buis op ijs. Verdeel het ruwe extract in aliquoten. Voor een immunoblot.

Voeg vijf XSDS paginalaadbuffer toe, vortex en kook de monsters om ze te denatureren. Voeg 50 µL van de affiniteitsmatrix, gesuspendeerd in buffer D, toe aan elke buis. Incubeer gedurende twee uur bij 4 °C onder zachte rotatie en centrifugeer om de affiniteitsmatrix te pelletteren.

Neem vervolgens een aliquot van het ongebonden extract voor een immunoblot. Verwijder de rest hiervan, waarbij ongeveer 500 µL op de bodem van de buis achterblijft. Resuspendeer de slurry-oplossing met een wide bore tip.

Voeg de gemengde slurry-oplossing uit beide buisjes samen in één enkel buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer drie keer gedurende vijf seconden met een benchtop-centrifuge om de affiniteitsmatrix neer te slaan en verwijder het supernatant na drie tot vijf wasbeurten met één milliliter koud buffer D. Verwijder het overtollige buffer D met een spuitnaald en elueer met 200 microliters van de juiste elutiebuffer onder constant schudden. Voeg de drie EIT's samen in één enkel buisje.

Concentreer vervolgens de eiwitten door 30 µL absorptiehars te vortexen. Laat dit vijf minuten staan en centrifugeer de hars om deze neer te slaan; verwijder daarna het supernatant. Voeg 50 µL van een 1X SDS-PAGE-laadbuffer toe aan de neergeslagen affiniteitsmatrix of absorptiehars en kook dit gedurende 10 minuten bij 80 tot 100 °C in een heatblock-centrifuge.

Kook de affiniteitsmatrix-hars gedurende twee minuten bij 10.000 g. Neem een aliquot van vijf µL van het supernatant voor immunoblokkering en breng deze, samen met de andere fracties, aan op een 10 cm lange SDS-PAGE-gel voor scheiding en identificatie van gefosforyleerde eiwitten via massaspectrometrie.

Laad de resterende 45 µL op een SDS-PAGE-gel. Kleur de SDS-PAGE-gel met colloidal Coomassie Brilliant Blue. Ontkleur de gel vervolgens door uitgebreid te wassen met water, bij voorkeur gedurende de nacht.

Snijd nu met een schoon scalpel de band van belang uit de gel, snijd het gelfragment in blokjes van twee tot vier millimeter en breng het monster over naar een buisje. Was de gelstukjes met 50% acetonitril en 50 millimol ammoniumbicarbonaat tot ze ontkleurd zijn. Pipetteer vervolgens de oplossing af.

Zorg ervoor dat er geen gelstukjes worden verwijderd. Dehydrateer het monster gedurende vijf minuten met 100% aceto nitrile en verwijder de vrije vloeistof. Voeg vervolgens 10 millimolar DTT toe om de proteïne-disulfidebruggen te reduceren en incubeer dit 30 tot 45 minuten bij 56 °C onder schudding; verwijder daarna de vrije vloeistof om de cysteïneresten te alkyleren.

Voeg 55 millimolair chloroacetamide toe gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de vrije vloeistof en was de gelstukjes vervolgens tweemaal met 50% acetonitril gedurende 10 minuten. Verwijder de vrije vloeistof.

Dehydrateer nu de gelstukjes gedurende vijf minuten met 100% acetonitril en verwijder het overtollige vloeistof voor de Triptych Digest. Voeg 40 µL trypsin-werkoplossing toe en laat de gelstukjes 10 minuten rehydrateren in voldoende digestiebuffer om de gelstukjes te bedekken. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C; om de digestie te stoppen en de peptiden uit de gelstukjes te extraheren, wordt er 5% mierenzuur toegevoegd en wordt er gedurende vijf tot 10 minuten gesoniceerd.

Overbreng vervolgens het supernatant naar een nieuwe buis, droog de peptiden door lyofilisatie of met een vacuümconcentrator, en bewaar de monsters bij -20 °C. Dit experiment zuivert het P-R-F-P-T-O kinase-complex uit nacoa hamana. Een transgene NACOA hamana die 35 SPTO tot expressie bracht, werd transient getransformeerd met 35 SPRF flag, en het complex werd geïmmunoprecipiteerd met Anti-Flag M twee aros. De immunoblots illustreren een efficiënte immunoprecipitatie van het doeleiwit PRF, waarbij zowel PTO als het interagerende effector-eiwit samen met PRF werden gezuiverd, zoals aangegeven door antilichaamdetectie en massaspectrometrie-analyse.

Hier was de strategie om het PTO-eiwit te targeten met Anti-Flag. De strategie is gewijzigd om de fosforyleringsplaatsen van PTO te identificeren.

De totale hoeveelheid PTO-eiwit, bestaande uit zowel het PRF-complex als de vrije vorm, werd geïmmunoprecipiteerd met Anti-Flag M2-beads en onderworpen aan SDS-PAGE-fractionering, in-gel trypsinedigestie en massaspectrometrische analyse, wat resulteerde in PTO-peptiden die ongeveer 80% van de sequentie besloegen. Interessant is dat er een reeks enkelvoudige fosforyleringsplaatsen voor PTO-peptiden werd geïdentificeerd. Merk op dat dubbele fosforyleringsplaatsen alleen werden geïdentificeerd in de aanwezigheid van een van de effector-eiwitten.

Het is belangrijk om voldoende hoeveelheden planteneiwit te verkrijgen om componenten van een eiwitcomplex te kunnen identificeren en om post-translationele modificaties van een eiwit van belang te detecteren. Houd er rekening mee dat het in kaart brengen van modificaties zoals fosforylering een redelijke hoeveelheid eiwit vereist voor massaspectrometrie, waardoor er na deze procedure in ieder geval een zwakke band op uw gel zichtbaar moet zijn. Andere methoden, zoals de identificatie van complexcomponenten, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de activering van immuuncomplexen leidt tot functionele immuniteit.

Vergeet niet dat het werken met organische buffers, bacteriën en BBL-scheermesjes uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en laboratoriumjassen.