Name: Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Verken temperatuurvoorkeursgedrag en circadiane ritmes in Drosophila met deze methode. Onderzoekers kunnen nieuwe mechanismen van biologische klokken identificeren die onafhankelijk werken van locomotorische activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Drs. Aravinthan Samuel en Marc Gershow dankbaar die hebben geholpen bij het ontwikkelen van de eerste versie van het gedragsapparaat en Matthew Batie die het gedragsapparaat heeft aangepast. Dit onderzoek werd ondersteund door Trustee Grant van Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes en NIH R01 GM107582 aan F.N.H.

1. Voorbereiding van vliegen
<ol><li>Licht donker (LD) Experimenten
	<ol>
<li>Verhoog vliegen in incubators (25 °C/40-60% relatieve vochtigheid (RH)) bij lichte cycli van 12 uur/donker 12 uur (LD). De lichtintensiteit van de incubators is ~500-1.000 lux.</li>
		<li>Twee incubators zijn nodig om de gedragstesten over een periode van 24 uur te voltooien. Beide incubators moeten een programmeerbaar licht hebben met ON OFF-functies. Ze moeten ook solide deuren hebben die niet doorlatend zijn voor licht(d.w.z. geen glas of plexiglas). Opmerking: Een incubator moet worden aangeduid als een "dag"-incubator en worden ingesteld op een LD-cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. De tweede incubator moet worden aangeduid als een "nacht"-incubator en worden ingesteld op de inverse van de eerste met 12 uur donker gevolgd door 12 uur licht. De nachtincubator moet in de kamer worden geplaatst die in het donker toegankelijk is, op een zodanige manier dat vliegen die nachtomstandigheden ervaren gemakkelijk toegankelijk zijn voor de experimenten.</li>
		<li>Plaats de vliegenflacons in couveuses overdag of 's nachts. Verzamel nieuw uitgekomen vliegen in een verse flacon, 20-30 per test en bewaar 2-3 dagen in dezelfde incubator.</li>
		<li>Gebruik na 2-3 dagen vliegen voor de gedragstest van de temperatuurvoorkeur.<ol>
<li>Verzamel voor dag (Zeitgeber tijd (ZT) 0-12) experimenten vliegen uit de dag incubator.</li>
			<li>Vlak voor de gedragsexperimenten, haal de verzamelde vliegenflacons uit de dagincubator.</li>
			<li>Verzamel voor nachtelijke (ZT 13-24) experimenten vliegen uit de nachtincubator.</li>
			<li>Vlak voor de gedragsexperimenten, haal de verzamelde vliegenflacons uit de nachtincubator, wikkel met aluminiumfolie en plaats in een doos in de donkere kamer onder een rode lamp. Opmerking: Aangezien de gedragstest van de temperatuurvoorkeur onder duisternis wordt uitgevoerd voor de nachtexperimenten, moet blootstelling aan licht aan de vliegen worden voorkomen tot het einde van de gedragsexperimenten. Opmerking: De vliegen mogen niet worden blootgesteld aan kooldioxide op de dag dat de experimenten plaatsvinden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Constant Darkness (DD) Experimenten
	<ol>
<li>
DD-dag
		<ol>
<li>Een extra incubator is nodig voor DD-dagexperimenten, die we voor de rest van het manuscript een "transitie"-incubator noemen. De overgangsincubator moet in de ruimte worden geplaatst die in het donker toegankelijk is, op een zodanige manier dat vliegen die DD-omstandigheden ervaren gemakkelijk toegankelijk zijn voor de experimenten. Een voorbeeld lichtschema voor een overgangsincubator zou het licht aan hebben van 13.00-19.00 uur en het licht UIT om 19.00-13.00 uur (figuur 1).</li>
			<li>Verzamel de vliegen die zijn grootgebracht in de dagincubator. Plaats de vliegenflacons tussen 13.00 en 19.00 uur in de overgangsincubator, wanneer het licht aan is. Op deze manier worden de vliegen goed blootgesteld aan licht tot 19.00 uur, waarna het licht wordt uitgeschakeld.</li>
			<li>Haal de volgende dag, voor 13.00 uur, onder donkere omstandigheden de vliegenflacons uit de overgangsincubator, wikkel ze in aluminiumfolie en plaats ze in een doos. Bewaar de doos nog een dag in een incubator.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
DD Nacht
		<ol>
<li>Verzamel de vliegen die in de nachtincubator in het donker onder een rode lamp zijn grootgebracht. Of verzamel bovendien de vliegen wanneer het licht van de nachtincubator aan is.</li>
			<li>Wikkel verzamelde flacons met aluminiumfolie in het donker wanneer de lichten uit zijn en plaats de flacons in een doos. Bewaar de doos nog twee dagen in een incubator (figuur 1B). Opmerking: Aangezien de gedragstest van de temperatuurvoorkeur onder duisternis wordt uitgevoerd voor de nachtexperimenten, moet blootstelling aan licht aan de vliegen worden voorkomen tot het einde van de gedragsexperimenten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Constant Licht (LL) Experimenten
	<ol>
<li>
LL-dag
		<ol>
<li>Een extra incubator is nodig voor LL-dagexperimenten. Deze incubator behoudt de LL conditie (25 °C, 800 lux), waarbij het licht continu aan staat.</li>
			<li>Verzamel vliegen die zijn grootgebracht in de dagincubator. Plaats de vliegenflacons op elk moment van hun "dag" in de LL-incubator.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
LL Nacht
		<ol>
<li>Verzamel vliegen die zijn grootgebracht in de nachtincubator. Breng de vliegenflacons over van de nachtincubator naar de LL-incubator gedurende de tijd dat het licht in de nachtincubator aan is. Opmerking: Het licht gaat bijvoorbeeld uit om 07:00 uur in de nachtincubator. Breng de vliegenflacons voor 07.00 uur over van de nachtincubator naar de LL-incubator en bewaar de flacons nog 4 dagen in de LL-incubator. Opmerking: Op dag 4 in LL-omstandigheden wordt de oscillatie van de motorische activiteit afgeschaft15,16, terwijl de TPR nog steeds wordt gehandhaafd 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Het apparaat voor de gedragstest van de temperatuurvoorkeur
<ol><li>Plaats een plexiglas hoes (29 cm x 19,2 cm) (figuur 4) op een aluminium plaat.</li>
	<li>Controleer de luchttemperatuur tussen de plaat en het deksel. Zes temperatuursensoren zijn bevestigd op verschillende posities aan de binnenkant van het deksel binnen een van de rijstroken (figuur 2). Opmerking: Zorg ervoor dat de sondes de aluminium plaat of de plexiglasafdekking niet raken. De luchttemperatuur moet worden ingesteld op een helling van 18-32 °C.</li>
	<li>Plaats het apparaat in een omgevingsruimte die op 25 °C/65-75% RV staat. Deze kamer moet worden afgesloten van buitenlicht. Een omgevingsruimte is normaal gesproken uitgerust met ventilatoren om een bepaalde temperatuur en vochtigheid te behouden. Opmerking: De lucht van de ventilator verstoort waarschijnlijk een stabiele temperatuurgradiënt op het apparaat. Om dit te voorkomen gebruiken we een transparant vel dat het gebied rondom het apparaat bedekt.</li>
	<li>Bereid een thermometer en hygrometer voor om de temperatuur en vochtigheid in de omgevingsruimte te controleren. Opmerking: Licht beïnvloedt de temperatuurvoorkeur van Drosophila3. Dezelfde lichtintensiteit moet gelijkmatig op het apparaat worden geleverd. De intensiteit van onze omgeving kamer lichten is ~ 800 lux. Opmerking: Wanneer de gedragsexperimenten zijn uitgevoerd, plaatst u een buis die is aangesloten op de CO2-tank of toevoer in de buurt van het gat van de bovenkant van het apparaat om de vliegen te verdoven en te verwijderen.</li>
</ol>3. Bereiding van apparaten voor gebruik
<ol><li>Schakel het apparaat minstens 30 minuten in om de temperatuurgradiënt op het oppervlak van de plaat goed vast te stellen (afbeelding 3).</li>
	<li>Bedek de hoes van het gedragsapparaat met waterafstotend om te voorkomen dat vliegen de muren of het plafond van de hoes beklimmen. Veeg het overtollige waterafstotende middel af en laat het deksel 25-30 minuten drogen.</li>
	<li>Verwijder condensatie op de aluminium plaat. Plaats het plexiglas deksel op de aluminium plaat en zet deze vast met zes C-klemmen (Afbeelding 2). Opmerking: Het is erg belangrijk dat de hoes goed is afgesloten, indien nodig kan dubbele plakband worden gebruikt.</li>
	<li>Laat het deksel minstens 15 minuten staan. De luchttemperatuurgradiënt tussen de aluminium plaat en de afdekking wordt gemaakt van 18-32 °C.</li>
</ol>4. Temperatuur voorkeur gedrag Assay
<ol><li>Laad de vliegen in de ruimte tussen de aluminium plaat en de plexiglasafdekking van het apparaat door kleine gaatjes in het midden van elke rijstrook van de afdekking (figuren 2 en 4). Bedek de gaten met afdekslips om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen.</li>
	<li>Doe voor de donkere omstandigheden alle lichten in de omgevingsruimte uit. Een rode lamp kan worden gebruikt wanneer de vliegen in het apparaat worden geplaatst. Zorg ervoor dat de vliegen niet worden blootgesteld aan lichten behalve een rode lamp totdat de gedragsexperimenten zijn gedaan.</li>
	<li>Gebruik voor elke proef 20-25 volwassen vliegen, die niet opnieuw mogen worden gebruikt in volgende proeven. De gedragstest wordt gedurende 30 minuten uitgevoerd. Maak een paar foto's met of zonder flits. Pas op dat u tijdens de experimenten niet veel lawaai of plotselinge bewegingen maakt.</li>
	<li>Noteer de temperatuur van alle zes sondes op het apparaat. Let op de kamertemperatuur en de luchtvochtigheid.</li>
	<li>Verdoof de vliegen in het apparaat met kooldioxidegas, maak de klemmen los, verwijder het plexiglasdeksel en verwijder de vliegen van de plaat. Na elk experiment worden de vliegen weggegooid. Veeg condensatie of vocht van de plaat. Plaats het deksel op de plaat terug en draai het vast met de klemmen ter voorbereiding op het volgende experiment.</li>
	<li>Om de temperatuurvoorkeur gedurende de hele dag te kunnen aangeven, is de periode van 24 uur verdeeld in acht tijdzones, vier overdag en vier 's nachts. We gebruiken bijvoorbeeld deze ZT of CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 en 22-24. Opmerking: Aangezien fenotypevariaties veroorzaakt door maskeringseffecten worden verwacht direct nadat het licht is ingeschakeld (ZT0) of UIT (ZT12), onderzoeken we het temperatuurvoorkeursgedrag tijdens deze tijden niet (ZT of CT 0-1, 11.5-13 en 23.5-24). In elke tijdzone moeten ten minste vijf proeven worden uitgevoerd om de resultaten statistisch gezond te laten zijn.</li>
</ol>5. Gegevensanalyse
<ol><li>Bereken de temperatuurgradiënt als volgt: Bepaal waar de temperatuursensoren worden geplaatst op basis van de twee linialen die aan de boven- en onderkant van het plexiglas deksel langs de randen worden geplaatst (Figuur 2A).</li>
	<li>De temperatuurgradiënt tussen de temperatuursensoren wordt geschat op lineair. Teken lijnen die elke temperatuurgraad in de juiste positie op de foto's weergeven op basis van de locaties van de temperatuursondes en de bijbehorende geregistreerde temperaturen. Tel het aantal vliegen in elk graadinterval. Sluit vliegen op de muren of het plafond van de hoes uit.</li>
	<li>Bereken het percentage vliegen in elk temperatuurbereik van elke rijstrook. Een gemiddelde voorkeurstemperatuur wordt berekend door de producten van het percentage vliegen en temperatuur van elk interval op te sommen, zoals hieronder weergegeven: % vliegen x 18,5 °C + % vliegen x 19,5 °C + % vliegen x 20,5 °C ....+ % vliegen x 31,5 °C + % vliegen x 32,5 °C.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde voorkeurstemperatuur in elke tijdzone: Het voorkeursgedrag van de temperatuur wordt >5 keer uitgevoerd in elke tijdzone (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 en 22-24). Om de gemiddelde voorkeurstemperatuur in elke tijdzone te berekenen, wordt de gemiddelde voorkeurstemperatuur van elke proef samen gemiddeld. De s.e.m. foutbalken zijn gelijk aan de fout tussen de proeven.</li>
</ol>

<ol><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li>
<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li>
<li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li>
<li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila.%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li>
<li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Thermal+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Therm.+Biol%22%5BJournal%5D)">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li>
<li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li>
<li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+rhythm+of+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li>
<li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li>
<li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li>
<li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li>
<li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li>
</ol>

Er valt niets te onthullen.

Hier illustreren we de details van het temperatuurvoorkeursgedragsapparaat en de analyse van het TPR-gedrag. Drosophila vertoont de opvallende, robuuste en reproduceerbare kenmerken van klokgestuurde TPR. Onze gegevens suggereren echter dat ten minste twee factoren, omgevingslicht en leeftijd, de TPR-gedragsfenotypes aanzienlijk verstoren.
We merken op dat licht de temperatuurvoorkeur bij Drosophilaaanzienlijk beïnvloedt. Het is consistent met het feit dat w1118-vlie...

Temperatuur is een alomtegenwoordige omgevingsinvloed. Dieren vertonen een verscheidenheid aan gedragingen om schadelijke temperaturen te voorkomen en comfortabele te zoeken. Drosophila vertonen een robuust temperatuurvoorkeursgedrag6,7. Wanneer vliegen worden vrijgegeven in een temperatuurgradiënt van 18-32 °C, vermijden de vliegen zowel warme als koude temperaturen en kiezen ze uiteindelijk een voorkeurstemperatuur van 25 °C in de ochtend3. De warme temperatuursensoren zijn een set thermosensorische neuronen, AC-neuronen, die het Drosophila transient receptor potential (TPR)-kanaal uitdrukken, TRPA16,9. De koude temperatuursensoren bevinden zich in de 3e antennesegmenten, omdat het ablating van de 3e antennesegmenten het gebrek aan koude temperatuurvermijdingveroorzaakt 6. Onlangs werd het TRPP-eiwit Brivido (Brv) geïdentificeerd10. Aangezien Brv wordt uitgedrukt in de 3e antennesegmenten en koudedetectie bemiddelt, is Brv een mogelijk kouddetectiemolecuul, dat van cruciaal belang is voor het temperatuurvoorkeursgedrag. Kortom, de vliegen gebruiken deze twee temperatuursensoren om de warme en koude temperaturen te vermijden en een voorkeurstemperatuur te vinden.
Terwijl zoogdieren warmte genereren om hun lichaamstemperatuur te reguleren, passen ectothermen hun lichaamstemperatuur over het algemeen aan de omgevingstemperatuuraan 11. Van sommige ectothermen is bekend dat ze een dagelijks TPR-gedrag vertonen waarvan wordt aangenomen dat het een strategie is voor de ectothermen om hun BTR12te reguleren . Om te bepalen of de vliegen TPR vertoonden, herhaalden we de gedragsanalyse van de temperatuurvoorkeur op verschillende punten gedurende een periode van 24 uur. We ontdekten dat Drosophila een dagelijkse TPR vertoont, die 's ochtends laag en 's avonds hoog is en een patroon volgt dat vergelijkbaar is met dat van BTR bij mensen13.
In Drosophilazijn er ~150 klokneuronen in de hersenen. De klokneuronen die de motorische activiteit reguleren, worden M- en E-oscillatoren genoemd. Interessant is echter dat M- en E-oscillatoren TPR niet reguleren, in plaats daarvan hebben we laten zien dat DN2-klokneuronen in de hersenen TPR reguleren, maar geen motorische activiteit. Deze gegevens geven aan dat TPR onafhankelijk van de motorische activiteit wordt gereguleerd. Met name zoogdier BTR is ook onafhankelijk gereguleerd van motorische activiteit. Ablatiestudies bij ratten tonen aan dat BTR wordt gecontroleerd door specifieke SCN-neuronen die zich richten op een andere subset van subparaventriculaire zoneneuronen dan die welke de motorische activiteit controleren14. Daarom beschouwen onze gegevens de mogelijkheid dat de BTR van zoogdieren en de vlieg TPR evolutionair worden geconserveerd3, omdat zowel vlieg-TPR als zoogdier BTR circadiaanse klokafhankelijke temperatuurritmes vertonen, die onafhankelijk worden gereguleerd door motorische activiteit.
Hier beschrijven we de details van het analyseren van de TPR-gedragstest in Drosophila. Deze methode maakt het mogelijk om niet alleen het moleculaire mechanisme en neurale circuits van TPR te onderzoeken, maar ook hoe de hersenen verschillende omgevingssignalen en innerlijke biologische klokken integreren.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>Rood licht voor donkere kamers</td></tr><tr><td>Rain X</td><td>SOPUS-producten</td><td></td><td>Waterafstotend: Breng aan op het plexiglas</td></tr><tr><td>C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatuur/hygrometer</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Peltier-apparaten</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>Fluke 52II</td><td></td></tr><tr><td>Bench top controller</td><td>Oven Industries</td><td>5R6-570-15R en 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuursensor sonde</td><td>Oven Industries</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>Generieke 480 Watt ATX voeding</td><td></td><td></td><td>computerkoelsysteem</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator met reservoir</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computerkoelsysteem</td></tr><tr><td>MCP350 In-Line 12V DC pomp</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computerkoelsysteem</td></tr><tr><td>MCW50 graphicskaart vloeistofkoeler</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computerkoelsysteem</td></tr><tr><td>Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH ventilator</td><td>Crazy PC</td><td></td><td>computerkoelsysteem</td></tr></tbody></table>

ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

De circadiane klok reguleert vele aspecten van het leven, waaronder slaap, motorische activiteit en lichaamstemperatuur (BTR) ritmes1,2. We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output geïdentificeerd, genaamd het temperatuurvoorkeursritme (TPR), waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt 3. Verrassend genoeg worden de TPR en motorische activiteit gecontroleerd door verschillende circadiane neuronen3. Drosophila locomotorische activiteit is een bekende circadiane gedragsoutput en heeft sterke bijdragen geleverd aan de ontdekking van veel geconserveerde circadiaanse circadiaanse klokgenen en mechanismen van zoogdieren4. Daarom zal het begrijpen van TPR leiden tot de identificatie van tot nu toe onbekende moleculaire en cellulaire circadiane mechanismen. Hier beschrijven we hoe u de TPR-test uitvoert en analyseert. Deze techniek maakt het niet alleen mogelijk om de moleculaire en neurale mechanismen van TPR te ontleden, maar biedt ook nieuwe inzichten in de fundamentele mechanismen van de hersenfuncties die verschillende omgevingssignalen integreren en diergedrag reguleren. Bovendien suggereren onze onlangs gepubliceerde gegevens dat de vlieg TPR functies deelt met de zoogdier BTR3. Drosophila zijn ectothermen, waarbij de lichaamstemperatuur meestal gedragsmatig wordt gereguleerd. Daarom is TPR een strategie die wordt gebruikt om een ritmische lichaamstemperatuur te genereren bij deze vliegen5-8. Wij zijn van mening dat verdere verkenning van Drosophila TPR de karakterisering van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beheersing van de lichaamstemperatuur bij dieren zal vergemakkelijken.

Een voorbeeld van het temperatuurvoorkeursritme is weergegeven in figuur 5. Als de gedragsprocedure met succes wordt uitgevoerd, moeten de vliegen een TPR vertonen waarin ze de voorkeur geven aan een lage temperatuur in de ochtend en een hogere temperatuur in de avond. De ~1-1,5 °C toename overdag in temperatuurvoorkeur moet in de loop van de dag worden waargenomen, ongeacht de genetische achtergrond, omdat we hebben laten zien dat w1118, yw en Kanton S vliegen overd...

We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output, temperatuurvoorkeursritme (TPR) geïdentificeerd, waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt. TPR wordt onafhankelijk van een andere circadiane output, motorische activiteit gereguleerd. Hier beschrijven we het ontwerp en de analyse van TPR in Drosophila.

Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Het algemene doel van deze procedure is om de temperatuurvoorkeur van drosophila te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de vliegen en de apparatus voor te bereiden, welke is opgebouwd rond een temperatuurgecontroleerde aluminium basis. Zodra de temperaturen in de apparatus zijn ingesteld, wordt een cohort vliegen geplaatst en na een half uur wordt hun temperatuurvoorkeur gescoord.Uiteindelijk kan de assay voor een grote verscheidenheid aan experimentele condities worden gebruikt. Denk bijvoorbeeld aan circadiane ritmes van temperatuurvoorkeur. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van doelritmes.Aangezien deze doelgerichte ritmes van temperatuurvoorkeur via andere mechanismen worden aangestuurd dan die van de locomotieactiviteit, zal deze gedragsassay leiden tot de identificatie van nieuwe moleculaire en cellulaire mechanismen die eerder niet waren vastgesteld met benaderingen op basis van locomotieactiviteit. Deze methode kan ook helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de sensorische neurowetenschappen, zoals temperatuur- en pijnperceptie. Omdat deze assays voor temperatuurgedrag zeer robuust zijn, stelt deze assa

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes...

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila</em

Drosophila-fruitvliegen kunnen kleine temperatuurveranderingen onderscheiden en daarom omgevingen met gunstige thermische omstandigheden selecteren. Deze video beschrijft een gedragstest die de temperatuurvoorkeur van Drosophila-larven test op een lineaire thermische gradiënt.

Temperatuurgradiënttest: een methode om de temperatuurvoorkeur bij Drosophila-larven te testen

Deze video beschrijft het Drosophila activity monitor (DAM) systeem dat wordt gebruikt om de motorische activiteit te volgen. Onderzoekers gebruiken activiteitsgegevens verzameld van de DAM om circadiaanse ritmes bij fruitvliegen te bestuderen. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u vliegen in het apparaat laadt en activiteitsgegevens opneemt voor circadiane experimenten.

Drosophila Activity Monitor (DAM): een methode om de motorische activiteit bij vliegen te meten

Hier beschrijven we een licht-donker voorkeur test voor Drosophila larven. Deze test geeft informatie over aangeboren en circadiane regulatie van licht sensing en verwerken photobehavior.

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

De voeding circuit in Drosophila melanogaster larven serveert een eenvoudige maar krachtige model waarmee veranderingen in de voeding koers die moet worden gecorreleerd met veranderingen in de stomatogastric neurale circuits. Dit circuit bestaat uit centrale serotonerge neuronen die uitsteeksels aan de mond haken en de voordarm sturen.

Functionele analyse van de larvenvraat Circuit in Drosophila</i

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Hier presenteren we een protocol om automatisch te bepalen door de motorische prestaties van Drosophila op het veranderen van temperatuur met behulp van een programmeerbare temperatuurgevoelig arena die snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert.

Een automatische methode om te bepalen van de prestaties van Drosophila in antwoord op temperatuurveranderingen in ruimte en tijd

Hier beschrijven we hoe we Drosophila kunnen synchroniseren met een circadiane dag. Dit is de eerste en belangrijkste stap die nodig is voor het bestuderen van biologische ritmes en chronobiologie.

Circadiane Entrainment van Drosophila Melanogaster

Insecten hebben een optimaal omgevingstemperatuurbereik waar ze binnen willen blijven, en veel externe en interne factoren kunnen deze voorkeur veranderen. Hier beschrijven we een kosteneffectieve en eenvoudige methode om temperatuurkeuze te bestuderen, waardoor insecten vrijelijk hun natuurlijke gedrag kunnen vertonen.

Bepaling van de temperatuurvoorkeur van muggen en andere ectothermen

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Verken temperatuurvoorkeursgedrag en circadiane ritmes in Drosophila met deze methode. Onderzoekers kunnen nieuwe mechanismen van biologische klokken identificeren die onafhankelijk werken van locomotorische activiteit.

Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila

Meer video's verkennen