Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila
13 januari 2014
We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output, temperatuurvoorkeursritme (TPR) geïdentificeerd, waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt. TPR wordt onafhankelijk van een andere circadiane output, motorische activiteit gereguleerd. Hier beschrijven we het ontwerp en de analyse van TPR in Drosophila.
Het algemene doel van deze procedure is om de temperatuurvoorkeur van drosophila te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de vliegen en het apparaat voor te bereiden, dat is geassembleerd rond een temperatuurgeregeld aluminium bodem. Zodra de temperaturen in het apparaat zijn vastgesteld, wordt een cohort vliegen erin geladen en na een half uur wordt hun temperatuurvoorkeur geregistreerd.
Uiteindelijk kan de test worden gebruikt onder een grote verscheidenheid aan experimentele omstandigheden. Bijvoorbeeld, circadiane ritmen van temperatuurvoorkeur. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het veld van doelritmen te beantwoorden.
Aangezien deze doelritmen van temperatuurvoorkeur worden beheerst door andere mechanismen dan die van de locomotieve activiteit, zal deze gedragstest leiden tot de identificatie van nieuwe moleculaire en cellulaire mechanismen die niet eerder zijn geïdentificeerd met behulp van locomotieve activiteitsbenaderingen. Deze methode kan ook helpen om belangrijke vragen in het veld van de sensorische neurowetenschap te beantwoorden, zoals temperatuur en pijnsensaties. Omdat deze temperatuurgedragstests erg robuust zijn, zal deze test ons in staat stellen om de neurale circuit van temperatuurdetectie tot verwerking in kaart te brengen, wat ons meer inzicht zal geven in de sensorische integratie.
Laat de vliegen groeien in bevochtigde incubators met een 1212 lichtdonkercyclus. Dit protocol vereist twee dergelijke incubators die op tegengestelde schema's zijn ingesteld. De nachtincubator moet donker zijn tijdens normale werkuren.
Wanneer u een incubator tijdens zijn nachtcyclus betreedt, gebruik dan rood licht om de incubator te verlichten. Verzamel cohorten van 20 tot 30 nieuw uitgekomen vliegen van beide geslachten en in elke verhouding, houd ze twee tot drie dagen in hun incubator voordat u ze in de test laat draaien. Voor elke geteste omstandigheid zijn ten minste vijf cohorten vereist.
Om een temperatuurvoorkeurtestkamer te bouwen, moet een plexiglasdeksel worden ontworpen om op een aluminium plaat onder de plaat te passen. Plaats vier peltier-apparaten. Elk van de peltier-apparaten moet worden aangesloten op temperatuurregelaars die koude of hete temperaturen kunnen genereren om te voorkomen dat de pelters oververhit raken.
Een computerkoelingssysteem is aangesloten op waterbuizen, luchtkoelventilatoren en voedingen om de temperaturen op de aluminium plaat te monitoren. Temperatuursensoren zijn ingebed in de rand van de aluminium plaat en zijn aangesloten op temperatuurregelaars. Stel de koude en warme kanten van de plaat in de cover respectievelijk in op 12 en 36 graden Celsius.
Bevestig zes temperatuursensoren op verschillende posities binnen één van de banen. Plaats het apparaat in een omgevingsgestuurde kamer bij 25 graden Celsius en tussen 65 en 75% relatieve vochtigheid. Zorg ervoor dat u deze omstandigheden monitort.
De kamer moet lichtcontrole en goede luchtcirculatie hebben om te voorkomen dat omringende lucht de temperatuur destabiliseert. Bescherm het testgebied met een douchegordijn. Uniform licht moet worden gebruikt op het apparaat omdat luminositeit de temperatuurvoorkeur kan beïnvloeden.
Schakel het apparaat minimaal 30 minuten in. Om een stabiele temperatuurgradiënt op het oppervlak van de plaat te vestigen. Bekleed het deksel van het gedragsapparaat met een waterafstotend middel om te voorkomen dat de vliegen de wanden of het plafond van het deksel beklimmen.
Wisch het overtollige waterafstotende middel af en laat het deksel 25 tot 30 minuten drogen indien nodig, dubbelzijdig plakband mag een half uur later worden gebruikt. Veeg eventuele condens van de aluminium plaat. Plaats vervolgens het plexiglasdeksel op de aluminium plaat en zet vast met zes C-klemmen.
Het is zeer belangrijk dat het deksel is afgedicht. Monitor de luchttemperatuur tussen de plaat en het deksel. Zorg ervoor dat de sensoren noch de aluminium plaat noch het plexiglasdeksel raken.
Laat het deksel minimaal 15 minuten op de plaat gelijkmatig verdelen. Uiteindelijk zal de luchttemperatuurgradiënt tussen de aluminium plaat en het deksel variëren van 18 tot 32 graden Celsius. In het geval van een daggedragsexperiment, haal de vliegbuizen uit de dagincubator en test het gedragsonderzoek in het licht onmiddellijk voor een nachtgedragsexperiment. Haal de vliegbuizen uit de nachtincubator.
Wickel ze in aluminiumfolie en plaats ze in een doos in de donkere kamer onder een rode lamp. Voor experimenten tijdens donkere perioden moeten de kamerlichten altijd uitblijven totdat de gedragsexperimenten zijn voltooid. Rode lampen kunnen echter worden gebruikt voor verlichting met behulp van aspiratie.
Laad 20 tot 25 vliegen in de ruimte tussen de aluminium plaat. Bedek vervolgens de gaten met deksels om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen. Laat de vliegen 30 minuten rondlopen.
Wanneer het experiment is voltooid, neem ten minste twee foto's voor de lichtexperimenten. Voor de donkere experimenten moet een flitser worden gebruikt. Controleer de temperatuur van het apparaat.
Noteer de kamertemperatuur evenals de vochtigheid om de vliegen te verwijderen. Verbind de buis met koolstofdioxide nabij het gat bovenop het apparaat om de vliegen te anesthetiseren, gooi de vliegen weg. Ze mogen niet opnieuw worden getest. Veeg vervolgens eventuele condens of vocht van de plaat.
Plaats het deksel terug op de plaat en zet vast met de klemmen ter voorbereiding voor het volgende experiment. Bereken de temperatuurgradiënt als volgt. Bepaal eerst waar de temperatuursensoren zijn geplaatst met behulp van een liniaal op basis van de sensorlocaties en hun geregistreerde temperaturen. Trek rechte lijnen die elk graad temperatuur voorstellen op de juiste positie op de foto van de uiteindelijke positie van de vlieg.
Tel vervolgens het aantal vliegen tussen elk graad Celsius interval. Sluit eventuele vliegen op de wanden of op het plafond van het deksel uit. Bereken het percentage van de vliegen in elk temperatuurbereik van elke baan en vervolgens de gemiddelde voorkeurstemperatuur voor elke omstandigheid.
Verzamel gegevens uit ten minste vijf proeven. Gebru
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie identificeert een nieuwe circadiane output bij Drosophila, bekend als het temperatuurvoorkeursritme (TPR), dat varieert met het tijdstip van de dag. Het onderzoek verkent hoe TPR onafhankelijk van de locomotorische activiteit wordt gereguleerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Chronobiologie
- Gedragsbiologie
Achtergrond
- Het ritme van temperatuurvoorkeur (TPR) is een onlangs geïdentificeerde circadiaanse output.
- TPR vertoont een dagelijkse fluctuatie, waarbij deze overdag toeneemt en 's nachts afneemt.
- Inzicht in TPR kan leiden tot nieuwe kennis over circadiaanse regulatiemechanismen.
- TPR is verschillend van andere circadiaanse gedragingen, zoals locomotorische activiteit.
Doel van de studie
- Om de temperatuurvoorkeur van Drosophila te onderzoeken.
- Om het ontwerp en de methodologie voor het beoordelen van TPR te analyseren.
- Om de implicaties van TPR te verkennen in de context van circadiane ritmes.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de Drosophila en de experimentele apparatuur.
- Instellen van de temperatuuromstandigheden in een gecontroleerde omgeving.
- Plaatsen van de vliegen in de apparatuur voor de beoordeling van de temperatuurvoorkeur.
- Scoren van de temperatuurvoorkeur na een observatieperiode van een half uur.
Belangrijkste resultaten
- TPR werd succesvol gemeten en vertoonde duidelijke dagelijkse fluctuaties.
- De methode maakt het mogelijk om verschillende experimentele condities te testen.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van circadiane ritmes bij Drosophila.
- De bevindingen kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de circadiane biologie.
Conclusies
- TPR is een significante circadiane output die onafhankelijk van locomotorische activiteit functioneert.
- De ontwikkelde methodologie kan worden toegepast in verdere studies naar circadiane ritmes.
- Inzicht in TPR kan leiden tot bredere inzichten in circadiane regulatie bij andere organismen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Kwantitatieve analyse van temperatuurvoorkeursritmes (TPR) in Drosophila maakt mechanische risicoreductie van circadiane outputs mogelijk buiten de locomotorische activiteit, wat targetvalidatie in neurobiologische en chronobiologische pipelines ondersteunt. Deze gedragstest biedt voorspellend vertrouwen voor het ontleden van neurale circuits en moleculaire pathways die ten grond liggen aan de integratie van omgevingssignalen, wat direct bijdraagt aan vroege ontdekkings- en translationele onderzoeksstrategieën. De robuuste, reproduceerbare workflow positioneert TPR-analyse als een herbruikbare capaciteit voor cross-functionele R&D-teams die onderzoek doen naar sensorische integratie en circadiane regulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om verschillende circadiane outputs te onderzoeken voor functionele doelwitvalidatie in neurale en moleculaire pathways.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door mechanismen die TPR controleren te onderscheiden van mechanismen die de locomotorische activiteit reguleren.
- Vergemakkelijkt het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van nieuwe circadiane genen en circuits die relevant zijn voor ziektemodellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd gedragsmatig assay-systeem voor de kwantitatieve meting van temperatuurvoorkeur onder gecontroleerde omstandigheden.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid en standaardisatie van de assay over experimentele cohorten en omgevingsvariabelen heen.
- Maakt schaalbare screening mogelijk van genetische mutanten of farmacologische interventies die circadiane en sensorische pathways beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontwikkeling van translationele biomarkers door het modelleren van de ritmische regulatie van de lichaamstemperatuur bij ectothermen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van de functie van neurale circuits en de integratie van omgevingssignalen.
- Vermindert de risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische inzichten te verschaffen in sensorische en circadiane regulatie die relevant zijn voor mammalie-systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De TPR-assay is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot de ontwikkeling van preklinische modellen, waardoor hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking voor circadiane en sensorische targets mogelijk worden gemaakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van neurale circuits en moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan ritmes van temperatuurvoorkeur.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het vergelijken van genetische of omgevingsmanipulaties.
- Analytics: Biedt statistische metingen van distributies van voorkeurstemperaturen en circadiane faseverschuivingen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen van lichaamstemperatuurregulatie en sensorische integratie.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een robuust, aanpasbaar platform voor voortdurende targetvalidatie en mechanistische studies binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in circadian en sensorisch neurowetenschappelijk onderzoek.
- Operationele waarde: Standaardiseert gedragsfenotypering met schaalbare, reproduceerbare protocollen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een vroeg stadium van de pijplijn te verduidelijken.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en modellen mogelijk voor verdere ontwikkeling in neurobiologie- en chronobiologieportfolio's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in gedragsneurowetenschappen, chronobiologie en kwantitatieve data-analyse.
- Vereist nauwkeurige omgevingscontrole en instrumentatie voor temperatuur- en lichtregulatie.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor de opzet van de assay, gegevensverzameling en analyseprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse genetische achtergronden en experimentele manipulaties in Drosophila-modellen.
- Praktische beperkingen omvatten omgevingsgevoeligheid en de noodzaak van strikte replicatie van cohorten.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparing the Flies
2:35
Assembling the Temperature Preference Apparatus
4:06
Preparing the Apparatus
5:18
Running the Temperature Preference Assay
7:53
Circadian Rhythms and TrpA1 Affect Temperature Preference
8:35
Conclusion
6:55
Data Analysis
