Name: Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer een kwantitatieve methode om celmigratie te bestuderen in microfabricated kanalen met PDMS-chips. Deze techniek maakt precieze analyse van migratiesnelheid en gedrag van dendritische cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs sterk erkennen de PICT IBiSA platform Institut Curie (CNRS UMR144). Dit werk werd gefinancierd door subsidies van: de European Research Council om AM.LD (Strapacemi 243.103), de Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), de InnaBiosanté stichting (Micemico) naar MP en AM. LD en de ERC Strapacemi jonge onderzoeker subsidie ​​aan AM.LD.

Belangrijke opmerking: Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de mal met de vorm voor de gewenste microkanalen is al gemaakt. Nadere informatie over de voorbereiding van de mal is reeds gepubliceerd 10. Dit protocol wordt ook aangenomen dat het beenmerg DCs cultuur is bekend. 1. Chip Fabrication <ol><li> Meng PDMS olie en verharder in een gewichtsverhouding 10:01 in een plastic beker. Meng beide verbindingen grondig. </li><li> Wierp de mix over de mal lager microkanalen. De totale hoogte moet tussen 0.5-1 cm. </li><li> Verwijder luchtbellen in een vacuüm pot klok gedurende 1 uur. </li><li> Harden PDMS in de matrijs door het plaatsen daarvan in een oven gedurende 2 uur bij 65 ° C. </li><li> Zodra de PDMS is bij kamertemperatuur, snijd een groot stuk rond de constructie met een chirurgisch mes en afschilferen van de matrijs (figuur 1A). </li><li> Boor gaten waar de cellen worden geïnjecteerd (normaal 2 mm) en het formaat van de PDMSmet een chirurgisch mes om de grootte te passen aan glazen bodem gerechten waarin migratie zal worden beoordeeld (Figuur 1B). Voordat u verder gaat, verwijder reststof uit de schaal met behulp lensreinigingspapier. Dit bevordert de binding van PDMS aan glas in stap 1.10 beschreven. </li><li> Reinig de verkleind PDMS chip met de kanalen door steken en peeling plakband op de structuur zijkanten. </li><li> Ultrasone trillingen het PDMS stuks 30 sec in 70% ethanol aan stof en kleine PDMS deeltjes te verwijderen. Droog ze daarna snel door te blazen schone lucht. </li><li> Activeer de PDMS (structuren boven) en cultuur gerechten door de lucht (of zuurstof) plasma behandeling gedurende 30 seconden bij 300 mTorr. </li><li> Plaats beide geactiveerde oppervlakken in contact met het PDMS permanent kleven aan de ondergrond. Indien nodig, gebruik van metalen tang om iets druk op de top van de PDMS om het contact tussen het polymeer en het glas van de schotel (figuur 1C) te dwingen. </li><li> Incubeer de chip in de oven op 65 ° C for 1 uur de binding te versterken. </li></ol> 2. Coating van Microkanalen <ol><li> Activeer de hele structuur door de lucht plasma bij 300 mTorr gedurende 1 minuut. Hierdoor wordt de toegang van vloeistof in de kanalen bij de volgende stap te bevorderen. </li><li> Vul snel de vermelding gaten van de chip met fibronectine in 10 ug / ml in water. Andere substraten zoals PEG kunnen worden gebruikt om celhechting te passen aan de kanaalwanden. Let op dat de vloeistof zich verspreidt door de gehele structuur. Dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd op het oog onder normale licht of met een gewone helder veld microscoop. OPMERKING: In zeer kleine structuren, waarbij diffusie is moeilijker, ingang van de vloeistof in de kanalen kan worden gedwongen door het plaatsen van de structuur in een vacuüm pot klok gedurende ten minste 15 minuten. Om de efficiëntie van de bekleding fluorescerende substraten kunnen worden gebruikt (figuur 2) te verifiëren. </li><li> Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur om adsorptie van het fibronectine of andere bekleding subst toestaanpercentage op de wanden van de kanalen. </li><li> Was de structuren 3x met PBS om de niet-gebonden substraat te verwijderen. </li><li> Na het wassen, overgaan tot Protocol nr. 3 of bewaar de chip bij 4 ° C voor later gebruik (24 uur maximum). </li></ol> 3. Cel Laden <ol><li> Verwijder de PBS uit het bord en vul de microsysteem met mobiele medium. Laat incubeer gedurende 1 uur om de kanalen met het medium verzadigen. OPMERKING: Voor experimenten met drugs zoals moleculeinhibitors, is het aangeraden om de kanalen preincubate met een medium dat het geneesmiddel op de juiste concentratie. Bovendien zijn sommige medicijnen meestal oplosbaar in de PDMS structuur die de effectieve concentratie vermindert. Sommige oplossingen zijn voorgesteld om dit probleem tegen 11-12. </li><li> Verwijder drijvende DCs en herstellen semi-hechtende cellen door te spoelen met kweekmedium. Tellen cellen met een hemocytometer. OPMERKING: Voor kern beeldvorming, een Hoechst 33342 kleuring kan worden vooraf door bereiktcubating 2 x 10 6 cellen gedurende 30 min met de kleurstof bij 200 ng / ml in volledig medium. Was tweemaal door centrifugeren om overtollige kleurstof te verwijderen voordat u verder het protocol. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten (tijd en snelheid kan verschillen afhankelijk van het type cel) en het medium verwijderen. Verdun de pellet tot een concentratie van 20 x 10 6 cellen / ml bereiken. </li><li> Verwijder het overtollige van medium van de plaat en leeg de ingang gaten in het PDMS structuur met behulp van een micropipet. Vul de items met 5 pi cel oplossing voor een bedrag van 1 x 10 5 cellen in elk gat post bereiken. OPMERKING: hoge celdichtheid moet het contact van de cellen met de kanalen bevorderen. Lage celdichtheid slechts een laag aantal cellen binnen kanalen en falen van het experiment. </li><li> Incubeer de microchip gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de incubator. Voeg 2 ml compleet medium aan het experiment schotel. OPMERKING: De hele PDMS structuur moet be bedekt om uitdrogen van de cellen tijdens het experiment te vermijden. Als 2 ml niet genoeg is, voeg meer medium volledig te bedekken de PDMS structuur. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Maak de buitenkant onderkant van de gerechten met lensreinigingsdoekjes alvorens de platen onder de microscoop. </li><li> Om migratie in groot aantal cellen te analyseren, gebruiken 10x vergroting en breed veld verlichting in een CO 2 en temperatuur uitgerust video-microscoop (figuur 3). Om cell tracking vergemakkelijken kan Hoechst kleuring en UV-licht worden gebruikt (zie stap 3.2). Migratie kan ook geanalyseerd met behulp van confocale microscopie om de hogere resolutie van cellulaire structuren bij migratie. </li><li> Voor time-lapse microscopie bij 10X, kies een tijd frequentie volgens de verwachte cel snelheid (normaal 2 min voor dendritische cellen migreren met een snelheid van 5 micrometer / min). Opmerking: De hier beschreven protocol doet not omvat de analyse van de celmigratie parameters. Een paar punten zijn opgenomen in de discussie aan de lezers te adviseren over hoe verder te gaan om informatie uit time-lapse filmpjes. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een inrichting bestaande uit microkanalen als een methode om de trekkende eigenschappen van grote aantallen cellen in enkele experimenten bestuderen. Deze experimentele systeem bootst de beperkte milieu-eisen gevonden in weefsels door endogene migrerende cellen. Echter, door het forceren migratie in een dimensie, vergemakkelijkt automatisch cell tracking en winning van measurables (figuur 5). We tonen ook dat ons apparaat compatibel is met fluorescentie microscopie en derhalve worden...

Migratie is een complexe cellulaire functie is belangrijk voor veel fysiologische processen in multicellulaire organismen, zoals ontwikkeling, immuunresponsen en weefselregeneratie. Bovendien zijn bepaalde pathologische situaties zoals tumor invasie en metastase afhankelijk celmotiliteit 1. Daarom is celmigratie een belangrijke vakgebied in de context van zowel fundamenteel en translationeel onderzoek. In vivo, worden de meeste weefsels gekenmerkt door een rijke extracellulaire matrix en hoge celdichtheid. Celmigratie derhalve onder fysiologische omstandigheden treedt in complexe afgesloten omgeving. Klassiek, waarschijnlijk te wijten aan historische redenen en technische grenzen, cel migratie is onderzocht in platte 2D-systemen die niet veel van de milieu eigenschappen gevonden in weefsels, zoals opsluiting niet reproduceren. Bovendien factoren celadhesie, die essentieel zijn voor motiliteit in 2D zijn, zijn onlangs bleek niet noodzakelijkerwijs teRily vereist voor migratie in vivo of in gels, wat suggereert dat de mechanismen die cel motoriek regeren in 2D en in andere omgevingen zijn te onderscheiden 2. Verschillende systemen zijn ontwikkeld om de complexe eigenschappen van weefsels, de bekendste wezen collageen gels, die erop gericht indient de eigenschappen van de extracellulaire matrix samenstelling 3 nabootsen. Microchannels Hier stellen we als een eenvoudige aanvullende methode die de studie cel migratie in een dimensie maakt het mogelijk onder een afgesloten omgeving. In dit systeem migreren cellen langs microkanalen waarin ze binnenkomen spontaan. Migrerende cellen vervolgens te verwerven van de vorm van de kanalen, de aanneming van een buisvormige geometrie die het meest waarschijnlijk versterkt hun polariteit. De lineaire beweging van de cellen in de kanalen kan automatisch cell tracking en extractie van kwantitatieve parameters experimenten. Vanuit technisch oogpunt, dit systeem is eenvoudig en flexibel. De coating de kanaalwanden kan worden gemanipuleerd, de grootte en de vorm van de kanalen worden aangepast, en een groot aantal cellen in enkele experimenten worden geanalyseerd. Dit systeem kan ook worden opgeschaald tot middellange afstand zeefanalyse van moleculen betrokken bij celbeweeglijkheid voeren. De hier beschreven protocol is gestandaardiseerd op basis van dendritische cellen (DC) als een cellulair model. Deze cellen zijn essentieel voor het immuunsysteem zij deelnemen aan de initiatie en handhaving van specifieke immuunresponsen 4. In vitro is aangetoond DC spontaan migreren begrensde omgevingen en dus een goed model motiliteit van cellen te bestuderen in microkanalen 5,6 . Belangrijk, kan dit systeem worden uitgebreid tot migratie van andere beweeglijke celtype als T-lymfocyten, neutrofielen of tumorcellen 7-9 analyseren.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>GE Silicones</td><td>RTV615</td><td>Pakket van 90% siliconenbasis en 10% uithardingsmiddel</td></tr><tr><td>Kernmonsternemer</td><td>Ted Pella Int.</td><td>Harris Uni-Core</td><td>Diameter 2,5 mm</td></tr><tr><td>Schaal met glazen bodem</td><td>WPI</td><td>Fluorodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoonreiniger</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>Branson 200</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32 G</td><td>Voor kleine monsters (35 schalen). Er is ook een grotere versie beschikbaar</td></tr><tr><td>Fibronectine uit runderplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PolyLysine gegraft PEG (Pll-g-PEG)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

studie van cel-migratie in microfabricated kanalen

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

De hier beschreven methode maakt de studie van celmigratie onder opsluiting in een dimensie. Het is gebaseerd op het gebruik van microfabricated kanalen, die een gepolariseerde fenotype opleggen cellen door fysieke beperkingen. Eenmaal binnen kanalen, cellen hebben slechts twee mogelijkheden: vooruit of achteruit. Deze vereenvoudigde migratie waarbij gerichtheid beperkt vergemakkelijkt het automatisch volgen van cellen en de extractie van kwantitatieve parameters naar cel beweging te beschrijven. Deze parameters omvatten cel snelheid, veranderingen in richting en pauzes tijdens beweging. Microkanalen zijn ook compatibel met het gebruik van fluorescente merkers en zijn daarom geschikt voor lokalisatie van intracellulaire organellen en structuren bestudeerd worden celmigratie met hoge resolutie. Tenslotte kan het oppervlak van de kanalen worden gefunctionaliseerd met verschillende substraten, zodat de controle van de hechting van de kanalen of de studie van haptotaxis. Kortom, het stelsel here beschreven is bedoeld om de migratie van grote celaantallen analyseren omstandigheden waarin zowel de geometrie en de biochemische aard van de omgeving worden geregeld, de normalisatie en reproduceerbaarheid onafhankelijke experimenten vergemakkelijken.

In elk experiment het oppervlak van het PDMS is bedekt met een molecuul ingericht om het belang van de studie. Figuur 2 toont kanalen bekleed met een fluorescerend molecuul, PLL-g PEG, voor en na het wassen (stap 2.4). Een dergelijke proef kan de controle van de homogeniteit van de coating in de kanalen. Na cel laden, kan video microscopie worden uitgevoerd om celmigratie te volgen. Figuur 3A toont een voorbeeld van DC migreren in microkanalen met een dichth...

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het vervaardigen van microgefabriceerde kanalen om spontane beperkte celmigratie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de polymethyl-siloxane (PDMS)-chip te maken die de kanalen bevat. Als tweede stap worden de kanalen gecoat met fibronectine of een ander coatingsubstraat, wat de functionalisering van het apparaat mogelijk maakt.Na verschillende wasbeurten worden dendritische cellen in het microsysteem geladen om celmigratie te bestuderen. Op basis van microscopie en beeldanalyse worden resultaten verkregen die verschillen in snelheid tonen voor verschillende celtypen of behandelingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke 2D-migratie, is dat we de geometrie en de beperking van de cellen meenemen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de precisie die nodig is om elke stap correct uit te voeren. Meng PDMS-olie en harder in een plastic beker in een gewichtsverhouding van 10:1; meng beide componenten grondig en giet het mengsel over de mal met microkanalen. De totale hoogte moet tussen 0,5 en 1 cm liggen.Verwijder eventuele luchtbellen in een vacuümbellenglas gedurende één uur en laat vervolgens de PDMS in de mal uitharden door deze twee uur lang in een oven bij 65 °C te plaatsen. Nadat de PDMS is afgekoeld tot kamertemperatuur, snijdt u met een chirurgisch mes een groot stuk rondom de structuur en pelt u dit van de mal af. Boor vervolgens gaten op de plaatsen waar de cellen zullen worden geïnjecteerd en pas de grootte van de PDMS vervolgens aan met een chirurgisch mes zodat deze in glazen bodemschalen past waarin de migratie zal worden beoordeeld. Reinig.Sonicate de PDMS-stukken gedurende 30 seconden in 70% ethanol om stof en kleine PDMS-deeltjes te verwijderen voordat u verder gaat met de PDMS-chip die is aangepast in grootte door plakband op de zijkanten van de structuur te plakken en af te pellen. Verwijder resterend stof uit de schaal met lensreinigingspapier.Activeer de PDMS en de kweekschalen door middel van luchtplasmabehandeling gedurende 30 seconden bij 300 Milit en breng beide geactiveerde oppervlakken in contact om de PDMS, indien nodig, permanent aan het substraat te hechten. Gebruik een metalen pincet om licht op de PDMS te drukken om het contact tussen het polymeer en het glas van de schaal te forceren. Incubeer de chip in de oven bij 65 °C gedurende één uur.Om de binding te versterken, wordt de gehele structuur geactiveerd met luchtplasma bij 300 millitorr gedurende één minuut. Dit bevordert de instroom van vloeistof in de kanalen bij de volgende stap. Vul vervolgens de instroomopeningen van de chip snel met fibronectine met een concentratie van 10 micrograms per milliliter in water.Andere substraten, zoals polyethyleenglycol, kunnen worden gebruikt om de celadhesie aan de kanaalwanden te modificeren. Let erop dat de vloeistof zich over de gehele structuur verspreidt. Dit kan eenvoudig met het blote oog onder gewoon licht worden gecontroleerd, of met een conventionele lichtmicroscoop.Incubeer de structuur vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur om de absorptie van het fibronectine of een ander coating-substraat aan de wanden van de kanalen mogelijk te maken. Was tenslotte de structuren om het niet-gebonden substraat te verwijderen door alle vloeistof uit de kanalen en de schaal te verwijderen, voordat deze vijf minuten worden geweekt in verse fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Verwijder de PBS uit de plaat en vul het microsysteem met celmedium.Laat de plaat één uur incuberen om de kanalen te verzadigen met het medium om cellen te verzamelen voor beeldvorming. Verwijder zwevende dendritische cellen en win semi-adherente cellen terug door de plaat door te spoelen met cultuurmedium. Doe dit voordat de cellen worden geteld.Centrifugeer de cellen met een hemocytometer bij 300 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het medium. Verdun het pellet om een concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Verwijder het overtollige medium van de plaat en maak de instroomopeningen in de PDMS-structuur leeg.Gebruik een micropipet. Vul vervolgens de openingen met vijf microliters celoplossing om een hoeveelheid van 1 × 10⁵ cellen in elk openinggat te bereiken. Nadat de microchip 30 minuten bij 37 °C in de incubator is geïncubeerd, worden twee milliliters compleet medium aan de experimentele schaal toegevoegd voor beeldvorming.Reinig eerst het externe bodemoppervlak van de schaaltjes met lensreinigingsdoekjes voordat u de platen onder de microscoop plaatst. Om migratie in een groot aantal cellen te analyseren, gebruikt u een 10 x vergroting en breedveldverlichting in een videomicroscoop uitgerust met CO2- en temperatuurregeling om celtracking te vergemakkelijken. Hirsch-kleuring en UV-licht kunnen worden gebruikt, zoals besproken in het tekstprotocol voor time-lapse microscopie bij 10 x vergroting.Kies een tijdinterval op basis van de verwachte celsnelheid. Dit is doorgaans twee minuten voor dendritische cellen die migreren met een snelheid van vijf micron per minuut. In elk experiment wordt het oppervlak van de PDMS gecoat met een molecuul dat is aangepast aan het doel van de studie.In deze figuur zijn de kanalen bekleed met een fluorescent molecuul. Polylysine-geënt polyethyleenglycol vóór en na het wassen. Een dergelijk experiment maakt controle over de homogeniteit van de coating in de kanalen mogelijk; na het laden van cellen kan videomicroscopie worden uitgevoerd om de celmigratie te volgen.Hier is een voorbeeld van dendritische cellen die migreren in microkanalen met een dichtheid die geschikt is om de cellen te volgen. Zowel fasecontrast als hersch-kleuring kan hiervoor worden gebruikt. De techniek is ook compatibel met fluorescente confocale microscopie bij een hogere resolutie en kan worden gebruikt om organellen of cellulaire structuren te volgen, zoals getoond in de dynamiek van gepolymeriseerd actine in migrerende dendritische cellen die life act GFP tot expressie brengen.Hier wordt een voorbeeld getoond van de kwantificering van celmotiliteit geanalyseerd in migrerende dendritische cellen. De kracht gegenereerd door wild-type of met Y 27 632 dihydrochloride behandelde dendritische cellen laat zien dat het geneesmiddel een goed gekarakteriseerde remmer is van celcontractiliteit en migratie, en werd gebruikt om het vermogen van het systeem te verifiëren om veranderingen in snelheid te detecteren. De kog kan verder worden geanalyseerd om de positie en grootte van cellen als functie van de tijd te extraheren, waardoor verschillende parameters kunnen worden bestudeerd om celmigratie te beschrijven.De migratiesnelheid werd gevolgd door de positie van de nucleus vast te leggen met behulp van zelfontwikkelde software. Dendritische cellen hebben een gemiddelde snelheid van bijna zes micron per minuut. Behandeling met het geneesmiddel vermindert hun snelheid significant.Dit voorbeeld toont de kracht van de techniek, die de kwantificering van grote aantallen cellen in enkelvoudige experimenten mogelijk maakt, en het nut van het systeem om verschillen op te sporen die door medicatievehandelingen worden veroorzaakt. Zodra de hier gedemonstreerde techniek onder de knie is, kan deze in drie uur worden uitgevoerd indien deze na ontwikkeling correct wordt toegepast. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van migratie om cel-locomotie in gecontroleerde, beperkte omgevingen te bestuderen.

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een ​​meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Veel microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld voor gebruik in de studie van elektrotaxis. Toch laat geen van deze chips toe om de gelijktijdige chemische en elektrische veldeffecten (EF) op cellen efficiënt te bestuderen. We hebben een apparaat op basis van polymethylmethacrylaat ontwikkeld dat een beter gecontroleerde co-existentie van EF en chemische stimulatie biedt voor gebruik in elektrotaxis onderzoek.

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

De controle van chemische en zuurstofgradienten is essentieel voor celculturen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch apparaat van polydimethylsiloxaan-polycarbonaat (PDMS-PC) dat in staat is om op betrouwbare wijze combinaties van chemische en zuurstofgradienten te genereren voor celmigratiestudies, die praktisch kunnen worden gebruikt in biologische laboratoria zonder geavanceerde instrumentatie.

Polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdische apparaten voor mobiele Migration Studies Onder Perpendicular Chemical en zuurstof verlopen

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Een protocol voor de kwantitatieve evaluatie van 3D-celmigratie binnen en in het grensvlak van granulaire hydrogels wordt hier gepresenteerd.

Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

Leer een kwantitatieve methode om celmigratie te bestuderen in microfabricated kanalen met PDMS-chips. Deze techniek maakt precieze analyse van migratiesnelheid en gedrag van dendritische cellen mogelijk.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Meer video's verkennen